אין ויטרו מודלים עורקיים בתרבית תאים 3D לחקר פילוח תרופות כלי דם תחת זרימה

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול חדש כדי לחקור ולמפה את התצהיר הממוקד של נשאי סמים לתאי אנדותל במודלים מפוברקים, בגודל אמיתי, עורק אנושי תלת מימדי תחת זרימה פיזיולוגית. השיטה המוצגת עשויה לשמש פלטפורמה חדשה למיקוד נשאי סמים בתוך מערכת כלי הדם.

Abstract

השימוש במודלים תלת מימדיים (תלת-ממדיים) של עורקים אנושיים, המתוכננים עם הממדים והאנטומיה הנכונים, מאפשר מידול נכון של תהליכים חשובים שונים במערכת הלב וכלי הדם. לאחרונה, למרות מספר מחקרים ביולוגיים בוצעו באמצעות מודלים תלת ממדיים כאלה של עורקים אנושיים, הם לא הוחלו לחקור פילוח כלי דם. מאמר זה מציג שיטה חדשה לייצור מודלים עורקיים אנושיים בגודל אמיתי ומשוחזר באמצעות טכניקת הדפסה תלת-ממדית, ליישר אותם בתאי אנדותל אנושיים (ECs) וללמוד פילוח חלקיקים תחת זרימה פיזיולוגית. מודלים אלה יש את היתרון של שכפול הגודל הפיזיולוגי ואת התנאים של כלי הדם בגוף האדם באמצעות רכיבים בעלות נמוכה. טכניקה זו עשויה לשמש פלטפורמה חדשה ללימוד והבנת פילוח תרופות במערכת הלב וכלי הדם ועשויה לשפר את העיצוב של ננו-רפואה להזרקה חדשה. יתר על כן, הגישה המוצגת עשויה לספק כלים משמעותיים לחקר אספקה ממוקדת של סוכנים שונים למחלות לב וכלי דם תחת זרימה ספציפית למטופל ומצבים פיזיולוגיים.

Introduction

מספר גישות יושמו לאחרונה תוך שימוש בדגמים תלת-ממדיים של עורקים אנושיים^1,2,3,4,5. מודלים אלה לשכפל את האנטומיה הפיזיולוגית ואת הסביבה של עורקים שונים בגוף האדם במבחנה. עם זאת, הם שימשו בעיקר במחקרי ביולוגיה של התא. מחקרים עדכניים על מיקוד כלי דם של חלקיקים לאנדותל כוללים סימולציות חישוביות סיליקו ^6,7,8, במודלים מיקרופלואידיים במבחנה ^9,10,11, ובדגמי בעלי חיים vivo ¹². למרות התובנות שהם סיפקו, מודלים ניסיוניים אלה לא הצליחו לדמות במדויק את תהליך הפילוח המתרחש בעורקים האנושיים, שבו זרימת הדם והמודינמיקה מהווים גורמים דומיננטיים. לדוגמה, המחקר של מיקוד חלקיקים לאזורים טרשת עורקים בביפורציה בעורק הראשי, הידועים בדפוס זרימת ההדקלם המורכב שלהם ושיפוע מתח גזוז הקיר, עשוי להשפיע על המסע שנלקח על ידי החלקיקים לפני שהם מגיעים לאנדהל^13,14,15,16. לכן, מחקרים אלה חייבים להתבצע בתנאים המשכפלים את הסביבה הפיזיולוגית, כלומר,גודל, ממד, אנטומיה ופרופיל זרימה.

