Air-Gonflage des poumons murins avec perfusion vasculaire-Fixation

Résumé

Présenté est une méthode de gonflage de l’air avec perfusion vasculaire-fixation des poumons qui préserve l’emplacement des cellules dans les voies respiratoires, les alvéoles et l’interstitium pour les analyses structure-fonction. La pression constante des voies respiratoires est maintenue avec une chambre de gonflage de l’air tandis que le fixateur est perfusé via le ventricule droit. Les poumons sont traités pour des études histologiques.

Résumé

L’histologie pulmonaire est souvent utilisée pour étudier les contributions fournies par les cellules de l’espace aérien au cours de l’homéostasie pulmonaire et de la pathogenèse de la maladie. Cependant, les méthodes de fixation basées sur l’instillation couramment utilisées peuvent déplacer les cellules de l’espace aérien et le mucus dans les voies respiratoires terminales et peuvent modifier la morphologie des tissus. En comparaison, les techniques de perfusion-fixation vasculaire sont supérieures pour préserver l’emplacement et la morphologie des cellules dans les espaces aériens et la muqueuse. Cependant, si la pression positive des voies respiratoires n’est pas appliquée simultanément, des régions des poumons peuvent s’effondrer et les capillaires peuvent gonfler dans les espaces alvéolaires, entraînant une distorsion de l’anatomie pulmonaire. Ici, nous décrivons une méthode peu coûteuse de gonflage de l’air pendant la perfusion vasculaire-fixation afin de préserver la morphologie et l’emplacement des cellules alvéolaires et de l’interstitium dans les poumons murins pour les études histologiques en aval. Une pression d’air constante est délivrée aux poumons via la trachée à partir d’une chambre scellée remplie d’air qui maintient la pression via une colonne de liquide réglable tandis que le fixateur est perfusé à travers le ventricule droit.

Introduction

L’histologie pulmonaire représente l’étalon-or pour évaluer l’architecture pulmonaire pendant la santé et la maladie et est l’un des outils les plus couramment utilisés par les chercheurs en^{pneumologie 1}. L’un des aspects les plus critiques de cette technique est l’isolement et la préservation appropriés du tissu pulmonaire, car la variabilité de cette étape peut entraîner une mauvaise qualité des tissus et des résultats erronés^1,2,3. Chez les animaux vivants, le volume pulmonaire est déterminé par l’équilibre entre le recul élastique vers l’intérieur du poumon et les forces extérieures transmises par la paroi thoracique et le diaphragme par la tension superficielle. En conséquence, lorsque le thorax est entré, les forces extérieures sont perdues et le poumon s’effondre. Les sections histologiques préparées à partir de poumons effondrés ont une apparence encombrée et les limites entre les compartiments anatomiques (c.-à-d. les espaces aériens, les vascularisations et l’interstitium) peuvent être difficiles à distinguer. Pour contourner ce défi, les chercheurs gonflent souvent les poumons pendant la fixation chimique afin de maintenir la taille et l’architecture de l’espace aérien.

Les poumons peuvent être gonflés avec de l’air ou du liquide. La pression nécessaire pour gonfler les poumons au même volume diffère entre le gonflage de l’air et celui du liquide en raison des forces intermoléculaires à l’interface air-liquide. Une pression plus élevée (p. ex., 25 cmH₂O) est nécessaire pendant le gonflage à l’air que le gonflage liquide (p. ex., 12 cmH₂O) pour surmonter la tension superficielle et ouvrir les alvéoles effondrées⁴. Une fois les alvéoles recrutées, une pression plus faible peut maintenir les alvéoles ouvertes au même volume que les plateaux de la courbe pression-volume, et les pressions s’égalisent dans tout le poumon selon la loi de Pascal^4,5,6,7,8.

Deux méthodes principales d’inflation et de fixation pulmonaires existent pour préserver les poumons murins pour l’histologie. Le plus souvent, les espaces aériens sont instillés avec du liquide - contenant souvent un fixateur. Le principal avantage de cette approche est qu’elle est relativement facile et nécessite peu de formation. Alors que l’instillation intratrachéale de fixateur peut être préférée dans les études qui se concentrent sur le système vasculaire, le liquide qui est instillé par la trachée a tendance à pousser les cellules des voies respiratoires proximales et les mucines dans des régions d’espace aérien plus distales tandis que l’inflation de l’air n’a pas^1,3,4,^9,10,11. De plus, le détachement accidentel des leucocytes de l’épithélium lors de l’inflation liquide modifie leur morphologie, leur donnant de manière artéfactuelle un aspect simple et arrondi^4,10,11,12. Enfin, le gonflage des poumons avec du liquide peut involontairement comprimer l’interstitium^4,10,11. Ensemble, ces facteurs peuvent déformer l’anatomie normale et les distributions cellulaires dans les poumons préservés, limitant ainsi la technique.

