혈관 관혈 -고정을 가진 뮤린 폐의 공기 인플레이션

요약

제시는 구조 기능 분석을 위한 기도, 폐포 및 간질 내세포의 위치를 보존하는 폐의 혈관 관류 고정을 가진 공기 인플레이션을 위한 방법입니다. 지속적인 기도 압력은 공기 인플레이션 챔버로 유지되며 고정은 오른쪽 심실을 통해 퍼프됩니다. 폐는 히스토로지학 연구를 위해 처리됩니다.

초록

폐 조직학은 폐 항상성 및 질병 병인 동안 영공 세포에 의해 제공된 기여를 조사하기 위하여 수시로 이용됩니다. 그러나, 일반적으로 사용되는 주입 기반 고정 방법은 영공 세포와 점액을 말기 항공으로 대체할 수 있으며 조직 형태를 변경할 수 있습니다. 이에 비해 혈관 관류 고정 기술은 영공 및 점막 안대기 내의 세포의 위치와 형태를 보존하는 데 탁월합니다. 그러나, 양수기도 압력이 동시에 적용되지 않으면 폐의 영역이 붕괴될 수 있으며 모세혈관이 폐포 공간으로 팽창하여 폐 해부학의 왜곡으로 이어질 수 있다. 본명, 하류 조직학 연구를 위한 뮤린 폐내기도 및 폐포 세포 및 간질의 형태와 위치를 보존하기 위해 혈관 관류 고정 시 공기 인플레이션에 대한 저렴한 방법을 설명합니다. 일정한 기압은 고정이 오른쪽 심실을 통해 침투되는 동안 조절 가능한 액체 컬럼을 통해 압력을 유지하는 밀봉된 공기 채워진 챔버에서 기관을 통해 폐로 전달됩니다.

서문

폐 공증은 건강과 질병 동안 폐 건축을 평가하기위한 금 본위제이며 폐 연구자^1에의해 가장 일반적으로 사용되는 도구 중 하나입니다. 이 기술의 가장 중요한 양상 중 하나는 폐 조직의 적절한 격리 및 보존이며,이 단계의 가변성은 조직 품질 저하 및 잘못된 결과^1,2,3로이어질 수 있기 때문이다. 살아있는 동물에서 폐 부피는 표면 장력에 의해 흉벽과 횡격막에서 전염되는 폐의 내탄 반동과 외부 력 사이의 균형에 의해 결정됩니다. 따라서 흉부에 들어가면 바깥쪽 힘이 손실되고 폐가 붕괴됩니다. 붕괴된 폐에서 제조된 히스토로지학적 섹션은 해부학 구획(즉, 영공, 혈관 및 간질)의 경계가 혼잡하여 구별하기 어려울 수 있다. 이 도전을 우회하기 위하여는, 연구원은 수시로 영공 규모 및 건축이 유지되도록 화학 고정 도중 폐를 팽창합니다.

폐는 공기 또는 액체로 팽창할 수 있습니다. 폐를 동일한 부피로 팽창시키는 데 필요한 압력은 공기-액체 인터페이스의 분자 간 힘으로 인해 공기 및 액체 인플레이션 간에 다릅니다. 표면 장력을 극복하고 붕괴된^폐포4를열기 위해서는 액체 인플레이션(예를 들어, 12cmH 2O)보다 공기 인플레이션 시 고압(예를 들어, 25cmH_2O)이필요합니다. 폐포를 모집하면, 낮은 압력은 압력 볼륨 곡선 고원과 동일한 부피로 폐포를 열어 둘 수 있으며, 압력은 파스칼의 법칙^4,5,6,7,8에따라 폐 전체에 걸쳐 균등화될 수 있다.

폐 인플레이션과 고정의 두 가지 주요 방법은 히스토로지에 대한 뮤린 폐를 보존하기 위해 존재한다. 가장 일반적으로, 영공은 액체로 주입됩니다 - 종종 고정을 포함. 이 방법의 주요 장점은 상대적으로 쉽고 약간의 교육이 필요하다는 것입니다. 고정제의 내내 주입은 혈관에 초점을 맞추는 연구에서 선호될 수 있지만, 기관지를 통해 주입되는 액체는 근위기도 세포와 뮤신을 더 많은 실기 영공 영역으로 밀어 넣는 경향이 있는 반면, 공기 인플레이션은^{1,3,4,9,10,11을}하지 않는다. 더욱이, 액체 인플레이션 시 상피로부터 백혈구의 부주의하게 분리하면 형태가 변하고, 관절학적으로 단순하고 둥근^{외관4,10,11,12를}준다. 마지막으로, 액체를 가진 폐의 인플레이션은 의도하지 않게 중간^4,10,11을압축할 수 있다. 함께, 이러한 요인은 보존 된 폐 내에서 정상적인 해부학 및 세포 분포를 왜곡 할 수 있습니다, 따라서 기술을 제한.

