Modelli arteriosi in vitro coltivati in cellule 3D per lo studio del targeting vascolare del farmaco sotto flusso

Riepilogo

Qui presentiamo un nuovo protocollo per studiare e mappare la deposizione mirata dei portatori di farmaci alle cellule endoteliali in modelli di arteria umana fabbricati, di dimensioni reali e tridimensionali sotto flusso fisiologico. Il metodo presentato può servire come una nuova piattaforma per colpire i portatori di farmaci all'interno del sistema vascolare.

Abstract

L'utilizzo di modelli tridimensionali (3D) di arterie umane, progettati con le dimensioni e l'anatomia corrette, consente la corretta modellazione di vari processi importanti nel sistema cardiovascolare. Recentemente, sebbene diversi studi biologici siano stati eseguiti utilizzando tali modelli 3D di arterie umane, non sono stati applicati allo studio del targeting vascolare. Questo articolo presenta un nuovo metodo per fabbricare modelli arteriosi umani di dimensioni reali e ricostruiti utilizzando una tecnica di stampa 3D, allinearli alle cellule endoteliali umane (EC) e studiare il targeting delle particelle sotto flusso fisiologico. Questi modelli hanno il vantaggio di replicare le dimensioni fisiologiche e le condizioni dei vasi sanguigni nel corpo umano utilizzando componenti a basso costo. Questa tecnica può servire come una nuova piattaforma per lo studio e la comprensione del targeting farmacologico nel sistema cardiovascolare e può migliorare la progettazione di nuove nanomedicine iniettabili. Inoltre, l'approccio presentato può fornire strumenti significativi per lo studio della somministrazione mirata di diversi agenti per le malattie cardiovascolari in condizioni fisiologiche e di flusso specifiche del paziente.

Introduzione

Diversi approcci sono stati recentemente applicati utilizzando modelli 3D di arterie umane^1,2,3,4,5. Questi modelli replicano l'anatomia fisiologica e l'ambiente delle diverse arterie del corpo umano in vitro. Tuttavia, sono stati utilizzati principalmente negli studi di biologia cellulare. Gli attuali studi sul targeting vascolare delle particelle all'endotelio comprendono simulazioni computazionali silico ^6,7,8, modelli microfluidici in vitro ^9,10,11e modelli animali in vivo ¹². Nonostante le intuizioni che hanno fornito, questi modelli sperimentali non sono riusciti a simulare accuratamente il processo di targeting che si verifica nelle arterie umane, in cui il flusso sanguigno e l'emodinamica costituiscono fattori dominanti. Ad esempio, lo studio del targeting delle particelle verso le regioni aterosclerotiche nella biforcazione dell'arteria carotide, note per il loro complesso modello di flusso di ricircolo e il gradiente di sollecitazione di taglio della parete, può influire sul viaggio intrapreso dalle particelle prima che raggiungano l'endotelio^13,14,15,16. Pertanto, questi studi devono essere eseguiti in condizioni che replicano l'ambiente fisiologico, cioèdimensioni, dimensione, anatomia e profilo di flusso.

Recentemente, questo gruppo di ricerca ha fabbricato modelli arteriosi umani ricostruiti in 3D per studiare la deposizione e il targeting delle particelle alla vascucolatura¹⁷. I modelli erano basati su repliche geometriche 3D di vasi sanguigni umani, che venivano poi coltivati con HC umani che successivamente fiancheggiavano le loro pareti interne. Inoltre, se sottoposti a un sistema di perfusione che produce flusso fisiologico, i modelli hanno replicato accuratamente le condizioni fisiologiche. Il sistema di perfusione è stato progettato per perfondere fluidi a una portata costante, utilizzando una pompa peristaltica sia in configurazioni a circuito chiuso che a circuito aperto(Figura 1). Il sistema può essere utilizzato come circuito chiuso per mappare la deposizione di particelle e mirare alle cellule sementi all'interno del modello carotide. Inoltre, può essere utilizzato come circuito aperto per lavare le particelle non aderenti alla fine degli esperimenti e per pulire e mantenere il sistema. Questo documento presenta protocolli per la fabbricazione di modelli 3D della biforcazione carotide umana, la progettazione del sistema di perfusione e la mappatura della deposizione di particelle mirate all'interno dei modelli.

Protocollo

NOTA: Questo protocollo descrive la fabbricazione di un modello 3D dell'arteria carotide e può essere applicato per generare qualsiasi altra arteria di interesse semplicemente modificando i parametri geometrici.