Une autre méthode de préservation des tissus est la perfusion vasculaire-fixation. Dans cette méthode, le fixateur est perfusé dans le système vasculaire pulmonaire via la veine cave ou le ventricule droit. Cette méthode préserve l’emplacement et la morphologie des cellules dans la lumière de l’espace aérien. Cependant, à moins que les poumons ne soient gonflés pendant la perfusion-fixation, le tissu pulmonaire est susceptible de s’effondrer.

Le gonflage de l’air avec perfusion vasculaire-fixation exploite les forces de chacune des techniques de fixation ci-dessus. Ici, nous fournissons un protocole pour cette technique. Les matériaux et l’équipement requis sont relativement peu coûteux et peuvent être facilement obtenus et assemblés. La configuration terminée, illustrée à la figure 1A,fournit une pression constante des voies respiratoires aux poumons au moyen d’une colonne réglable remplie de liquide tandis qu’une pompe péristaltique fournit un fixateur via le ventricule droit. Les poumons à morphologie préservée peuvent ensuite être traités pour des analyses structure-fonction.

Protocole

Toutes les méthodes décrites dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de National Jewish Health.

REMARQUE : Le protocole est organisé en trois composants. Le premier composant détaille la construction du gonflage de l’air avec un équipement de perfusion/fixation. Une deuxième section décrit comment configurer l’équipement pour une expérience. La dernière section décrit comment préparer l’animal et effectuer l’expérience.

1. Construction de l’appareil à colonne d’eau (Figure 1B)

1. Retirez le piston d’une seringue à embout glissant de 60 mL.
2. Fixez du ruban adhésif autour de la seringue à la marque de 30 mL. Réglez la hauteur de la seringue sur cette marque pour la pression de gonflage initiale de 25 cmH₂O. C’est également là que le niveau d’eau dans la colonne doit être tout au long de la procédure. Étiquetez la bande comme « 25 cm » (comme illustré à la figure 1A)ou « gonflage ».
   NOTE: Une pression de gonflage de 25 cmH₂O est utilisée pour assurer le recrutement des espaces aériens effondrés. Une fois les alvéoles recrutées, la pression est abaissée à 20 cmH₂O pour s’assurer que les espaces aériens ne sont pas distendus.
3. Mesurez 5 cm du ruban adhésif vers l’extrémité du piston et fixez un autre morceau de ruban adhésif à la seringue. Déplacez la seringue jusqu’à cette marque pour abaisser la pression de gonflage à 20 cmH₂O pendant la fixation. Étiquetez le ruban comme « 20 cm » (comme illustré à la figure 1A)ou « fixation ».
4. Fixez 180 tubes en polychlorure de vinyle (PVC) à l’extrémité de la seringue. La longueur du tube dépend de la distance entre la seringue et la chambre de gonflage de l’air (environ 25-30 cm).
5. Placez un tee mâle de style Luer (2) filetage (1,219 pouce de longueur, 0,904 pouce de hauteur, 0,0904 pouce de diamètre intérieur) à l’autre extrémité du tube. Ce Luer mâle se connectera au robinet d’arrêt de la chambre de gonflage de l’air (étape 2.4).

2. Construction de la chambre de gonflage de l’air (Figure 1C)

1. Percez deux trous (environ 4 mm de diamètre) dans un récipient en plastique de 500 mL avec un bouchon vissé. Les trous doivent être de la même taille que la luers femelle (1,224 pouce de longueur, 0,312 pouce de hauteur, 0,098 pouce de diamètre intérieur).
   REMARQUE: Des supports vides ou des conteneurs tampons peuvent être utilisés pour la chambre de gonflage de l’air.
2. Enduire les fils de Luers femelles avec un fabricant de joints en silicone et placer le plus petit côté dans les trous pré-percés du récipient.
3. Ajoutez un joint en silicone autour des Luers femelles à l’endroit où elles pénètrent dans le récipient pour assurer une étanchéité à l’air.
4. Vissez un robinet d’arrêt unidirections sur le Luer femelle inférieur de la chambre de gonflage à air.
5. Coupez le tube à la longueur d’environ 25 cm et attachez les Luers mâles aux extrémités libres du tube. Connectez le Luer mâle à une extrémité du tube au Luer femelle libre sur la chambre de gonflage de l’air. L’autre mâle Luer se connectera au conteneur de traitement des animaux.

