צינור הכנה לדוגמה עבור מיקרוקריסטלים בקו הקרן VMXm

Summary

יחס אות לרעש של נתונים הוא אחד השיקולים החשובים ביותר בביצוע מדידות עקיפה של קרני רנטגן ממיקרו-קריסטלים. קו הקרן VMXm מספק סביבה עם רעש נמוך ומיקרואורגניזם לניסויים כאלה. כאן, אנו מתארים שיטות הכנה לדוגמה עבור microcrystals הרכבה וקירור עבור VMXm וקווי קרן קריסטלוגרפיה מיקרומוקולריים אחרים.

Abstract

הרכבה של מיקרוקריסטלים (<10 מיקרומטר) עבור קריו-קריסטלוגרפיה אחת קריסטל מציג אתגר לא טריוויאלי. שיפורים באיכות הנתונים נצפו עבור microcrystals עם התפתחות של אופטיקה קו קרן, יציבות קרן וגודל קרן משתנה התמקדות מתת מיקרון, כגון בקו הקרן VMXm במקור אור יהלום¹. שיפורים נוספים באיכות הנתונים יקבלו באמצעות שיפורים בסביבה מדגם והכנת מדגם. מיקרוקריסטלים מטבעם יוצרים עקיפה חלשה יותר, ולכן שיפור האות לרעש הוא המפתח לאיסוף נתוני עקיפה איכותיים של קרני רנטגן ויגיע בעיקר מהפחתות ברעשי הרקע. מקורות עיקריים של רעשי רקע רנטגן בניסוי עקיפה הם מהאינטראקציה שלהם עם נתיב האוויר לפני ואחרי הדגימה, פתרון התגבשות עודף המקיף את המדגם, נוכחות של קרח גבישי ופיזור מכל מכשור קו קרן אחר או חלונות רנטגן. קו הקרן VMXm כולל מכשור ופרוטוקול הכנה לדוגמה כדי להפחית את כל מקורות הרעש האלה.

ראשית, סביבת דגימה בריק ב- VMXm מסירה את נתיב האוויר בין מקור רנטגן לדגימה. לאחר מכן, פרוטוקולי הכנה לדוגמה עבור קריסטלוגרפיה macromolecular ב- VMXm להשתמש במספר תהליכים וכלים המותאמים CryoTEM. אלה כוללים רשתות נחושת עם סרטי תמיכה בפחמן חורי, סופג אוטומטי ורובוטיקה קירור צוללת עושה שימוש באתאן נוזלי. כלים אלה מאפשרים הכנת מאות מיקרו-קריסטלים ברשת קריומטם אחת עם נוזל מינימלי סביב על תמיכה ברעש נמוך. הם גם למזער את היווצרות של קרח גבישי מכל נוזל שנותר סביב הגבישים.
אנו מציגים את התהליך להכנת והערכה של איכות מיקרוקריסטלים חלבון מסיס באמצעות אור גלוי סורק מיקרוסקופיית אלקטרונים לפני הרכבה הדגימות על קו הקרן VMXm לניסויי עקיפה קרני רנטגן. אנו גם נספק דוגמאות של דגימות באיכות טובה, כמו גם אלה הדורשים אופטימיזציה נוספת ואסטרטגיות לעשות זאת.

Introduction

מחסום מרכזי לקביעת מבנים ברזולוציה גבוהה של מולקולות ביולוגיות על ידי קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית (MX) נשאר הייצור של גבישים מפוזרים היטב בגודל נוח. ישנן אסטרטגיות רבות להשגת מטרה זו מעיצוב מבנה גן חלבון רקומביננטי דרך חיפושי מטריצה דלילה גדולים אחר קוקטיילים כימיים שעשויים ליצור גבישים ראשוניים². עבור האחרון, זה לעתים קרובות המקרה כי קריסטלוגרף יצטרך לייעל כל להיטים ראשוניים כדי להשיג גבישים עם איכות עקיפה מספיק וגודל עבור מחקרים קביעת מבנה³. למרות אפשרויות אלה, ייתכן שמולקולות מטרה מסוימות לעולם לא ייצרו גדולים (>10 מיקרומטר), גבישים מנטרלים היטב וכתוצאה מכך הקריסטלוגרף חייב להתמיד עם המיקרו-קריסטלים שלהם והאתגרים שדגימות כאלה מציבות. אלה כוללים הרכבה מתאימה והגנה על הקריו, ניהול עקיפה חלשה יותר מטבעה ורגישות מוגברת לקרינה. מיקרוקריסטלים נוצרים מפחות תאים ומולקולות יחידה מאשר גבישים גדולים יותר וככזה, עקיפה אינה מוגברת באותה מידה לעומת גבישים גדולים יותר, וכתוצאה מכך עוצמות עקיפה חלשות מטבען. חשוב כי אות הרקע אינו להסוות השתקפויות אלה, במיוחד ברזולוציה גבוהה יותר שבו עוצמות השתקפות חלשות ניתן לאבד⁴. בנוסף, microcrystals רגישים יותר לנזקי קרינה ולמרות רישום עקיפה בטמפרטורות חנקן נוזלי⁵, ייתכן שלא ניתן יהיה לאסוף נתונים מלאים מגביש אחד, מה שהופך את הצורך לאסוף נתונים ממספר גדול מאוד של גבישים כדי לייצר ערכת נתונים מלאה אחת⁶.

הזמינות הגוברת של לייזרים אלקטרונים ללא קרני רנטגן (XFELs) והאבולוציה של שיטות קריסטלוגרפיה סדרתיות (SFX)⁷ סיפקו נתיבים לאיסוף נתונים ממיקרו-קריסטלים קטנים יותר. עם זאת, אלה שיטות מסירת מדגם מותאמות, הדורשות כמות משמעותית של חומרה ומומחיות תוכנה, שבהן הניסויים מוגבלים לטמפרטורת החדר ובדרך כלל צריכת הדגימה גבוהה (מאות מיקרוליטרים) ועדיין עשויות לדרוש מיטוב נוסף⁸. ככזה, פרויקטים שבהם ניתן לבצע רק כמות מוגבלת של מיקרו-קריסטלים אינם מתאימים ל- SFX.

בינתיים, טכנולוגיית קו הקרן סינכרוטרון בעשורים האחרונים התקדמה לייצר קורות קטנות ויציבות יותר⁹ עם זוהר שאיפשר איסוף נתונים מגבישים קטנים יותר^10,11. קווי קרן מיקרופוקוס כגון FMX ב- NSLS-II ו- I24 במקור אור היהלום הצליחו לקבוע מבנים חדשניים מגבישים עם ממדים מרביים של ~ 3 מיקרומטר¹² ולהדגים את היכולת לאסוף נתונים שמיש מגבישים קטנים עוד יותר בגודל ~ 1 מיקרומטר¹³. קו הקרן חייב להיות מוגדר במדויק, עם אופטיקה מצוינת ברזולוציה גבוהה על ציר צפייה, כדור מינימלי של בלבול לסיבוב מדגם וציר סיבוב מיושר בדיוק כי הוא בקנה אחד עם קרן הרנטגן. חשוב להתאים באופן הדוק את פרופיל קרן הרנטגן לנפח הגביש ולהבטיח שהקריסטל מיושר במדויק בקרן הרנטגן - אתגר עבור גבישים <5 מיקרומטר¹⁴. עמידה בתנאי ניסוי אלה בקו הקרן חיונית להקלטת הנתונים האיכותיים ביותר ממיקרו-קריסטלים.