לאחרונה, קבוצת מחקר זו מפוברק מודלים עורקיים אנושיים משוחזרים 3D כדי לחקור את התצהיר ואת מיקוד של חלקיקים vasculature¹⁷. המודלים התבססו על העתקים גיאומטריים תלת-ממדיים של כלי הדם האנושיים, אשר היו אז מתורבתים עם ECs אנושי כי לאחר מכן מרפד את הקירות הפנימיים שלהם. בנוסף, כאשר הם נתונים למערכת זלוף המייצרת זרימה פיזיולוגית, המודלים שיכפלו במדויק את התנאים הפיזיולוגיים. מערכת ההזנה תוכננה לחדיר נוזלים בקצב זרימה קבוע, תוך שימוש במשאבה פרייסטלית בתצורות סגורות ומעגלים פתוחים(איור 1). המערכת יכולה לשמש כמעגל סגור כדי למפות תצהיר חלקיקים ומיקוד לתאים שנזרעו בתוך מודל העורקנות. בנוסף, זה יכול לשמש מעגל פתוח לשטוף חלקיקים שאינם דבקים בסוף הניסויים כדי לנקות ולתחזק את המערכת. מאמר זה מציג פרוטוקולים לייצור דגמים תלת-ממדיים של ביפורציה דמוית-הלב האנושית, עיצוב מערכת ההזדוקות ומיפוי התצהיר של חלקיקים ממוקדים בתוך המודלים.

Protocol

הערה: פרוטוקול זה מתאר את הייצור של מודל תלת-ממדי של העורק הראשי וניתן להחיל אותו כדי ליצור כל עורק עניין אחר על ידי שינוי הפרמטרים הגיאומטריים.

1. עיצוב וייצור של ביפורציה תלת-ממדית של דגם העורק הראשי האנושי

1. בחר תמונות מחולים או גיאומטריות שנחקרו בעבר של ביפורציה בעורק הראשי האנושי, וליצור מודל עיצובי בעזרת מחשב של התבנית שיש להדפיס.
   הערה: לעורק הראשי יש פתח אחד ושני שקעים. חשוב לעצב מסגרת עובש תלת-ממדית סביב העורק והדפסה זמנית תומכת בין המסגרת לתבנית העורק(איור 2A-C).
2. הדפס את הגיאומטריות באמצעות מדפסת תלת-ממד. חותכים את תומכי ההדפסה הזמניים, ומשתמשים בניפוי זכוכית כדי ללטש ולהחליק את התבניות, במיוחד באזורים שבהם נותכו התומכים. יש לשטוף את הדגם המלוטשה באלכוהול איזופרופיל כדי להסיר את אבק הפלסטיק, ולאפשר להתייבש לחלוטין במכסה המנוע הכימי למשך 2-3 שעות.
   הערה: כאן, התבניות המודפסות היו עשויות שרף ברור v4 (איור 2D,E).
3. כדי להמיס בקלות את הפלסטיק, לרסס את התבניות עם לכה שקופה בתוך מכסה המנוע הכימי, ולאפשר אוויר יבש במשך 1 שעות. חזור על 3x זה.
   הערה: כאן, 2X כיסוי אולטרה Clear ספריי שימש, אבל כל סוג אחר צריך להיות מתאים כל עוד זה לא לכה עץ. אשר כי לא נשאר פלסטיק חשוף כי הפלסטיק עשוי להגיב עם הסיליקון ולמנוע ממנו להתמצק כראוי. איכות המשטח המרוסס תקבע את איכות פני השטח של דגם הסיליקון הסופי.
4. חותכים שקופיות/רצועות מלבניות שקופות של פלסטיק חלק באותם ממדים כמו מסגרת התבנית, ומדביקים אותם באמצעות הלכה למסגרת מכל הצדדים ומצד אחד של המסגרת, כך שהיא תהיה אטומה בתחתית ופתוחה בחלק העליון. החל את הלכה באמצעות מברשת צבע בתוך מכסה המנוע הכימי, ואפשר לשקופיות להתייבש לחלוטין למשך 24 שעות לפחות (איור 2F).
5. להכנת תערובת גומי הסיליקון, מוסיפים סיליקון נוזלי עם חומר הריפוי שלו (יחס מסה 1:10) בצלחת פלסטיק, ומערבבים ביסודיות כדי להבטיח ערבוב מלא. עבור דגם הכבישים, להוסיף 54 גרם של סיליקון ו 6 גרם של סוכן הריפוי שלה.
6. מצננים את התערובת במשך 15 דקות ב 4 °C (7 °F), ולאחר מכן degas אותו בחיטוי ואקום עד כל בועות האוויר בוטלו. מניחים את התבנית בחיטוי (כשהצד הפתוח פונה כלפי מעלה), יוצקים לאט את תערובת הסיליקון לתבנית, ושוב מסירים את בועות האוויר עד שהתערובת ברורה.
7. תן לתבנית לעמוד עם הסיליקון לילה בטמפרטורת החדר (אם אפשר, להשאיר אותו בחיטוי ללא ואקום). אם התערובת לא התייבשה לחלוטין, לדגור אותו ב 60 °C (60 °F) עוד כמה שעות.
8. לאחר שהתערובת יבשה לחלוטין, הסירו את השקופיות השקפות, וטבולים את הדגם באצטון מוחלט למשך 48 שעות במכסה המנוע הכימי עד שהפלסטיק נמס לחלוטין. מוציאים את שאריות הפלסטיק עם מקל עץ. כדי לאדות את האצטון לכוד בתוך המודל, לדגור אותו ב 60 °C לפחות 4 ימים לפני זריעת התא.