1. Progettazione e fabbricazione di una biforcazione 3D del modello di arteria carotide umana

1. Scegli le immagini dei pazienti o geometrie precedentemente studiate della biforcazione dell'arteria carotide umana e crea un modello di progettazione computerizzate dello stampo che deve essere stampato.
   NOTA: La biforcazione dell'arteria carotide ha un ingresso e due prese. È importante progettare un telaio di stampo 3D attorno all'arteria e supporti di stampa temporanei tra il telaio e lo stampo dell'arteria (Figura 2A-C).
2. Stampare le geometrie utilizzando una stampante 3D. Tagliare i supporti di stampa temporanei e utilizzare carta vetrata per lucidare e levigare gli stampi, specialmente nelle aree in cui sono stati tagliati i supporti. Risciacquare il modello levigato con alcool isopropile per rimuovere la polvere di plastica e lasciare asciugare completamente in una cappa chimica per 2-3 ore.
   NOTA: Qui, gli stampi stampati sono stati realizzati in resina trasparente v4 (Figura 2D, E).
3. Per sciogliere facilmente la plastica, spruzzare gli stampi con lacca trasparente all'interno di una cappa chimica e lasciare asciugare all'aria per 1 h. Ripeti questo 3x.
   NOTA: Qui è stato utilizzato 2X Ultra Cover Clear Spray, ma qualsiasi altro tipo dovrebbe essere adatto purché non sia lacca di legno. Confermare che non è rimasta plastica esposta perché la plastica può reagire con il silicone e impedirne la corretta solidificazione. La qualità della superficie spruzzata determinerà la qualità della superficie del modello finale in silicone.
4. Tagliare scivoli/strisce rettangolari trasparenti di plastica liscia delle stesse dimensioni del telaio dello stampo e incollarli utilizzando la lacca al telaio su tutti i lati e da un lato del telaio, in modo che venga sigillato nella parte inferiore e aperto nella parte superiore. Applicare la lacca utilizzando una spazzola all'interno di un cappuccio chimico e lasciare asciugare completamente i vetrini per almeno 24 ore(Figura 2F).
5. Per preparare la miscela di gomma siliconica, aggiungere silicone liquido con il suo agente polimerizzante (rapporto di massa 1:10) in una piastra di plastica e mescolare accuratamente per garantire la miscelazione completa. Per il modello carotide, aggiungere 54 g di silicone e 6 g del suo agente polimerizzante.
6. Raffreddare la miscela per 15 minuti a 4 °C, quindi degasarla in un essiccatore sottovuoto fino a quando tutte le bolle d'aria non sono state eliminate. Posizionare lo stampo nell'essiccatore (con il lato aperto rivolto verso l'alto), versare lentamente la miscela di silicone nello stampo e rimuovere nuovamente le bolle d'aria fino a quando la miscela non è chiara.
7. Lasciare riposare lo stampo con il silicone durante la notte a temperatura ambiente (se possibile, lasciarlo nell'essiccatore senza vuoto). Se la miscela non si è completamente asciugata, incubarla a 60 °C per altre ore.
8. Una volta che la miscela è completamente asciutta, rimuovere i vetri trasparenti e immergere il modello in acetone assoluto per 48 ore in una cappa chimica fino a quando la plastica non è completamente sciolta. Rimuovere eventuali avanzi di plastica con un bastone di legno. Per evaporare l'acetone intrappolato all'interno del modello, incubarlo a 60 °C per almeno 4 giorni prima della semina cellulare.

2. Coltura cellulare e semina nei modelli

1. Preparare tre connettori per il modello carotide: uno per l'ingresso e due per le prese (vedi Tabella dei materiali). Sterilizzare il modello e i connettori mediante irradiazione ultravioletta in una cappa biologica per 20 minuti.
2. Rivestire i modelli con 4 mL di fibronectina da 100 μg/mL (in 1x salina tamponata da fosfati, (PBS)) per 2 ore a 37 °C o durante la notte a 4 °C. Iniettare la soluzione di fibronectina nel modello attraverso l'ingresso utilizzando una siringa di plastica da 5 o 10 ml. Rimuovere la fibronectina attraverso l'uscita e lavare il modello con mezzo EC.
3. Sospendere 2,5 × 10⁶ cellule/mL di cellule endoteliali vena ombelicali umane (HUVEC, passaggio < 6) e riempire il modello con 4 ml della sospensione cellulare utilizzando una siringa di plastica da 5 o 10 ml(figura 3A). Posizionare il modello su un rotatore all'interno di un incubatore (37 °C) ad una velocità di 1 rpm per 48 h per garantire una semina omogenea. Assicurarsi che il modello sia ben collegato al rotatore (Figura 3B). Cambiare il mezzo dopo 24 ore all'interno di una cappa biologica e tornare al rotatore all'interno dell'incubatore per altri 24 h.
   NOTA: Dopo 24 ore, le cellule vengono sementi e possono essere immagini utilizzando un microscopio.
4. Rimuovere il modello dal rotatore e lavare con 1x PBS utilizzando una siringa di plastica da 10 ml. Per fissare le cellule, incubare le cellule con 4 mL di paraformaldeide al 4% (PFA) al modello per 15 minuti all'interno di una cappa chimica, quindi risciacquare 3 volte con PBS. Aggiungere 4 mL di PBS e conservare a 4 °C fino all'esperimento (Figura 3C). Mantenere le celle all'interno del modello utilizzando protocolli di colorazione standard(ad esempio, colorazione nucleare con 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI), Figura 3D).