ההיבט הנותר ואולי החשוב ביותר של איסוף נתונים ממיקרו-קריסטלים הוא הצגת הגביש לקרן הרנטגן. מיקרוקריסטלים הותקנו לעתים קרובות על תושבות דגימת מיקרומש, המיוצרות מפולימיד, חומר פיזור קרני רנטגן נמוך עם פתחים קטנים כמו 10 מיקרומטר^15,16. רשת הפולימיד מותקנת על סיכה סטנדרטית המוגדרת לבסיס SPINE מגנטי, מה שהופך אותה לתואמת לרוב קווי הקרן MX¹⁷. הר הרשת משמש לדגי גבישים מסירת ההתגבשות לעתים קרובות בעקבות אותו הליך כמו הרכבה על גבישי 100 מיקרומטר באמצעות הרכבה בסגנון לולאה סטנדרטית. בעוד הגבישים עשויים להיות מופצים על פני הרשת, חיסרון מרכזי הוא כי נפח גדול יחסית של נוזל יכול להיות נישא על ידי הרשת ואת הסיכה בעת הקציר (איור 1C,D). נפח זה של נוזל, שיכול להיות גדול פי כמה מהגבישים עצמם, יתרום לרעשי רקע כאשר הוא מואר בצילומי רנטגן. פיזור רקע זה יכול להיות אפילו חזק יותר אם הנוזל יוצר קרח גבישי במהלך קירור הבזק, ומפחית את יחס האות לרעש של עוצמות חלשות כבר ברזולוציות של עקיפה של קרח. לכן, זה המפתח כי נוזל עודף מוסר מן המדגם, כדי להבטיח כי כל האותות האפשריים ניתן להקליט. אתגר זה הוא אפילו גדול יותר במקרה של גבישי חלבון ממברנה שנוצר בתוך שלב מעוקב השומנים (LCP), שבו LCP מייצר פיזור רקע חזק והוא גם קשה להסיר מסביב גבישים ¹⁸.

קו הקרן החדש של מיקרופוקוס קריסטלוגרפי (VMXm) ב-Diamond Light Source מספק את התנאים שבהם ניתן לאסוף נתונים מגבישים שגודלם עשוי להיות קטן ממיקרון. קו הקרן^תוכנןלספק פרופיל קרן בגודל 0.3 מיקרומטר x 0.5 מיקרומטר (VxH) 1 , גוניומטר עם כדור של בלבול לא יותר מ 60 ננומטר וסביבת מדגם vacuo. תכונות עיצוב אלה של תחנת הקצה VMXm למזער את הדור של רעש רנטגן רקע על ידי מנגנון קו הקרן במהלך איסוף נתונים עם המקור הגדול ביותר שנותר של רקע שנוצר על ידי מדגם¹⁴.

שיטות הכנה ספציפיות לדוגמה המיועדות לקו הקרן VMXm מספקות הזדמנות להפחית רקע זה ולשפר עוד יותר את האות לרעש של נתוני עקיפה, תוך מקסום איכות הנתונים שניתן לרשום ממיקרו-קריסטלים המודדים <10 מיקרומטר. רבות מהדרישות המתוארות כאן לעקיפת רקע נמוך ממיקרו-קריסטלים נפוצות גם במיקרוסקופיית אלקטרונים שידור קריוגנית (cryoTEM)¹⁹ וחקיפת אלקטרונים מיקרוקריסטליים (microED)²⁰. כתוצאה מכך, רבים מהכלים שכבר פותחו להכנת דגימות cryoTEM מתאימים, עם כמה התאמות, להכנת מיקרוקריסטלים. בהכנת דגימות עבור cryoTEM חלקיק יחיד, החלקיקים הנחקרים מוטבעים בשכבות דקות מאוד (בדרך כלל <100 ננומטר) של קרח זגוכי, כך שאלקטרונים מסוגלים לשדר דרך המדגם. השכבה האחודה הדקה מושגת על ידי פירוק נוזל עודף ו- vitrification של המדגם מושגת על ידי קירור מהיר של המדגם (~ 104 K s^-1)²¹ באמצעות צלילה לתוך אתאן נוזלי המוחזק ~ 93 K²². לעומת זאת, חנקן נוזלי, כפי המשמש באופן שגרתי להכנת מדגם MX, הוא קריוגן יעיל פחות מאשר אתאן ויש לו נטייה גדולה יותר להיווצרות קרח גבישי בתוך מדגם²¹. היווצרות של קרח גבישי, אשר יכול לבזות עקיפה וליצור רעשי רקע, הוא בדרך כלל מקל באמצעות שימוש של תרכובות מגן קריו²³. פולימרים במשקל מולקולרי נמוך כגון פולי-אתילן גליקול (PEG) 400 ומתיל-2,4-פנטנדיול (MPD), סוכרים, שמנים או מלחים רוויים ניתן להוסיף אליקואט של פתרון התגבשות בריכוזים נמוכים²⁴- אין פתרון 'גודל אחד מתאים לכולם' לבחירת קריו-הגנה המתאימה ביותר וזה דורש לעתים קרובות^{אופטימיזציה 25} . הגביש גם עובר מניפולציות מרובות במהלך תהליך הקציר וההגנה מפני הקפאה אשר עלול לגרום נזק לקריסטל, ההזדמנות להשתמש באתאן נוזלי מאפשרת את השמטת צעד זה ומסייעת להגן על שלמות הגביש.

בעוד אתאן נוזלי הוא קריוגן יעיל עבור microcrystals (<10 מיקרומטר) בשל הרזון של המדגם, ישנן שיטות חלופיות למניעת היווצרות קרח גבישי, במיוחד בגבישים גדולים יותר, כולל הפחתת תכולת המים של הגביש על ידי שימוש בסביבה לחה מבוקרת היטב²⁶, או באמצעות פתילת נוזל עודף הרחק הלולאה ואת פני השטח של הגביש²⁷ עם זאת, אלה שוב דורשים מניפולציה גדולה יותר של המדגם., השימוש בכתמים אוטומטיים ומקפיא לצלול עם אתאן נוזלי, כמו cryoTEM, יחד להסיר פתרון התגבשות עודף ולספק אמצעי להבהב microcrystals מגניב באופן מבוקר תוך ניסיון למזער את המניפולציה.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שניתן להשתמש בו לא רק על ידי שני המשתמשים בקו הקרן VMXm ובקווי קרן מיקרופוקוס אחרים כדי לאסוף נתוני עקיפה גבוהים של אותות לרעש, אלא עשויים גם להיות שימושיים למי שמכין דגימות קריסטל חלבון מסיסות וממברנה מבוססת דטרגנט לניסויים במיקרו-ED. בעוד כל המתקנים כדי להכין ולהעריך דגימות זמינים ב- VMXm, מעבדות ביולוגיה מבנית רבות מצוידות יותר ויותר להכנת מדגם cryoTEM. כתוצאה מכך, אנו מדמיינים כי משתמשים מסוימים עשויים לרצות להשתמש במתקנים שלהם כדי להכין את הדגימות שלהם עבור beamtime ב- VMXm.