2. תרבות התאים וזריעה במודלים

1. הכן שלושה מחברים לדגם הערקר: אחד לשקע ושניים לשקעים (ראה טבלת חומרים). לחטא את הדגם ואת המחברים על ידי הקרנה אולטרה סגולה במכסה המנוע הביולוגי במשך 20 דקות.
2. מצופים את הדגמים עם 4 מ"ל של 100 מיקרוגרם / mL פיברונכטין (ב 1x תמיסת מלח חוצץ פוספט, (PBS)) עבור 2 שעות ב 37 °C (50 °F) או לילה ב 4 °C (50 °F). הזרק את פתרון פיברונקטין לתוך המודל דרך הכניסה באמצעות מזרק פלסטיק 5 או 10 מ"ל. הסר את fibronectin דרך השקע, לשטוף את המודל עם EC בינוני.
3. להשעות 2.5 × 10⁶ תאים / מ"ל תאי אנדותל וריד אנושי אנושי (HUVECs, מעבר < 6), ולמלא את הדגם עם 4 מ"ל של השעיית התא באמצעות מזרק פלסטיק 5 או 10 מ"ל (איור 3A). מניחים את הדגם על סיבוב בתוך אינקובטור (37 °C) במהירות של 1 סל"ד ל-48 שעות כדי להבטיח זריעה הומוגנית. ודאו שהמודל מחובר היטב לרוטטור(איור 3B). החליפו את המדיום לאחר 24 שעות בתוך מכסה המנוע הביולוגי, וחזרו לרוטציה בתוך האינקובטור לעוד 24 שעות.
   הערה: לאחר 24 שעות, התאים נזרעים וניתן לדמייןם באמצעות מיקרוסקופ.
4. הסר את הדגם מן המסובב, ולשטוף עם PBS 1x באמצעות מזרק פלסטיק 10 מ"ל. כדי לתקן את התאים, לדגור על התאים עם 4 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA) לדגם במשך 15 דקות בתוך מכסה המנוע הכימי, ולאחר מכן לשטוף 3x עם PBS. הוסיפו 4 מ"ל של PBS, ואחסנו ב-4 °C (איור3C). להכתים את התאים בתוך המודל באמצעות פרוטוקולי הכתמה סטנדרטיים (למשל, כתמים גרעיניים עם 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI), איור 3D).