3. Progettazione del sistema di perfusione

1. Il sistema di perfusione ha due prese e due tubi di uscita. Unire le due entrate in un unico tubo ID da 4 mm e di nuovo in due tubi ID da 6 mm, che si collegano alla pompa peristaltica. Unire i due tubi ID da 6 mm che escono dalla pompa peristaltica in un unico tubo da 4 mm e collegarli a uno smorzatore di oscillazione per eliminare eventuali oscillazioni dalla pompa. Utilizzare una bottiglia a bocca stretta da 250 ml con un coperchio a tre orifizi come smorzatore.
2. Collegare un orifizio all'ingresso dalla pompa, chiudere il secondo con un sughero utilizzato per lo sfiato della pressione in caso di emergenza ed estendere il terzo orifizio (che è l'uscita) sul fondo della bottiglia.
3. Collegare lo smorzatore all'ingresso del modello carotide coltivato utilizzando i tubi di uscita. Unire le due prese del modello a un tubo, che sarà l'uscita del sistema (tutti i tubi sono 4 mm ID).
4. Dividere i tubi di uscita in due tubi di uscita (uno per il circuito chiuso e l'altro per il contenitore dei rifiuti nel circuito aperto). Attaccare un morsetto di plastica a ciascun tubo.
   NOTA: La combinazione di morsetti aperti/chiusi determinerà se il sistema si trova in una configurazione a circuito chiuso o aperto. Come mostrato nella figura 1, se i morsetti a e d sono vicini mentre b e c sono aperti, il sistema è un circuito chiuso; il contrario porta il sistema alla configurazione a circuito aperto.
5. Preparare tre contenitori: uno in grado di contenere 300 mL di fluido (per circuito chiuso) e altri due da 1 L ciascuno: uno per il lavaggio e l'altro per i rifiuti (per circuito aperto).

4. Configurazione a circuito chiuso: esperimento di perfusione e imaging

1. Aggiungere 300 mL di PBS al contenitore a circuito chiuso, che è sufficiente per riempire l'intero sistema, compresi i tubi e il modello. Posizionare un tubo di ingresso e un tubo di uscita (morsetti aperti b e c) all'interno del contenitore.
2. Riempire il contenitore di lavaggio da 1 L con acqua distillata (per il lavaggio alla fine dell'esperimento) e lasciare vuoto l'altro contenitore di rifiuti da 1 L. Posizionare l'altro tubo di ingresso e uscita (morsetti ravvicinati a e d) rispettivamente nei contenitori di lavaggio e di scarto.
3. Eserti il modello carotide in coltura a celle fisse dalla conservazione a 4 °C e svuota il PBS. Collegare l'ingresso e le uscite della carotide come descritto nei passaggi 3.3-3.4. Non lasciare il modello asciutto per molto tempo. Una volta collegato il modello, attivare la pompa per perfondere il fluido.
4. Posizionare il modello carotide al microscopio. Aprire il tubo prima dell'ingresso e dopo l'uscita del modello carotide. Impostare la pompa peristaltica a 10 giri/min e accenderla. Aumenta la velocità in incrementi di 5 giri/min, ogni 4-5 minuti. Assicurarsi che non vi siano perdite.
5. A 100 giri/min, che equivale alla portata massima della forma d'onda fisiologica dell'arteria carotide umana (~400 mL/min), aggiungere particelle fluorescenti di polistirolo carbossilato (PS) (2 μm, ad una concentrazione di 1,6 μg/mL) ai 300 mL di PBS nel contenitore a circuito chiuso. Immagine della regione di interesse ogni 10 s per 1,5 ore (ancora singole immagini o video in base alle esigenze).