Protocol

1. התקנת ציוד

הערה: השיטות המתוארות כאן משתמשות בכלי הקפאה צולל עם זרוע סופגת אחת. מכשירים מסוימים מצוידים בשתי זרועות סופגות ואנו ממליצים למשתמש לבדוק את הוראות היצרנים להתאים את המכשיר כך שרק זרוע סופגת אחת נמצאת בשימוש.

1. ודא כי מיקרוסקופ אור ממוקם ליד מכשיר הקפאת הצלילה, באופן אידיאלי, כך הן המיקרוסקופ ומקפיא לצלול נמצאים בהישג יד של המשתמש.
2. יש להגדיר ולקרר את מקפיא הצלילה האוטומטי בהתאם להוראות היצרנים.
   הערה: טמפרטורת תא המדגם צריכה להיות מוגדרת לטמפרטורה שבה הגבישים גדלו. אין להניח נייר סופג בתא הדגימה.
   זהירות: אתאן נוזלי הוא חומר נפץ דליק מאוד ויש להשתמש בו רק באזור מאוורר היטב הרחק ממקורות ניצוץ פוטנציאליים.
3. תוויות של תיבות רשת כראוי ומצננים אותן בנימה קטנה באמצעות חנקן נוזלי.
4. הניחו בזהירות רשתות, צד סרט פחמן למעלה, על נושא מתאים לפירוק זוהר (כגון שקופית מיקרוסקופ זכוכית עטופה בפרפילם).
5. רשתות CryoTEM פריקה זוהרת עבור 25 s ב 0.39 mBar, באמצעות זרם של 15 mA. פריקה זוהרת ממש לפני הרשתות ישמשו. שומרים את הרשתות המשוחררות הזוהרות בצלחת פטרי מכוסה עד שהם מוכנים; אם 30 דקות פג לאחר פריקת זוהר, חזור על זוהר פריקת.
   הערה: עם מקפיא הצלילה מוכן ורשתות מוכנות, תשומת הלב יכולה לפנות לדגימה.

2. קביעת פרמטרי חבטה ראשוניים

1. הגדר את הלחות היחסית של תא המדגם ל -90% ואת זמן הכתם ל 5 s ולוודא כי מקפיא הצלילה מוגדר לצלול באופן אוטומטי את המדגם לאחר סופג הושלמה.
   הערה: פרמטרים התחלתיים אלה מתאימים ביותר למקפיא הצלילה של Leica GP, פרמטרים אחרים כגון כוח סופג זמינים ב- FEI Vitrobot. עם זאת, מניסיוננו שלמות הגביש סביר יותר להישמר על ידי שימוש בזרוע סופגת אחת.
2. כדי להיות מסוגל לאטום את מגש ההתגבשות ברגע שהבאר של עניין נפתחת, לחתוך רצועה קטנה של סרט הדבקה לקפל מעל קצה אחד כדי ליצור כרטיסייה כדי להקל על פתיחת החותם ומניחים בזהירות לצד אחד.
3. חותכים את החותם מעל הבאר המתגבשת, כולל המאגר. עבודה מהירה, להחיל 2-5 μL של פתרון מאגר על הגביש המכיל טיפה כדי לשמור על נפח נוזלי בירידה.
4. השתמש בכרטיסייה של סרט הדבקה כדי לאתם מחדש את הבאר ולוודא שטיפה ההתגבשות לא תתייבש.
5. בעוד לרגע מחזיק את הקלטת פתוחה מעל ההתגבשות היטב, להעביר 10 μL של פתרון המאגר לצינור 0.5 מ"ל לשימוש לשלבים מאוחרים יותר.
6. תאחד מחדש את הבאר.
7. מניחים פיסת נייר סופגת חתוכה מראש על זרוע הכתמים של מכשיר ההקפאה.
8. מניחים רשת זוהרת אחת במלקחיים הקפואים של הצלילה ונטענים לתוך המכשיר כך שצד הפחמן פונה הרחק מזרוע הכתם.
9. ודא שהלחות היחסית בתוך תא הכתמים עומדת על 90%.
10. סובבו את המלקחיים כך שצד סרט הפחמן יפונה לזרוע הנפוחה.
11. באמצעות פיפטה 2.5 μL, להחיל 2 μL של פתרון מאגר מצינור 0.5 מ"ל לצד שאינו תמיכה (נחושת מבריקה) של רשת cryoTEM.
12. סובב את הרשת כך שצד התמיכה בפחמן יפנה הרחק מזרוע הכתם וחזור על התהליך, תוך החלה קפדנית של הנוזל על צד התמיכה בסרט הפחמן של הרשת. הימנעו מלגעת בסרט הפחמן עם קצה הפיפטה כדי לא לפגוע בסרט הפחמן. הנוזל צריך להתפשט על פני הרשת בשל החיוב שהופקד במהלך פריקת זוהר.
13. הפעל את תהליך הכתם תוך התבוננות ברשת. טווח צפייה זמין ב- Leica GP2 למטרה זו.
14. שים לב אם הנוזל נמשך מפני השטח הפחמנים של הרשת בתקופה זו, זה מתחיל עם רוב בולוס נוזלי על הרשת משטח החוצה כמו הנוזל הוא מרושע דרך הרשת. כמו הנוזל בכל ריבוע רשת מצטמצם עוד יותר, גל של "popping" על פני השטח של הרשת ניתן לראות. אם אפקט זה נצפה, סופג ניתן לעצור בתוך 2-3 s של סיום אפקט popping. אין צורך לצלול את רשת הבדיקה אשר ניתן להשליך.
15. אם לא נצפה אפקט "popping" כביכול, חזור על שלבים 2.11-2.14, בכל פעם הארכת זמן הכתם ב- 1-2 s עד שאפקט הקפיצה נצפה ממש לפני שזרוע הכתם נסוגה מהרשת. שים לב הפעם לשלב 3.
    הערה: חשוב כי סופג מפסיק ברגע אפקט פיצוץ זה התרחש כדי להבטיח כי במהלך התהליך, גבישים לא להתייבש מ סופג יתר. השתמש בתמיסת התגבשות מהמאגר לכתם אחורי ודילול המדגם, שכן הוא מבטיח כי הגבישים כפופים לפתרון עקבי, מה שמפחית את הסיכון לערער את הקריסטלים.