3. עיצוב מערכת ההשתפות

1. מערכת ההזנקות כוללת שני פתחים ושני צינורות שקע. מזגו את שני המפרצונים לצינור זיהוי יחיד של 4 מ"מ ושוב לשני צינורות זיהוי 6 מ"מ, המתחברים למשאבה ההפריסטית. מזגו את שני צינורות הזיהוי של 6 מ"מ שיוצאים מהמשאבה העילית לצינור יחיד של 4 מ"מ, וחברו אותו למדכא תנודות כדי למנוע תנודות מהמשאבה. השתמש בבקבוק 250 מ"ל בעל פה צר עם מכסה של שלושה פתחים כמדכא.
2. חבר פתח אחד לפתח מהמשאבה, סגור את השני עם פקק המשמש לאוורור לחץ במצבי חירום, והרחיב את הפתח השלישי (שהוא השקע) לתחתית הבקבוק.
3. חבר את המדכא לפרצון של דגם הערקר התרבותי באמצעות צינורות השקע. מזג את שני שקעי הדגם לאמבטיה אחת, שתהיה השקע של המערכת (כל הצינורות הם מזהה 4 מ"מ).
4. לפצל את צינורות השקע לשני צינורות שקע (אחד עבור המעגל הסגור והשני עבור מיכל הפסולת במעגל הפתוח). חבר מהדק פלסטיק לכל צינור.
   הערה: השילוב של מלחציים פתוחים/סגורים יקבע אם המערכת נמצאת בתצורת מעגל סגור או פתוח. כפי שמוצג באיור 1, אם המהדקים a ו-d קרובים בעוד ש-b ו-c פתוחים, המערכת היא מעגל סגור; ההפך מביא את המערכת לתצורת מעגל פתוח.
5. הכן שלושה מיכלים: אחד שיכול להכיל נוזל 300 מ"ל (למעגל סגור) ושניים אחרים של 1 L כל אחד: אחד לשטיפה והשני לפסולת (למעגל פתוח).

4. תצורה במעגל סגור: ניסוי זלוף והדמיה

1. הוסף 300 מ"ל של PBS למיכל במעגל סגור, וזה מספיק כדי למלא את המערכת כולה, כולל הצינורות ואת המודל. מניחים צינור מפרצון אחד וצינור שקע אחד (מלחציים פתוחים b ו- c) בתוך המיכל.
2. מלאו את מיכל הכביסה 1 L במים מזוקקים (לשטיפה בסוף הניסוי), והותיר את מיכל הפסולת 1 L האחרים ריקים. מניחים את הצינורות והשקע האחרים (סוגרים מהדקים א' ו-ד') במיכלי הכביסה והפסולת, בהתאמה.
3. הוציא את דגם התרבתות של התא הקבוע מתוך אחסון של 4 °C (4 °F) ורוקן את ה- PBS. חבר את המפרצון והשקעים של הערקר כמתואר בשלבים 3.3-3.4. אין להשאיר את הדגם יבש במשך זמן רב. לאחר חיבור הדגם, הפעל את המשאבה כדי לעיין בנוזל.
4. הנח את דגם הכבישים מתחת למיקרוסקופ. פתח את הצינורות לפני הפתח ואחרי השקע של דגם הערקר. הגדר את המשאבה peristaltic ב 10 סל"ד, ולהדליק אותו. הגדל את המהירות במרווחים של 5 סל"ד, כל 4-5 דקות. ודא שאין דליפות.
5. ב 100 סל"ד, אשר שווה את קצב הזרימה המרבי של צורת הגל הפיזיולוגית של העורק הראשי האנושי (~ 400 מ"ל / דקה), להוסיף חלקיקי פוליסטירן קרבוקסילציה פלואורסצנטי (PS) (2 מיקרומטר, בריכוז של 1.6 מיקרוגרם / מ"ל) ל 300 מ"ל של PBS במיכל במעגל סגור. צלם את אזור העניין כל 10 שניות למשך 1.5 שעות (עדיין תמונות בודדות או וידאו לפי הצורך).

5. תצורת מעגל פתוח: שלב הכביסה

1. פתח את מלחציים של צינורות הכביסה והפסולת במיכלי 1 L (מהדקים a ו- d), ומיד סגור את המהדקים של צינורות המפרצון והשקע במיכל 300 מ"ל (מהדקים b ו- c) כדי לשנות את המערכת מתצורת מעגל סגורה למעגל פתוח.
2. תן לרוב המים לזרום ממיכל הכביסה למיכל הפסולת ב-100 סל"ד. לפני שהוא מועבר לחלוטין, לחץ על עצור על המשאבה peristaltic, ולסגור את מהדקי הצינור לפני המפרצון ואחרי השקע של דגם הערקר.
3. באמצעות המסננים המתאימים, ללכוד תמונות של המודל באזור העניין כדי להראות את התצהיר וההידבקות של חלקיקים לתאים. נתק את דגם הכבישים. בזהירות ובאיטיות להוסיף 4 מ"ל של PBS עם מזרק 10 מ"ל דרך מפרצון הדגם.
4. חברו "דגם דמה", (שהוא גם דגם תלת-עורי מגומי סיליקון המשמש רק לשטיפה, ללא תאים מתורבתים) במקום דגם העורקנות, ושטפו את המערכת. מוסיפים עוד 1 ליטר מים, ושטפים את המערכת שוב עד שכל המים מועברים ממיכל הכביסה לפסולת. כבה את המשאבה ההפריסטית.