3. Construction du conteneur de transformation animale (Figure 1D)

1. Percez un trou (environ 4 mm de diamètre) sur le côté d’un grand récipient en plastique. Le trou doit être le diamètre de la femelle Luer. Le récipient en plastique est nécessaire pour attraper l’excès de solution de fixation.
   REMARQUE: Un conteneur de stockage en plastique de 30 cm x 22 cm et 3,8 L a été utilisé.
2. Enduisez les fils d’une femelle Luer avec un fabricant de joints en silicone et placez le plus petit côté dans le trou prépercé du récipient.
3. Ajoutez un joint en silicone autour de la femelle Luer où il entre et sort du récipient pour assurer une étanchéité à l’air.
4. Vissez un robinet d’arrêt à sens unique sur la femelle Luer. Le tube de la chambre de gonflage de l’air se fixera à ce robinet d’arrêt.

4. Préparation des solutions

1. Solution d’héparine
   1. Remplissez un récipient avec du PBS sans calcium et de l’héparine (20 U/mL). Préparer une solution totale d’héparine de 10 mL pour chaque souris. L’héparine est un anticoagulant qui empêche la formation de caillots sanguins dans les vaisseaux pendant la perfusion-fixation. La solution d’héparine sera utilisée pour rincer le sang des poumons avant la fixation par perfusion.
2. Solution fixative
   ATTENTION : Les fixateurs peuvent présenter un risque pour la santé et doivent être utilisés dans une hotte chimique. Tous les appareils sont installés dans une hotte chimique pour empêcher l’inhalation de fixateurs.
   1. Remplissez un récipient avec du PBS sans calcium et du paraformaldéhyde (concentration finale de 4 %). Préparez une solution fixative totale de 50 mL pour chaque souris.
      REMARQUE: Le type de fixateur utilisé peut varier et dépendra des études histologiques en aval.

5.   Préparation de l’appareil de perfusion

REMARQUE: Une pompe péristaltique est suggérée pour l’administration de fluides dans le système vasculaire afin d’assurer un débit constant. Les instructions suivantes concernent la mise en place de la pompe péristaltique et peuvent être différentes pour chaque modèle. Alternativement, si une pompe péristaltique n’est pas disponible, un deuxième appareil à colonne d’eau peut être construit pour perfuser les fluides à partir d’une hauteur de 35 cm H₂O.

1. Placez d’abord le tube autour de l’assemblage du rouleau.
2. Fixez le tube dans les poteaux entaillés.
3. Verrouillez les leviers en place en plaçant d’abord le levier gauche autour du tube et en le fixant en place avec le levier supérieur, puis le levier droit.
4. Placez l’extrémité proximale du tube dans la solution d’héparine et l’extrémité distale dans le récipient de traitement des animaux.
5. Préchargez la solution d’héparine dans le tube en faisant fonctionner la pompe pour expulser l’air du tube.
6. Fixez une aiguille de 25 G x 5/8 po à l’extrémité du côté gauche du tube.

6. Préparation de l’appareil de gonflage de l’air

1. Placez la seringue pour la colonne d’eau dans un porte-anneau.
2. Mesurez une hauteur verticale de 25 cm entre la plate-forme animal et la marque de ruban adhésif « 25 cm » (étape 1.2) sur la colonne d’eau.
3. Fixez l’extrémité du tube de la colonne d’eau au robinet d’arrêt de la chambre à air.
4. Fixez un tube de la femelle Luer de la chambre à air au robinet d’arrêt sur le récipient de traitement des animaux.
   REMARQUE : Si la chambre de gonflage de l’air est construite comme illustré à la figure 1C, la fixation du tube dans l’ordre inverse peut provoquer une fuite d’eau dans le tube qui se connecte à la canule trachéale.
5. Assurez-vous que le bouchon de la chambre à air est bien fermé.
6. Assurez-vous que le robinet d’arrêt à l’extérieur du contenant de traitement des animaux est fermé et que le robinet d’arrêt sur le tube menant de la colonne d’eau à la chambre de gonflage de l’air est ouvert.
7. Remplissez la seringue avec de l’eau jusqu’à la marque « 25 cm ». L’eau quittera la seringue à travers le tube dans la chambre à air. Une fois la pression égalisée, l’eau cessera de couler.
   1. Il est possible que l’eau s’infiltre lentement dans la chambre de gonflage de l’air à mesure que la pression de l’air ambiant dans la hotte chimique fluctue. Gardez un œil sur le niveau d’eau à l’intérieur de la seringue et ajoutez-en plus si nécessaire. Maintenez le niveau d’eau à la marque « 25 cm » tout au long de la procédure.
      REMARQUE: Habituellement, les niveaux d’eau restent constants pour la première partie du gonflage de l’air à 25 cmH₂O; Cependant, il faudra probablement ajouter plus d’eau à la seringue pendant la fixation. Si l’eau ne cesse pas de couler, il est probable qu’une fuite d’air existe dans la chambre de gonflage de l’air. Plus de fabricant de joints en silicone peut avoir besoin d’être appliqué autour des Luers pour éviter les fuites d’air.