3. קצירת גבישים

1. מניחים את לוח ההתגבשות מתחת למיקרוסקופ האור וממקם היטב את המטרה בתוך שדה הראייה.
2. מניחים רשת פריקה רעננה וזוהרת במלקחי המקפיא של הצלילה ומרכיבים את המלקחיים במקפיא הצלילה, כשצד סרט הפחמן פונה הרחק מזרוע הכתם.
3. סובבו את המלקחיים כך שצד סרט הפחמן יפונה לזרוע הנפוחה.
4. באמצעות פיפטה 2.5 μL, להחיל 2 μL של פתרון מאגר מצינור 0.5 מ"ל לצד שאינו תומך של רשת cryoTEM ולסובב את הרשת כך צד התמיכה סרט פחמן פונה היציאה לדוגמה של מקפיא הצלילה.
5. לקלף בחזרה את החותם הזמני עם pipette להגדיר 2 μL, בעדינות לשאוף את טיפת התגבשות שוב ושוב כדי להשעות את microcrystals (חשוב לא להציג בועות אוויר לטיפה).
   הערה: חשוב להתבונן בתהליך זה תחת מיקרוסקופ האור כדי להבטיח כי גבישים משתחררים מכל עור פני השטח או הבסיס של הבאר. אם הגבישים תקועים ולא נמשכים עם שאיפה, או קצה פיפטה או כלי התגבשות אחרים כגון מחט דיקור סיני, ניתן להשתמש כדי להפיץ בעדינות את הגבישים. בהתאם לגודל הגבישים ועומק השדה של מיקרוסקופ האור, לפעמים ניתן לראות, באמצעות המיקרוסקופ, את הגבישים הנכנסים לקצה הפיפטה.
6. מעבירים 2 מיקרו-אל של תרחיף מיקרוקריסטלי שאפתני למקפיא הצלילה ומחילים את כל הדגימה על צד הפחמן של רשת cryoTEM.
7. כתם לזמן שנקבע בשלב 2 ומיד ליזום צלילה הקפאה. בעת הכתם, התבונן בהתרחשות של אפקט גל פיצוץ על-פני הרשת ושים לב אם זה קרה לחלוטין על-פני הרשת. נוכחות של גבישים יכולה להשפיע על זמן הכתם הראשוני, וייתכן שיהיה צורך להתאים את זה לרשתות הבאות על ידי 1-2 s.
8. עבודה מהירה, להעביר את הרשת מן האתאן הנוזלי לתיבת הרשת שקוע חנקן נוזלי. שאריות אתאן יכול להפוך מוצק לבן אטום על הרשת כאשר הוא נכנס חנקן נוזלי. כדי להפחית זאת, להסיר את הרשת בהתמדה מן האתאן הנוזלי, ולאחר מכן להעביר במהירות למאגר חנקן נוזלי.
9. לאחר 4 רשתות הונחו בתיבת הרשת, לאבטח את המכסה של התיבה עם הבורג ולהעביר אותו או dewar קצף של חנקן נוזלי כדי לאפשר הערכה מדגמית נוספת עם מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM) או dewar אחסון חנקן נוזלי באמצעות מיכל אחסון מתאים.

4. הערכת צפיפות דגימה על ידי מיקרוסקופיה קלה

זהירות: שיטה זו הרסנית. אם יש זמינות מוגבלת של מדגם, כגון טיפת התגבשות אחת או שתיים בלבד, מומלץ לדלג על שלב זה. לאחר צלילה הקפאת דגימות (שלב 3.7) ניתן להעריך את התפלגות הגבישים על פני הרשת.

1. הר רשת cryoTEM יבשה בטמפרטורת החדר במלקחיים של מקפיא הצלילה והנח את המלקחיים בצד שלהם על מיקרוסקופ האור, עם הרשת בשדה הראייה. הגדר הגדלה ומיקוד מתאימים כך שניתן יהיה לפתור את כל הרשת ואת ריבועי הרשת הבודדים.
2. בצע את השלבים 3.1-3.7.
3. במקום להעביר את הרשת לתיבת הרשת (שלב 3.8), יש לסגת מהרשת הצוללת מהאתאן הנוזלי על ידי איפוס המקפיא.
   זהירות: הרשת והדגימה יתחממו לטמפרטורת החדר ולא ניתן יהיה להשתמש בהם לניסויי עקיפה נוספים.
4. הסר את המלקחיים מכלי ההקפאה של הצלילה.
5. תוך החזקת הרשת בתוך המלקחיים, הנח את הרשת מתחת למיקרוסקופ האור - המוקד כבר יוגדר בערך.
6. בצע מיקוד עדין ולהעריך את צפיפות הגבישים על פני הרשת. רשת טובה תכיל כמה גבישים מבודדים הרחק מסורגי הרשת בתוך כל ריבוע רשת וגוש גבישים הוא מינימלי.
7. כאשר צפיפות הגבישים בתוך הרשת גורמת לגוש גבישים עם מעט גבישים מבודדים בלבד, מדללים עוד יותר את שומן הגביש עם תמיסת המאגר וחוזרים על שלב 3. יש לדאוג בעת דילול דגימות, כך דילול לא לגרום לפירוק של הגבישים.
8. לדלל את הגבישים בשלבים באמצעות נפחים קטנים של 0.5-1 μL.

5. הערכה לדוגמה על ידי סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים

הערה: הכנה Microcrystal על רשתות cryoTEM מוערך בצורה הטובה ביותר עם מיקרוסקופיה אלקטרונית סריקה (SEM) בתנאים קריוגניים, זה יכול להיות מושגת עם SEM מצויד עם שלב הקפאה. ב- VMXm, נעשה שימוש ב- JEOL JSM-IT100 SEM (מקור טונגסטן) עם מנעל אוויר PP3006 של Quorum והקפאה. כדי להבטיח נזק קרינה מינימלי בעת הצגת דגימות על VMXm^28,29, ההגדרות הבאות משמשות: 5 kV האצת מתח; גודל ספוט של 40 (יחידות שרירותיות על JEOL JSM-IT100); מרחק עבודה של 10 מ"מ. תמונות נרשמות באמצעות גלאי האלקטרונים המשני, ליישור מדגם ומיקוד זמן השתהות של 0.8 מיקרו μs משמש בעוד תמונות ברזולוציה גבוהה של גבישים בודדים נלכדים באמצעות זמן התעכבות של 16 μs. חשוב לפני טעינת דגימה לתוך SEM כי המיקרוסקופ מיושר לפי הוראות היצרן. מומלץ כי רק רשת אחת נטענת לתוך SEM בעוד כל הרשתות הנותרות מוכן עם אותם פרמטרים שמורים לניסויי עקיפה רנטגן.