조직 보존의 다른 방법은 혈관 관류 고정입니다. 이 방법에서, 고정은 정맥 카바 또는 오른쪽 심실을 통해 폐 혈관으로 침투된다. 이 방법은 영공 루멘에서 세포의 위치와 형태를 보존합니다. 그러나 관류 고정 중에 폐가 팽창하지 않는 한 폐 조직이 붕괴 될 가능성이 있습니다.

혈관 관류 고정을 가진 공기 인플레이션은 위의 각 고정 기술의 강점을 활용합니다. 본원에 우리는이 기술에 대한 프로토콜을 제공합니다. 필요한 재료와 장비는 상대적으로 저렴하며 쉽게 얻을 수 있고 조립할 수 있습니다. 도 1A에표시된 완성된 설정은 조절 가능한 유체 채워진 컬럼을 통해 폐에 일정한 기도 압력을 제공하며, 연동 펌프는 오른쪽 심실을 통해 고정을 제공합니다. 보존된 형태학을 가진 폐는 구조물 기능 분석을 위해 추가처리될 수 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜에 설명된 모든 방법은 국립 유태인 건강의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

참고: 프로토콜은 세 가지 구성 요소로 구성됩니다. 첫 번째 구성 요소는 관류/고정 장비로 공기 인플레이션의 건설을 자세히 설명합니다. 두 번째 섹션에서는 실험을 위해 장비를 설정하는 방법에 대해 설명합니다. 마지막 섹션에서는 동물을 준비하고 실험을 수행하는 방법을 설명합니다.

1. 물 기둥 장치의 건설(도 1B)

1. 60mL 슬립 팁 주사기에서 플런저를 제거합니다.
2. 30mL 마크에 주사기 주위에 테이프를 부착합니다. 주사기의 높이를 25cmH_2O의초기 인플레이션 압력에 대해 이 마크로 설정합니다. 또한 전체 절차에 걸쳐 컬럼의 수위가 있어야 하는 곳이기도 합니다. 테이프를 "그림 1A에묘사된 대로) 또는 "인플레이션"으로 레이블을 지정합니다.
   참고: 붕괴된 영공의 모집을 보장하기 위해 25cmH_2O의인플레이션 압력이 사용됩니다. 폐포를 모집하면 공기 공간이 저하되지 않도록 압력이 20cmH₂O로 낮아집니다.
3. 테이프에서 플런저 끝으로 5cm를 측정하고 다른 테이프를 주사기에 부착합니다. 주사기를 이 마크로 아래로 이동하여 고정 시 인플레이션 압력을 20cmH_2O로낮춥춥니까. 테이프를 "그림 1A에묘사된 대로) 또는 "고정"으로 레이블을 지정합니다.
4. 주사기의 슬립 팁 끝에 180개의 폴리염화비닐(PVC) 튜브를 부착합니다. 튜브의 길이는 주사기와 공기 인플레이션 챔버 (약 25-30cm) 사이의 거리에 따라 달라집니다.
5. 수컷 루어(2) 실 스타일 티셔츠(길이 1.219인치, 높이 0.904인치, 내부 직경 0.0904인치)를 튜빙의 다른 쪽 끝에 놓습니다. 이 남성 루어는 공기 인플레이션 챔버 (단계 2.4)의 스톱콕에 연결됩니다.

2. 공기 인플레이션 챔버의 건설(그림 1C)

1. 스크류 온 캡이 있는 500mL 플라스틱 용기에 두 개의 구멍(직경 약 4mm)을 드릴링합니다. 구멍은 여성 Luers (1.224 인치 길이, 0.312 인치 높이, 0.098 인치 내경)과 동일한 크기여야합니다.
   참고: 빈 미디어 또는 버퍼 컨테이너는 공기 인플레이션 챔버에 사용할 수 있습니다.
2. 실리콘 개스킷 메이커와 여성 Luers의 스레드를 코팅하고 용기의 사전 드릴 구멍에 작은 측면을 배치합니다.
3. 여성 루어스 주변에 실리콘 개스킷 제조업체를 추가하여 용기에 들어가 밀폐 씰을 보장합니다.
4. 공중 인플레이션 챔버에 낮은 여성 루어에 편도 스톱콕에 나사.
5. 약 25cm의 길이로 튜브를 자르고 튜브의 자유 끝에 남성 루어를 부착하십시오. 튜브의 한쪽 끝에 있는 수컷 루어를 공중 인플레이션 챔버의 무료 여성 루어와 연결합니다. 다른 수컷 루어는 동물 가공 용기에 연결합니다.