7. Préparation des animaux (Figure 2)

REMARQUE: Cette procédure a été modifiée à partir de Gage et al¹³. Nous avons terminé cette procédure sur des souris mâles et femelles adultes d’âges différents et ne notons aucun biais d’âge ou de sexe.

1. Euthanasier l’animal avec du pentobarbital de sodium (150 mg/kg, par voie intrapéritonéale). Assurez-vous que l’animal est mort avant de commencer la dissection.
   REMARQUE: Bien que cette procédure soit effectuée sur des animaux euthanasiés, cette procédure peut être effectuée sur des animaux vivants pour utiliser le cœur pour pomper des perfusates dans tout l’animal.
2. Faites deux incisions latérales à travers la paroi abdominale. Faites la première incision sous la cage thoracique et la seconde au-dessus des hanches. Couper le long de la ligne médiane de l’incision inférieure vers l’incision supérieure.
3. À l’aide de ciseaux contondants, faites soigneusement une incision dans le côté latéral du diaphragme. Les poumons devraient s’effondrer dès que le diaphragme est perforé.
   REMARQUE: Des précautions doivent être prises pour éviter de percer les poumons. Un poumon perforé est moins susceptible de se gonfler au cours des étapes ultérieures.
4. Couper transversalement le long du diaphragme pour ouvrir la cavité thoracique.
5. Coupez de manière supérieure le long du sternum du processus xiphoïde à l’encoche jugulaire et latéralement au-dessus de la cage thoracique pour exposer complètement le cœur et les poumons. Épinglez les côtés de la cage thoracique.
6. Faites une incision médiane dans le cou au-dessus de la trachée. Enlevez la peau, les muscles, la glande thyroïde et le tissu conjonctif entourant la trachée.
7. À l’aide d’une pince incurvée, faites glisser deux morceaux de fil ou de suture sous la trachée postérieure. Utilisez un morceau de suture pour maintenir l’adaptateur Luer-stub de gonflage en place, et utilisez l’autre pour attacher la trachée à la fin du gonflage de l’air et de la fixation de perfusion vasculaire.
8. Percez un petit trou dans la trachée à l’aide d’une aiguille de 18G x 1 » ou de ciseaux à ressort Vannas.
9. Placez un adaptateur Luer-stub 20G dans ce trou de la trachée.
10. Attachez un fil autour de la trachée immédiatement distale à l’endroit où l’adaptateur Luer-stub entre pour le maintenir en place.
11. Transférez l’animal dans le contenant de traitement des animaux.
12. Fixez l’adaptateur Luer-stub à la femelle Luer à l’intérieur du récipient de traitement des animaux.