1. הכן את ה- SEM על-ידי קירור שלב ההקפאה לדוגמה ל- -180 °C בהתאם להוראת היצרן. בצע את ההוראות לטעינת רשתות cryoTEM למערכת הספציפית הזמינה.
2. כאשר המדגם נטען ב- SEM, הפעל את קרן האלקטרונים, ישר מדגם והגדר את המוקד באמצעות הגדלה גבוהה (זמן השתהות של 0.8 מיקרו- μs).
3. ראשית, בצע את ההערכה הראשונית עם כל הרשת בתצוגה בהגדלה נמוכה (x45). הקלט תמונה בהגדלה זו.
4. הגדל את ההגדלה כדי לאפשר בדיקה מדוקדקת יותר של ריבועי רשת בודדים, גבישים בודדים צריכים להיות מאוד ברורים לצפייה.
5. נוע סביב הרשת, לכידת תמונות סטילס (16 μs זמן השתהות) של גבישים להבטיח שהם עומדים בדרישות הבאות לפני שתמשיך:
   1. ודא שהרשתות שטוחות, וסרט התמיכה בפחמן שלם ברובו.
   2. ודא כי ישנם גבישים בודדים רבים עם הילה צרה של נוזל מנווט סביב הגביש.
   3. ודא כי החורים בסרט תמיכה בפחמן נראים לעין.
   4. ודא כי אין אזורים גדולים של נוזל מנוזל כפי שהוגדר על ידי מראה כהה וחלק.
   5. ודא שיש מעט קרח משושה, אם אין, או קרח פני השטח מפוזרים על פני הרשת.
   6. ודא כי גבישים מופצים באופן שווה על פני סרט התמיכה ואינם חופפים.
6. בשלב זה, למדוד במדויק את הממדים של מספר גבישים כדי לאפשר מתאם מדויק בגודל קרן רנטגן במהלך ניסויי עקיפה מאוחרים יותר.
7. דגימות שניתן לאחזר באופן אמין מן SEM ולשמור בטמפרטורות קריוגניות ניתן להשתמש מאוחר יותר לניסויי עקיפה רנטגן. אם זה לא אפשרי, להיפטר דגימות אלה.
   הערה: בעוד הדמיה הן את הרשת כולה והן מיקרו-קריסטלים בודדים (הגדלה של x45 ו- x700 בהתאמה), יש לבצע הערכה אם להמשיך לקו הקורה עם רשתות שהוכנו באמצעות אותם פרמטרים או אם ייתכן שיהיה צורך בהסתגלות במהלך שלב 3. הרשתות צריכות לעמוד במבחנים המתוארים בשלב 5.5. אם הרשתות אינן עומדות בקריטריונים אלה, נדרש מיטוב נוסף במהלך שלב 3 לפני חזרה על שלב 5.

6. הכנת רשת לניסויי עקיפה ב- VMXm

1. קרר את המספר הנדרש של מחזיקי מדגם VMXm (איור 4A)(עד 5) טעון לתוך מחסנית המדגם (עם מכסה) עם מטעין מדגם dewar קצף גדול (איור 4B) באמצעות חנקן נוזלי - זה יכול לדרוש נפח גדול של חנקן נוזלי. רמת החנקן הנוזלי צריכה להיות ממש מעל מיקום המדגם על מטעין המדגם.
2. הכן צירפים וכלים.
3. מקם כלים כולל כלי חיתוך, מלקחיים ומלקחיים מדגם VMXm, לתוך חורים בטוען הדגימה כדי להתקרר. זה יכול להיות שימושי כדי לארגן זרקור מעל dewar.
4. העבר במהירות את תיבת הרשת המכילה את הרשתות הטעונות microcrystal לתיבת הרשת ההפסקה על מטעין המדגם ולפתוח את המכסה כך שהוא רופף וניתן לסיבוב (אל תסיר).
5. תחת חנקן נוזלי להסיר את המכסה מן המחסנית מדגם עם מלקחיים גדולים ומניחים אותו מתחת מטעין המדגם.
6. השתמש במלקחיים מדגם VMXm כדי להרים את מחזיק המדגם על מטעין המדגם, להבטיח כי המחזיק פונה כלפי מעלה, כך שהוא יכול לקבל רשת. כאשר במצב הנכון, סיכה קטנה על מטעין המדגם תיצור אינטראקציה עם החור הקטן באמצע מחזיק המדגם.
7. עם המלקחיים הדקים המקוררים, הרימו בזהירות את הרשת מתיבת הרשת והעבירו קרוב לפתיחת הרשת על מחזיק המדגם. סובב את הרשת כך שהיא תשכב שטוחה (זה לא משנה לאיזה כיוון צד סרט התמיכה פונה).
8. הוריד בעדינות את המלקחיים כך שהרשת תהיה קרובה ככל האפשר מעל פתח הרשת (היזהר לא לכופף את הרשת) ולשחרר את הרשת לתוך הפתח. אם הרשת אינה יושבת כראוי, השתמש בזהירות במלקחיים העדינים כדי לדחוף את הרשת למיקום או להקיש בעדינות על מחזיק הדגימה עם המלקחיים הגדולים יותר.
9. הנח במהירות את כלי הצירליפ מקורר מראש על הרשת בפתיחת הרשת והשב את הצירק על-ידי לחיצה על הכפתור. זה יכול להיות מועיל ליישם 2 שקעים של הכפתור כדי להבטיח את circlip יושב כראוי.
10. למעלה את החנקן הנוזלי כך שהרמה היא ~ 1.5 ס"מ מעל מחזיק המדגם. באמצעות מלקחיים מדגם VMXm, הרם בזהירות את מחזיק המדגם הטעון למעלה ומעל הסיכה הקטנה על מטעין המדגם ובחזרה למחסנית הדגימה. שים לב למספר המיקום של בעל המדגם במחסנית לדוגמה.
11. המשך לטעון רשתות למחזיקי הדגימה עד שכל הדגימות ייטענו.
12. החזר את תיבות הרשת לפירוק גודל האחסון אם הדגימות נשארות בפנים והסר את מטעין הדגימה מההפיכת ההקלה כדי ליצור שטח נוסף.
13. החלף את מכסה המחסנית על המחסנית, והבטח שהסיכה בחלק העליון של המחסנית תתנגש עם החור במכסה.
14. מצננים וממלאים את מנעל האוויר VMXm עם חנקן נוזלי ומניחים ליד קצף dewar המכיל את מחסנית מדגם טעון.
15. באמצעות כלי מחסנית VMXm, בזהירות לעסוק בכלי ברכסים בצד של המחסנית במהירות להרים את המחסנית לתוך dewar מנעל האוויר.
16. ודא כי רמת החנקן הנוזלי מכסה את המחסנית.
17. הנח את המכסה על dewar מנעל האוויר והמשיך לתחנת הקצה VMXm עם מחסנית הדגימה שנטענה.
    הערה: טעינת מחסנית הדגימה לתחנת הקצה VMXm תבוצע על-ידי צוות קו הקרן.