6. רכישת נתונים וניתוח נתונים

1. לרכוש סרט דיגיטלי של תצהיר חלקיקים באזור העניין עם התמונות שצולמו במהלך הניסוי, באמצעות קוד תוכנה מותאם אישית (ראה טבלת החומרים).
2. למיפוי התצהיר של החלקיקים לאורך המודל, ציין תמונות מרובות כדי לכסות את אזור העניין הנבדק(איור 4A,B).
   הערה: ניתן לכתוב קוד תוכנה מותאם אישית כדי לכמת את מספר החלקיקים הדבוקים באתר מעניין (קובץ לדוגמה סופק כמידע משלים)¹⁷.

תוצאות

מאמר זה מציג פרוטוקול חדש למיפוי התצהיר של חלקיקים בתוך מודלים של עורקים אנושיים בגודל אמיתי, אשר עשוי לספק פלטפורמה חדשה למחקר אספקת תרופות. באמצעות טכניקת הדפסה תלת-ממדית, נוצר דגם של עורק העורק הראשי האנושי (איור 2). הדגם היה עשוי מגומי סיליקון וזרע עם קרנות הון סיכון אנו?...

Discussion

הגישות הנוכחיות לחקר פילוח כלי דם של חלקיקים נופלות בשכפול התנאים הפיזיולוגיים הקיימים בגוף האדם. מוצג כאן פרוטוקול לפברק מודלים משוחזרים תלת-ממדיים של עורקים אנושיים כדי לחקור את מיקוד החלקיקים ל- ECs המרפד את העורק תחת זרימה פיזיולוגית המיושמת באמצעות מערכת זלוף מותאמת אישית. בעת בחירת ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	FormLabs	PKG-F2-REFURB
Acetone, absolute (AR grade)
Connectors	Nordson Medical	FTLL013-1	Female Luer
		FTLL230-1	Female Luer
		FTLL360-1	Female Luer
		LP4-1	Male Luer Integral Lock
Damper	Thermo-Fisher Scientific	DS2127-0250	Nalgene Polycarbonate, Validation Bottle
Damper Cover	Thermo-Fisher Scientific	2162-0531	Nalgene Filling/Venting Closures
Elastosil Elastosil RT 601 A	Wacker	60003805
Elastosil RT 601 B	Wacker	60003817	The crosslinker
Endothelial Cell Media	ScienCell	1001
Fibrontectin	Sigma Aldrich	F0895-5mg
HUVEC	Lonza	CC-2519
Isopropyl alcohol, AR grade 99.5%			Remove plastic dust from the sanded model
Lacquer	Rust-Oleum		2X-Ultra cover Gloss Clear
Matlab	Mathworks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Microscope	Nikon	SMZ25
Microscope Camera	Nikon	DS-Qi2
Peristaltic pump	Watson Marlow	530U IP31	With 2 pumpheads: 313D
Plastic tube clamp	Quickun	1-2240-stopvalve-2pcs
Polystyrene Particles	Thermo-Fisher Scientific	F8827	Diameter = 2 µm
Printer resin	FormLabs	RS-F2-GPCL-04
Rotator	ELMI Ltd.		Intelli-Mixer RM-2
Solidworks	SolidWorks Corp., Dassault Systèmes		https://www.solidworks.com/
Tubing	Watson Marlow	933.0064.016	Tubing for the pump: 6.4 mm ID
All the other tubing: Silicon tubing: 4 mm ID