8. Gonflage de l’air, perfusion et fixation des poumons (Figure 2)

1. Placez l’aiguille 25G x 5/8 " attachée au tube de l’appareil de perfusion dans le ventricule droit du cœur.
2. Couper l’aorte abdominale pour permettre au sang de s’écouler du cœur et pour favoriser la circulation du perfusate dans les poumons.
3. Ouvrez le robinet d’arrêt à l’extérieur du récipient de traitement des animaux pour gonfler les poumons.
   REMARQUE: Il peut prendre du temps pour que les poumons se gonflent complètement. Surveillez le niveau d’eau dans la seringue, il ne devrait pas diminuer rapidement à moins qu’il n’y ait une fuite dans les poumons.
4. Gonfler les poumons à 25 cmH₂O pendant 5 minutes. L’inflation à 25 cmH₂O préconditionne le poumon et aide au recrutement dans les régions pulmonaires électriques.
   REMARQUE: Une petite quantité d’eau peut être nécessaire d’ajouter à la seringue pour maintenir la hauteur de 25 cm. L’inflammation et/ou les lésions pulmonaires induites expérimentalement peuvent influencer l’inflation des poumons. Dans ce cas, il peut être nécessaire d’augmenter la pression de gonflage jusqu’à un maximum de 35 cmH₂O pour faciliter le recrutement dans les régions électriques.
5. Pendant la dernière minute du gonflage pulmonaire, allumez la pompe péristaltique à un débit de 10 mL / min. La solution d’héparine doit s’écouler de la bouteille à travers le tube dans l’animal.
   1. Le but de la perfusion d’héparine est de prévenir la formation de thrombus dans les vaisseaux. En conséquence, infuser l’héparine jusqu’à ce que les poumons deviennent blancs et soient dépourvus de sang. Si les poumons ne blanchissent pas, un ajustement de l’aiguille ventriculaire droite peut être nécessaire.
6. Après avoir gonflé pendant 5 minutes, éteignez la pompe péristaltique et passez le tube de perfusion de la solution d’héparine au fixateur.
7. Abaissez la seringue de la colonne d’eau à la marque « 20 cm » (étape 1.3). Il est normal que les bulles d’air se déplacent à l’intérieur de la colonne d’eau lorsque la pression passe de 25 à 20 cmH₂O.
   1. Vérifiez le niveau d’eau dans la seringue. Il devrait être à la marque « 25 cm ». Il peut être nécessaire d’en ajouter d’autres pour le moment.
8. Attendez 1 min pour permettre aux poumons de se dégonfler de 25 à 20 cmH₂O.
9. Redémarrez la pompe de perfusion à un débit de 6,5 mL/min.
10. Perfusion vasculaire-fix pendant 10 à 15 minutes.

9. Extraction des poumons (Figure 3)

1. Attachez fermement le deuxième morceau de fil autour de la trachée distale à l’adaptateur Luer-stub. Retirez l’adaptateur Luer-stub de la trachée.
2. Retirez l’aiguille du cœur.
3. Libérez les poumons et le cœur de la cavité thoracique en coupant le tissu conjonctif postérieur au médiastin avec des ciseaux contondants. Prenez soin d’éviter de percer les poumons.
4. Retirez soigneusement le cœur des poumons.
5. Placez les poumons en fixateur pendant la nuit.
   NOTE: La durée des variers fixateurs dépend des études histologiques en aval.
   1. Placez les poumons dans un tube conique de 50 mL contenant 20 à 25 mL de fixateur. Placez le fil en fixant la trachée à travers l’ouverture du tube conique et fixez-le par les fils du capuchon. Inverser le tube conique pour s’assurer que les poumons flottants et gonflés à l’air restent complètement immergés dans le fixateur, sinon ils flotteront vers le haut du liquide.
6. Traiter les poumons pour les études histologiques.

Résultats

Dans un thorax intact, les poumons sont maintenus ouverts par des forces extérieures appliquées par la paroi thoracique via l’espace pleural^6,14. Lorsque le diaphragme est entré pendant la dissection, l’intégrité de l’espace pleural est abolie et les poumons doivent s’effondrer (Figure 2A, 2B). Pour réatenser les poumons, un gonflage de l’air est effectué. Dans un premier temps, 25 cm de pression d?...

Discussion

Bien que couramment utilisées, les méthodes de fixation intratrachéales déplacent les leucocytes des voies respiratoires et peuvent modifier l’architecture pulmonaire normale. La méthode de gonflage de l’air avec perfusion vasculaire-fixation qui est fournie dans ce protocole surmonte ces pièges et préserve plus précisément l’anatomie pulmonaire. Les clés pour obtenir des tissus de haute qualité à partir de la méthode de perfusion-fixation vasculaire comprennent une surveillance attentive des pressions...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer	Cole-Parmer	Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF	Stopcock
BD 60 mL syringe, slip tip	BD	309654	Syringe used to construct the water column
BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8	BD Biosciences	305122	Needle for vascular perfusion/fixation
Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer	Nordson Medical	FTLLBMLRL-1	Female Luer
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3393	Heparin solution.
Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge	BD Biosciences	427564	Luer-Stub Adapter
Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee	Nordson Medical	LT787-9	Male Luer
Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing	ThermoFisher Scientific	8000-9020	Tubing
Paraformaldehyde Aqueous Solution - 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline
Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker	Permatex	81724	Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers
Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium	Corning	21-040-CV	Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions
Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container	Sterilite	0342	Animal processing container