תוצאות

מטרת פרוטוקול זה היא להשיג מיקרוקריסטלים מבעבעים עם נפח מינימלי של נוזל המקיף את הגביש המאפשרים ניסויי עקיפה של קרני רנטגן עם פיזור רקע מינימלי כדי לשפר את אות עקיפה. תמונות SEM לדוגמה של מיקרו-קריסטלים שהוכנו ברשתות cryoTEM לפיזור רקע מינימלי מוצגות באיור 1A, B ובאיור 2. רשתות עם גבישים בודדים מבוזרים באופן שווה יספקו את השימוש היעיל ביותר ברשת, עם אות לרעש טוב. עם זאת, הדבר אינו אפשרי בדרך כלל לאורך כל הרשת ואזורים מסוימים עשויים להציג כמות מסוימת של גושים(איור 2A,B). למרות הגוש הזה, דוגמאות אלה עדיין מציגות מספר שימושי של גבישים בודדים מבודדים שיספקו עקיפה עם רקע נמוך (איור 5). רמת הנפיחות שעדיין שומרת על פיזור נמוך ברקע יכולה להשתנות. כתמים חזקים כך החורים בסרט התמיכה בפחמן נראים בבירור אבל הגבישים נשארים hydrated היא המטרה (איור 2C,D). עם זאת, רשתות באיכות טובה עדיין יכולות להציג נוזל כלשהו בתוך החורים של סרט התמיכה אם כי המיקום של החורים עדיין צריך להיות מזוהה (איור 2A,B). חשוב לציין, כל הדוגמאות הללו מציגות גבישים בודדים ומבודדים עם הילה מנוצלת של נוזל המקיפה את הגביש כדי לשמור על הידרציה בין סופג להקפאה.

דגימות רבות עשויות לדרוש אופטימיזציה נוספת (איור 3), אשר יכול לכלול וריאציה של זמן הכתם או הריכוז של microcrystals. רשתות עמוסות בגבישים יפגינו יעילות סופגת מופחתת ועלולים לגרום לכך שנרשמו סתתים מרובים בתמונות עקיפה בודדות (איור 3A,B). תנאי התגבשות צמיגים נוספים, כגון זה של טריפסין המכיל 8% PEG 4000 ו-15% אתילן גליקול(איור 3C),עלולים לגרום לצורך בזמני חלוקה ארוכים יותר (>10 s). לעומת זאת, תנאי התגבשות עם צמיגות נמוכה מאוד שנפגמים מהר מאוד, יכולים לסבול מבעיות הפצה עקב כוח המשיכה הגורמות להתיישבות לפני שמתרחשת סופגת, וכתוצאה מכך כל המיקרו-קריסטלים מתיישבים בצד אחד של הרשת (איור 3D).

הכנה אופטימלית של דגימות מאפשרת לנצל את מלוא היכולות של VMXm כדי לאסוף נתוני עקיפה באיכות גבוהה של קרני רנטגן ברזולוציה הגבוהה ביותר האפשרית עם איתות לרעש גבוה (איור 5). דגימות אלה נהנות מלהיות תואמות לסביבת הדגימה in-vacuo, וכתוצאה מכך ספירת רקע נמוכה מאוד או אפס ממוצעת בתמונות עקיפה. השימוש באתאן נוזלי, ללא מגן קריו, גורם להיעדר טבעות קרח (איור 5),אם כי היכן שהגבישים מונחים קרוב לסורגי רשת הנחושת, קרן הרנטגן יכולה להציץ בסורגים וכתוצאה מכך טבעות עקיפה של אבקת נחושת ב- ~ 2.1 Å ו- ~ 1.8 Å.

איור 1: השוואה בין הרכבה מיקרו-קריסטלית על תושבות מיקרומש ורשתות cyoTEM. סריקת מיקרוגרפים אלקטרונים של מיקרוקריסטלים קפואים לצלול של polyhedral וירוס מדידה 2.5 מיקרומטר על פני (A, B) 5 kV האצת מתח, גודל ספוט של 39 (יחידות שרירותיות) וזמן השתהות של 16 מיקרומטר. הרשת נקייה מעודף נוזלים (A), הילה צרה של נוזל נצפית סביב הגבישים (B). אותן דגימות המותקנות על מיקרומש (20 מיקרומטר צמצם) לפני קירור הבזק בחנקן נוזלי ונצפתה באמצעות מערכת הצפייה על הציר בקו הקרן I24 פנים אל פנים (C) ובצד על (D). העיוותים האופטיים (C) בעת צפייה פנים אל פנים נותנים אינדיקציה להיקף העובי הנוזלי על פני המיקרומש, הדבר ברור יותר בעת הצגת המיקרומש בצד(D). המטרה האדומה ב-C ו-D מייצגת את מיקום וגודל קרן הרנטגן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: דוגמאות לדגימות באיכות טובה. גבישי Polyhedra (A) נצפו על פני ריבוע רשת יחיד ~ 100 מיקרומטר. בעוד שחלק מהגבישים מעט מגובשים ומראים קישוריות מסוימת של הנוזל שמסביב, ישנם מספר גבישים בודדים מבודדים עם הילה קטנה של נוזל המקיפה את הגביש. גבישי אינסולין מעט גדולים יותר (B) מדידה ~ 5 x 5 מיקרומטר גם להראות כמה גושים אבל שוב יש גבישים בודדים מבודדים היטב. גבישי מחט יכולים להיות ממד צר מאוד ודורשים microbeam, כגון אלה בצורת מחט גבישי ליזוזים (C). רצועת נוזל צרה ניתן לראות סביב גבישים אלה (הילה אפורה בהירה). מיקרוקריסטלים גדולים יותר עד עשרות מיקרונים יכולים גם להיות מותקנים היטב על רשתות cryoTEM, כגון גבישי חלבון ~ 7 מיקרומטר K (D). הן(C)והן (D) ובמידה פחותה יותר ב- (A), החורים של סרט התמיכה בפחמן נראים בבירור, ומדגים את נוכחותם של מעט מאוד / ללא נוזלים. לדוגמה B, בעוד שלא נצפו חורים ריקים, עדיין ניתן לזהות את מיקום החורים, מה שמצביע על כך שהנוזל רק ממלא את החורים בסרט התמיכה. בכל הדוגמאות הללו, הילה של נוזל ניתן לראות סביב קצה ריבוע הרשת (ריבוע פנימי מעוגל), שבו החורים יש מראה אפור בהיר יותר. זוהי תכונה נפוצה של רשתות מוכנות היטב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: דוגמאות לדוגמה הדורשות מיטוב נוסף. רשתות עמוסות במיקרו-קריסטלים(A, B)יכולות להגביר את פיזור הרקע כאשר הדגימות חוסמות את החורים בסרט התמיכה המפחיתות את יעילות הכתמים, ועם מתח משטח גבוה יותר בין הגבישים נשאר נוזלים נוספים. כמו גם השפלה באות לרעש וכתוצאה מכך אובדן מידע, סביר להניח כי סתימות מרובות יירשמו. באמצעות זמן סופג שאינו ארוך מספיק, או פתרון התגבשות צמיג מאוד יכול לגרום מדגם רטוב מדי (C), גם לייצר אות לרעש נמוך. תנאי התגבשות ללא משקעים, כגון אלה לאינסולין בקר (D), יש צמיגות נמוכה מאוד. בעוד זה גורם זמן סופג קצר מאוד, זה יכול גם לגרום לתנועה של גבישים על פני הרשת לפני ובמהלכו סופג בשל ההשפעות של כוח המשיכה. התוצאה היא בדרך כלל רשת ריקה ברובה עם ריכוז גבוה של גבישים לאורך קצה אחד (D). זה יכול להיות יתרון להוסיף סוכן צמיג כגון אתילן גליקול לסלעת הגביש זמן קצר לפני החלתם על הרשת כדי להפחית את זרימת הגביש ולשפר את התפלגות הגבישים. זה יכול גם להאריך את זמן הכתם, מה שמקל על התבוננות בכתמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: כלים לטעינת דגימה ב-VMXm. ערכת כלים מותאמת במיוחד תוכננה לטעון את מחזיקי מדגם VMXm (A). למטען לדוגמה (B) יש מקום עבור מחזיק דגימה VMXm יחיד, תיבת רשת ואחסון כלים במהלך העבודה. הוא גם נועד לאפשר עבודה ממש מתחת לפני השטח של החנקן הנוזלי ולאפשר מחסנית המדגם להתאים מתחת (B). מנעל האוויר dewar (C), אשר מתאים את תיבת גז חנקן מנעל האוויר בתחנת הקצה VMXm, משמש כדי לקחת את מחסנית מדגם טעון מהמעבדה לכלוב ניסיוני beamline. כדי להציג דוגמאות ב- SEM הלא מקוון, נעשה מעבורת מותאמת אישית (D) המורכבת ממחזיק הדגימה VMXm ללא בסיס כדי לאפשר הערכה במחזיק המדגם המשמש בקו הקרן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: עקיפה לדוגמה ממיקרו-קריסטלים ב-VMXm. תמונת עקיפה אחת שתועדה באמצעות גלאי פילטוס 3 6M ב- VMXm של גביש פוליהדרלי של וירוס ~ 3 מיקרומטר המותקן על רשת cryoTEM בשיטת הקפאת הצלילה. עקיפה נצפתה מעבר 1.7 Å והשתקפות (ריבוע כחול) ב 1.74 Å הוא inset, מדגים את פיזור הרקע הנמוך, עם מספר גבוה של פיקסלים עם אפס ספירות. אתילן גליקול לריכוז סופי של 50% v/v נוספה לתחבולת הגביש לפני החלתה על הרשת. אופי הרקע הנמוך של מיקום המדגם VMXm מודגם על ידי הרקע הקבוע לאורך התמונה כפי שמוצג על ידי עוצמות המותרות מתחת לקו המקווקו הכחול, אפילו ליד מרכז הקרן. העוצמה המותווה מראה שהרקע נשאר מתחת ל-3 ספירות. שתי טבעות קלושות נצפות ב 2.15 Å ו 1.86 Å אשר נוצרים על ידי עקיפה אבקה של הנחושת של רשת cryoTEM. אין טבעות קרח לגילוי, המדגים את האפקטיביות של סופג ואחריו קירור עם אתאן נוזלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