5. Configurazione a circuito aperto: la fase di lavaggio

1. Aprire i morsetti dei tubi di lavaggio e scarico nei contenitori da 1 L (morsetti a e d) e chiudere immediatamente i morsetti dei tubi di ingresso e di uscita nel contenitore da 300 mL (morsetti b e c) per cambiare il sistema da una configurazione a circuito chiuso a una aperta.
2. Lascia che la maggior parte dell'acqua fluisa dal contenitore di lavaggio al contenitore dei rifiuti a 100 giri/min. Prima che venga completamente trasferito, premere stop sulla pompa peristaltica e chiudere i morsetti del tubo prima dell'ingresso e dopo l'uscita del modello carotide.
3. Utilizzando i filtri appropriati, acquisire immagini del modello nella regione di interesse per mostrare la deposizione e l'adesione delle particelle alle cellule. Scollegare il modello carotide. Aggiungere con attenzione e lentamente 4 ml di PBS con una siringa da 10 ml attraverso l'ingresso del modello.
4. Collegare un "modello fittizio", (che è anche un modello carotide 3D in gomma siliconica utilizzato solo per il lavaggio, senza celle coltivate) al posto del modello carotide, e risciacquare il sistema. Aggiungere altri 1 L di acqua e lavare nuovamente il sistema fino a quando tutta l'acqua viene trasferita dal contenitore di lavaggio ai rifiuti. Spegnere la pompa peristaltica.

6. Acquisizione e analisi dei dati

1. Acquisire un filmato digitale di deposizione di particelle nella regione di interesse con le immagini scattate durante l'esperimento, utilizzando un codice software personalizzato (vedere la Tabella dei Materiali).
2. Per la mappatura della deposizione delle particelle lungo il modello, affiancare più immagini per coprire la regione di interesse esaminata (Figura 4A, B).
   NOTA: È possibile scrivere un codice software personalizzato per quantificare il numero di particelle aderenti in un sito di interesse (un file di esempio è stato fornito come informazioni supplementari)¹⁷.

Risultati

Questo documento presenta un nuovo protocollo per mappare la deposizione di particelle all'interno di modelli di arteria umana 3D di dimensioni reali, che possono fornire una nuova piattaforma per la ricerca sulla somministrazione di farmaci. Utilizzando una tecnica di stampa 3D, è stato fabbricato un modello dell'arteria di biforcazione carotide umana(Figura 2). Il modello era realizzato in gomma siliconica e sementi con HC umani(figura 3). È importante sotto...

Discussione

Gli attuali approcci per studiare il targeting vascolare delle particelle non sono all'altezza della replicazione delle condizioni fisiologiche presenti nel corpo umano. Qui è presentato un protocollo per fabbricare modelli di arterie umane ricostruiti in 3D per studiare il targeting delle particelle verso gli EC che rivestono l'arteria sotto flusso fisiologico applicato utilizzando un sistema di perfusione personalizzato. Quando si sceglie il materiale per la stampa 3D, è meglio utilizzare una plastica trasparente per...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	FormLabs	PKG-F2-REFURB
Acetone, absolute (AR grade)
Connectors	Nordson Medical	FTLL013-1	Female Luer
		FTLL230-1	Female Luer
		FTLL360-1	Female Luer
		LP4-1	Male Luer Integral Lock
Damper	Thermo-Fisher Scientific	DS2127-0250	Nalgene Polycarbonate, Validation Bottle
Damper Cover	Thermo-Fisher Scientific	2162-0531	Nalgene Filling/Venting Closures
Elastosil Elastosil RT 601 A	Wacker	60003805
Elastosil RT 601 B	Wacker	60003817	The crosslinker
Endothelial Cell Media	ScienCell	1001
Fibrontectin	Sigma Aldrich	F0895-5mg
HUVEC	Lonza	CC-2519
Isopropyl alcohol, AR grade 99.5%			Remove plastic dust from the sanded model
Lacquer	Rust-Oleum		2X-Ultra cover Gloss Clear
Matlab	Mathworks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Microscope	Nikon	SMZ25
Microscope Camera	Nikon	DS-Qi2
Peristaltic pump	Watson Marlow	530U IP31	With 2 pumpheads: 313D
Plastic tube clamp	Quickun	1-2240-stopvalve-2pcs
Polystyrene Particles	Thermo-Fisher Scientific	F8827	Diameter = 2 µm
Printer resin	FormLabs	RS-F2-GPCL-04
Rotator	ELMI Ltd.		Intelli-Mixer RM-2
Solidworks	SolidWorks Corp., Dassault Systèmes		https://www.solidworks.com/
Tubing	Watson Marlow	933.0064.016	Tubing for the pump: 6.4 mm ID
All the other tubing: Silicon tubing: 4 mm ID