3. 동물 가공 용기의 건설(도 1D)

1. 큰 플라스틱 용기의 측면에 구멍 (약 4mm 직경)을 드릴. 구멍은 여성 루어의 직경이어야한다. 과도한 고정 솔루션을 잡기 위해 플라스틱 용기가 필요합니다.
   참고 : 30cm x 22cm, 3.8 L 플라스틱 저장 용기가 사용되었습니다.
2. 실리콘 개스킷 메이커와 여성 루어의 실을 코팅하고 용기의 사전 드릴 구멍에 작은 측면을 배치합니다.
3. 실리콘 개스킷 메이커를 여성 루어 주변에 추가하여 용기에 들어가서 밀폐 씰을 보장합니다.
4. 여성 루어에 편도 스톱콕을 나사. 공기 인플레이션 챔버에서 튜브이 스톱콕에 부착됩니다.

4. 솔루션 준비

1. 헤파린 솔루션
   1. 칼슘이 없는 PBS와 헤파린(U/mL 20)으로 용기를 채우게 합니다. 각 마우스에 대해 총 10mL 헤파린 용액을 준비합니다. 헤파린은 관류 고정 시 혈관에서 혈전이 형성되는 것을 방지하는 항응고제입니다. 헤파린 용액은 관류 고정 전에 폐에서 혈액을 플러시하는 데 사용됩니다.
2. 고정 솔루션
   주의: 고착제는 건강상의 위험을 초래할 수 있으며 화학 연기 후드에 사용해야 합니다. 모든 장치는 고체 흡입을 방지하기 위해 화학 연기 후드에 설치됩니다.
   1. 칼슘이 없는 PBS와 파라포름알데히드(최종 농도 4%)로 용기를 채우게 합니다. 각 마우스에 대해 총 50mL 고정 솔루션을 준비합니다.
      참고: 사용되는 고정 의 유형은 다를 수 있으며 다운스트림 히스토릭 연구에 따라 달라집니다.

5.   관류 장치 준비

참고: 연동 펌프는 일정한 유량을 보장하기 위해 체액을 혈관으로 전달하는 것이 좋습니다. 다음 방향은 연동 펌프를 설정하기 위한 것이며 각 모델에 대해 다를 수 있습니다. 대안적으로, 연동 펌프를 사용할 수 없는 경우, 제2 수열 장치는 35cm H_2O의높이로부터 유체를 퍼퓨즈하도록 구성될 수 있다.

1. 먼저 롤러 어셈블리 주위에 튜브를 배치합니다.
2. 노치 된 게시물에 튜브를 고정합니다.
3. 먼저 왼쪽 레버를 튜브 주위에 놓고 상단과 오른쪽 레버로 제자리에 고정하여 레버를 제자리에 고정시하십시오.
4. 튜브의 근접 끝을 헤파린 용액에 넣고 말단끝을 동물 가공 용기에 넣습니다.
5. 튜브에서 공기를 배출하기 위해 펌프를 실행하여 튜브에 헤파린 솔루션을 사전로드합니다.
6. 튜브의 왼쪽 끝에 25G x 5/8" 바늘을 고정합니다.

6. 공기 인플레이션 장치 준비

1. 물 기둥의 주사기를 링 홀더에 넣습니다.
2. 동물 플랫폼에서 물 기둥의 "25cm" 테이프 마크(1.2단계)까지 수직 높이를 측정합니다.
3. 공기 챔버의 스톱콕에 물 기둥튜브의 끝을 부착합니다.
4. 공기 실의 암컷 루어에서 튜브를 동물 가공 용기의 스톱콕에 부착합니다.
   참고: 도 1C에묘사된 바와 같이 공기 인플레이션 챔버가 건설되는 경우, 튜브를 역순으로 부착하면 기관 캐뉼라에 연결되는 튜브에 물이 누출될 수 있습니다.
5. 에어 챔버에 대한 캡이 단단히 닫혀 있는지 확인합니다.
6. 동물 가공 용기 의 외부의 스톱콕이 닫혀 있는지 확인하고 물 기둥에서 공기 인플레이션 챔버로 이어지는 튜브의 스톱콕이 열려 있는지 확인합니다.
7. 주사기를 물로 채우면 "25cm" 마크에 가보됩니다. 물은 주사기를 통해 튜브를 통해 공중 챔버로 남깁니다. 압력이 균등화되면 물이 흐르는 것을 중지합니다.
   1. 화학 후드 내의 주변 기압이 변동함에 따라 물이 공기 인플레이션 챔버로 서서히 누출 될 수 있습니다. 주사기 내의 수위를 주시하고 필요한 경우 더 추가하십시오. 시술 내내 "25cm" 마크로 수위를 유지합니다.
      참고: 일반적으로 수위는 25cmH₂O에서 공기 인플레이션의 첫 번째 부분에 대해 일관되게 유지됩니다. 그러나 고정 하는 동안 주사기에 더 많은 물을 추가 해야 합니다. 물이 흐르는 것을 멈추지 않으면 공기 인플레이션 챔버 내에 공기 누출이 있을 가능성이 높습니다. 공기 누출을 방지하기 위해 Luers 주변에 더 많은 실리콘 개스킷 제조업체를 적용해야 할 수 있습니다.