פרוטוקול זה מדגים כיצד כלים מהכנת מדגם cryoTEM יכולים לשמש להכנת מיקרוקריסטלים לניסויי עקיפה של קרני רנטגן בקווי קרן מיקרופוקוס. מכשור קו קרן סטנדרטי מרוכז סביב מדגם רכוב על סיכה ובעוד נעשו מאמצים לספק תמיכה לדוגמה על תושבות אלה עבור microcrystals, הם לעתים קרובות מאתגר לטעון עם מדגם תוך הקפדה כי האות הגבוה ביותר לרעש מושגת (איור 1C,D). רבות מהדגימות הללו עשויות גם לדרוש אופטימיזציה של תנאי ההגנה מפני הקפאה כדי להבטיח את המדגם הוא הזגום. שיטת הקפאת הצלילה מספקת דרך חוזרת להסיר נוזלים עודפים ולקרר את המדגם בקריוגן יעיל(איור 1A,B). בעוד שהרשת יכולה להיות מותקנת על קו קרן סטנדרטי עם הרכבה על פינים על פינצטה, מחזיקי דגימת VMXm תוכננו במיוחד כדי לקבל רשתות ולהחזיק אותם מתחת לטמפרטורת המעבר מזכוכית בסביבת ואקום באמצעות קירור מוליך. הסביבה לדוגמה של VMXm מאפשרת איסוף נתוני רקע נמוך, כאשר המדגם הוא המקור הנותר של הרקע, ומספק מיקרואורגניזמים שניתן להשתמש בו כדי להתאים גבישים עם ממדים פחות מ 10 מיקרומטר. שיטת הכנת מדגם זו יכולה לשמש גם להכנת nanocrystals עבור עקיפה אלקטרונים שבו יש גם דרישה נוזל עודף מעט מאוד מדגם הזגוגית בשל חדירה חלשה של אלקטרונים. בעוד רשתות cryoTEM שבריריות, אלה מנוסים בקציר של גבישים בלולאות יסתגלו במהירות לטיפול ברשתות. עם כמות קטנה של ניסיון, כמה רשתות יאבדו במהלך שלבי הכתם, ההקפאה והעמסה של הפרוטוקול. עם זאת, שלבי האופטימיזציה חיוניים להצלחה זו והכנה זהירה יפחיתו את הסיכויים לאבד גבישים או להפחית את שלמות הגביש.

רשתות CryoTEM מספקות הרכב יחיד גדול יחסית שיכול להכיל מאות רבות של גבישים, ובכך לשפר את התפוקה שבה ניתן רק לתעד טריז קטן של נתוני עקיפה. רשת אחת עשויה גם לספק מספיק גבישים כדי לקבוע את מבנה החלבון, במיוחד בגבישים של סימטריה גבוהה. כאשר רק טיפת התגבשות אחת או שתיים בודדות יצרו מיקרוקריסטלים, ניסיון כתמים של מצב התגבשות לבד יכול לעזור להבטיח כי כאשר microcrystals הם blotted, הזמנים המשמשים קרובים ככל האפשר לאלה הדרושים כדי ליצור דגימות באיכות טובה ראשונית. תומכי סרט הפחמן אינם נראים לצילומי רנטגן וזמינים עם מרווח חורים שונה, אשר ניתן להשתמש בהם כדי להתאים למורפולוגיה מסוימת. בדרך כלל אנו משתמשים בסרטי תמיכה עם 2 חורי מיקרומטר בריווח של 2 מיקרומטר, אך חורים קטנים יותר עם מרווח גדול יותר עשויים להתאים יותר לגבישים הקטנים מ- 2 מיקרומטר. סרטי תמיכה אחרים כגון אלה עם חורי 1 מיקרומטר עם מרווח של 4 מיקרומטר, כמו גם סרטי תמיכה עם חורים בצורת שונה זמינים, כל אלה ישפיעו על זמן הכתם. רשת רשת מרובעת בגודל של 200 (200 ריבועים לאינץ') מספקת גם מספיק מקום (~ 100 מיקרומטר) בין מוטות רשת הנחושת, כך שקרן הרנטגן אינה מקיימת אינטראקציה חזקה עם הנחושת תוך מתן תמיכה מבנית מספקת לסרט הפחמן העמוס בגבישים. השימוש באתאן נוזלי שולל את הצורך cryoprotectants, אשר בתורו מפחית את הדרישה על נפח המדגם כי היה בשימוש באופטימיזציה של תנאים cryoprotectant.