7. 동물의 준비(그림 2)

참고 : 이 절차는 게이지 외^13에서수정되었습니다. 우리는 다양한 연령대의 성인 남성과 여성 마우스에이 절차를 완료하고 나이 또는 성 편견을 주의하지 않습니다.

1. 펜토바르비탈 나트륨(150 mg/kg, 인내)으로 동물을 안락사시합니다. 해부를 시작하기 전에 동물이 죽는지 확인하십시오.
   참고 : 이 절차는 안락사 동물에 수행되지만,이 절차는 동물 전체에 퍼듀스를 펌핑하는 심장을 활용하기 위해 살아있는 동물에서 수행 할 수 있습니다.
2. 복 벽을 통해 두 개의 측면 절개를 합니다. 갈비뼈 아래와 엉덩이 위의 두 번째 절개를 합니다. 중위절개에서 우수한 절개를 향해 잘라냅니다.
3. 무딘 가위를 사용하여 다이어프램의 측면으로 절개를 하십시오. 다이어프램이 뚫리자마자 폐가 무너져야 합니다.
   참고: 폐에 구멍을 뚫지 않도록 주의를 기울여야 합니다. 구멍이 뚫린 폐는 나중에 단계 도중 팽창하기 위하여 확률이 낮습니다.
4. 흉부 구멍을 열기 위해 횡격막을 따라 가로를 잘라.
5. 심골의 흉골을 따라 경정맥에서 경정맥으로, 그리고 흉곽 위에 측면으로 잘라 서 심장과 폐를 완전히 노출시합니다. 흉곽의 측면을 고정합니다.
6. 기관 위의 목에 중간 절개를 합니다. 기관을 둘러싼 피부, 근육, 갑상선 및 결합 조직을 제거합니다.
7. 구부러진 집게를 사용하여 후부 기관 아래에 두 조각의 실이나 봉합사를 밀어 넣습니다. 한 조각의 봉합사를 사용하여 인플레이션 Luer-stub 어댑터를 제자리에 고정하고, 다른 하나는 궁극적으로 공기 인플레이션과 혈관 관류 고정의 결론에 기관지를 묶는데 사용합니다.
8. 18G x 1" 바늘 또는 반나스 스프링 가위를 사용하여 기관지에 작은 구멍을 찌르면 됩니다.
9. 20G 루어 스텁 어댑터를 기관지의 이 구멍에 놓습니다.
10. 기관 주위에 하나의 스레드를 즉시 루어 스텁 어댑터가 제자리에 고정하기 위해 들어가는 곳에 묶습니다.
11. 동물을 동물 가공 용기로 옮기.
12. 동물 가공 용기 의 내부에 있는 암컷 루어에 Luer-stub 어댑터를 부착합니다.

8. 공기 인플레이션, 관류 및 폐 고정(그림 2)