הפרמטרים העיקריים שיש למטב במהלך התהליך הם זמני הכתם ודילול המדגם. זמני הכתמים צריכים להיות ארוכים מספיק כדי לצפות בהשפעה 'קופצת' על פני כל הרשת לפני הקפאת הצלילה. סופג מעל יכול לגרום להתייבשות של הגבישים, עם זאת, שליטה על הלחות בתוך תא המדגם משמש כדי למזער את האפקט הזה. אמנם הוא הציע כי לחות יחסית של 90% בשימוש, כמה דגימות עשוי להפיק תועלת אופטימיזציה של הלחות. הלחות עשויה להשפיע על יעילות הכתם של נייר סופג אשר יכול לאט להיות רווי במים. בנוסף, בקרת לחות בתוך תא המדגם יכול לשמש כדי לשפר את איכות עקיפה של גבישים³⁰. מומלץ לבצע שינויים קטנים (<5%) בלחות לפני בדיקת תקינות עקיפה כדי להבטיח שאיכות עקיפה לא תיפגע.

אופטימיזציה של דגימות לא יקרות יכולה להתבצע באמצעות מיקרוסקופ אור במקום SEM. למרות הרסני, זה שימושי להערכת צפיפות הגבישים על פני הרשת ולאפשר קבלת החלטות אם מדגם צריך להיות מדולל או מרוכז כדי לפזר טוב יותר גבישים על פני הרשת. שלב זה הוא שימושי ביותר כאשר יש מספר רב של גבישים זמינים במיוחד דגימות מרוכזות מאוד. יש להימנע מהתנגשות של גבישים (איור 3),שכן אמנם אין בעיה משמעותית אם שני גבישים מוארים בו זמנית במהלך איסוף הנתונים^6,אך סביר להניח שיהיה נפח גדול יותר של נוזל המקיף את הגוש, ובכך להפחית את האות לרעש(איור 5). בעוד שניתן לצפות בהפרזות גדולות של נוזל ברחבי העולם על פני הרשת באמצעות מיקרוסקופ אור, הערכת נפח הנוזל המקיף את microcrystals ואת נוכחותו של קרח גבישי יכול להיעשות רק באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים מצויד מערכת העברת ואקום קריוגני שלב. לפעמים, לאחר יישום הגבישים לרשת ולפני סופג מתרחשת, גבישים בפתרונות צמיגות נמוכה עשויים להתיישב לאורך קצה אחד של הרשת. גילינו שהוספת ריכוז סופי של 50% של אתילן גליקול יכולה להאט את תנועת הגבישים דרך הטיפה, להבטיח חלוקה טובה יותר של מיקרוקריסטלים ברחבי הרשת, כמו גם לספק שליטה רבה יותר על הכתמים על ידי הגדלת זמן ההכתמה (איור 3D).

כמה פתרונות התגבשות המכילים סוכני מזרז צמיג כגון PEGs במשקל מולקולרי גבוה יכול להוכיח מאתגר כתם, הדורש יותר ויותר פעמים סופגות ארוכות (>10 s). במקרים כאלה, זה יכול להיות מועיל כדי להפחית את נפח הנוזל המופקד על הגב של הרשת, כמו גם את נפח של הגביש המכיל פתרון לצד סרט התמיכה של הרשת. אסטרטגיות כגון שימוש 2 שכבות של נייר סופג או סיבי זכוכית עשוי גם לסייע blotting במקרים קשים אלה³¹.

בעוד צינור זה מתאים גבישי חלבון מסיסים, אלה שנוצרים במדיומים צמיגים מאוד כגון חלבוני ממברנה ב LCP מציגים אתגר אחר שעבורו פרוטוקול זה אינו מתאים. עם זאת, אסטרטגיות מתגבשות להכנת גבישי LCP על רשתות cryoTEM עבור microED הכוללים הפחתת הצמיגות של הדגימות על ידי גרימת שינוי פאזה LCP. הדבר מאפשר להחיל את הדגימות על רשתות באופן דומה לזה המתואר במאמר זה. לבסוף, המדגם יכול להיות כרסום עם קרן יון ממוקדת כדי להסיר עודף חומר שאינו קריסטל^32,33,34.

בסך הכל, צינור זה ייקח בדרך כלל 1-2 שעות (כולל זמן התקנת ציוד) לעקוב מן המדגם המגיע VMXm כדי לספק רשתות ממוטבות עם דגימות מפוזרות היטב, vitrified, בהתאם לזמינות מדגם, ריכוז הגבישים ואת הצמיגות של פתרון התגבשות. שיטות אלה כבר הועסקו בהצלחה להכנת microcrystals לניסויי עקיפה קרני רנטגן לחקור נזקי קרינה על microcrystals שבו נפח מינימלי של נוזל סביב המדגם היה חיוני^28,35. יש לציין כי הפרוטוקול יכול להיות מיושם על כל דגימות microcrystal מסיס, לא רק כדי לנטרל היטב דגימות שכבר עברו אופטימיזציה. ניסוי התגבשות המייצר חומר microcrystalline באופן מסורתי יהיה יעד לאופטימיזציה במטרה להשיג גבישים גדולים יותר, עם זאת, שיטת הכנת מדגם זו ואת היכולות של VMXm עשוי לאפשר איסוף נתונים נאותים מדגימות כאלה ללא אופטימיזציה נוספת. לחלופין, אם דגימות microcrystalline כאלה diffract בצורה גרועה, הנתונים שנאספו מ- VMXm באמצעות שיטת הכנה מדגם זה עדיין יכול לשמש מדריך שימושי לאופטימיזציה נוספת של תנאי התגבשות. הכלים להכנת רשתות, כולל פריקת זוהר והקפאת צלילה זמינים כעת באופן נרחב במכוני מחקר המצוידים בניסויי cryoTEM ויהיו זמינים למשתמשים רבים המאפשרים להם להכין דגימות לקראת זמן הקרן ב- VMXm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automated Cryo-EM plunge freezing instrument	Leica or ThermoFisher	Various
Benchtop light microscope with light source	Various	Various
Blade/Scalpel	Fisher Scientific	Various
CryoTEM Copper 200 mesh grids with carbon support film with 2 µm holes	Quantifoil	N1-C16nCu20-50
CryoTEM grid storage boxes	Agar Scientific	AGG3727
ddH2O	n/a	n/a
Ethane gas supply	n/a	n/a
Ethylene Glycol	Acros Organics	146750010
Glass microscope slides	FisherBrand	12383118
Glass petri dish	FisherBrand	455732
Glow discharging device	Pelco	91000S
Laboratory wrapping film (Parafilm)	Bemis	HS234526B
Large and small, fine forceps	Agar Scientific	Various
Liquid nitrogen supply	n/a	n/a
Pipette tips	Various	Various
Pipetting devices	Various	Various
Sealing tape for crystallisation plates.	Molecular Dimensions	MD6-01
Small/medium liquid nitrogen dewars	Spearlab	Various
Sprung circlip clipping tool	Subangstrom	SCT08
Whatmann No.1 pre-cut filter paper	Leica	16706440