1. 관혈 장치에 부착된 25G x 5/8" 바늘을 심장의 오른쪽 심실로 놓습니다.
2. 복부 대어를 잘라 혈액이 심장에서 배출하고 폐를 통해 perfusate의 흐름을 촉진 할 수 있습니다.
3. 동물 가공 용기 의 외부에 스톱콕을 열어 폐를 팽창시다.
   참고: 폐가 완전히 팽창하는 데 시간이 걸릴 수 있습니다. 주사기의 수위를 보고 폐에 누출이 없는 한 급격히 감소해서는 안 됩니다.
4. 폐를 25cmH₂OO에서 5분간 팽창시다. 25cmH_2O에서의인플레이션은 폐를 전제조건으로 하고, 기질성 폐 지역 모집에 도움을 주어 한다.
   참고: 25cm 높이를 유지하기 위해 소량의 물을 주사기에 첨가해야 할 수도 있습니다. 염증 및/또는 실험적으로 유발된 폐 손상은 폐의 인플레이션에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 경우, 인플레이션 압력을 최대 35cmH₂O까지 늘려 기원지역 모집을 지원할 필요가 있을 수 있습니다.
5. 폐 인플레이션의 마지막 순간 동안 연골 펌프를 10mL/min의 유량으로 켭니다. 헤파린 용액은 병에서 튜브를 통해 동물로 흘러 들어와야 합니다.
   1. 헤파린 주입의 목표는 혈관에 있는 혈전의 형성을 방지하는 것입니다. 따라서 폐가 하얗게 되고 혈액이 없는 때까지 헤파린을 주입하십시오. 폐가 하얗게 변하지 않으면 오른쪽 심실 바늘의 조정이 필요할 수 있습니다.
6. 5분 동안 팽창한 후 연동 펌프를 끄고 헤파린 용액에서 고정으로 관류 튜브를 전환합니다.
7. 물 기둥 주사기를 "20cm" 마크(1.3단계)로 낮춥니다. 기포가 25에서 20cmH_2O로변함에 따라 기포가 물 기둥 내에서 이동하는 것은 정상입니다.
   1. 주사기의 수위를 확인하십시오. 그것은 "25cm"마크에 있어야합니다. 이 시간에 더 많은 것을 추가해야 할 수도 있습니다.
8. 폐가 25cmH2O로 수축할 수 있도록 1분 기다립니다.
9. 6.5mL/min의 유속도로 관류 펌프를 다시 시작합니다.
10. 혈관 관류 는 10 - 15 분 동안 수정합니다.

9. 폐 의 추출(그림 3)

1. 두 번째 실을 기관 주위의 실을 Luer-stub 어댑터에 단단히 묶습니다. 기관에서 루어 스텁 어댑터를 제거합니다.
2. 심장에서 바늘을 제거합니다.
3. 무딘 가위로 결합 조직 후방을 중질로 절단하여 흉부 구멍에서 폐와 심장을 해방시. 폐에 구멍을 뚫지 않도록 주의하십시오.
4. 조심스럽게 폐에서 심장을 제거합니다.
5. 하룻밤 동안 폐를 고정에 놓습니다.
   참고: 고정 의 기간은 다운스트림 히스토릭 연구에 따라 달라집니다.
   1. 폐를 20-25mL의 고정튜브를 포함하는 50mL 원문 관에 넣습니다. 원추형 튜브의 개구부를 통해 기관지 확보를 위한 실을 배치하고 캡의 실에 의해 고정합니다. 원추형 튜브를 반전하여 부력, 공기 팽창 폐가 고정물에 완전히 침수되어 있는지 확인하십시오.
6. 연속학 연구를 위해 폐를 처리합니다.

결과

그대로 흉부에서 폐는 흉막 공간을 통해 흉벽에 의해 적용된 바깥쪽 힘에 의해 개방된다^6,14. 해부 중에 다이어프램이 입력되면 흉막 공간의 무결성이 폐지되고 폐가 붕괴되어야합니다(그림 2A,2B). 폐를 다시 확장하기 위해 공기 인플레이션이 수행됩니다. 첫 번째 단계로, 붕괴 된 영공의 모집을 보장하기 위해 25cm의 수...

토론

일반적으로 사용되지만, 장내 기반 고정 방법은 기도에서 백혈구를 대체하고 정상적인 폐 아키텍처를 변경할 수 있습니다. 이 프로토콜에 제공되는 혈관 관류 고정을 가진 공기 인플레이션 방법은 이러한 함정을 극복하고 폐 해부학을 보다 정확하게 보존합니다. 혈관 관류 고정 방법에서 고품질 조직을 얻는 열쇠는 공기 인플레이션 압력의 주의 깊은 모니터링, 공기 누출 의 회피, 혈관에 고정의 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer	Cole-Parmer	Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF	Stopcock
BD 60 mL syringe, slip tip	BD	309654	Syringe used to construct the water column
BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8	BD Biosciences	305122	Needle for vascular perfusion/fixation
Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer	Nordson Medical	FTLLBMLRL-1	Female Luer
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3393	Heparin solution.
Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge	BD Biosciences	427564	Luer-Stub Adapter
Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee	Nordson Medical	LT787-9	Male Luer
Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing	ThermoFisher Scientific	8000-9020	Tubing
Paraformaldehyde Aqueous Solution - 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline
Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker	Permatex	81724	Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers
Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium	Corning	21-040-CV	Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions
Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container	Sterilite	0342	Animal processing container