ניטור צמיחה דינמית של כלי רשתית במודל עכבר רטינופתיה המושרה על ידי חמצן

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת להכנה וצביעה אימונופלואורסצנטית של תושבות שטוחות רשתית של עכברים וניתוח. השימוש באנגיוגרפיה פלואורסצנטית פונדוס (FFA) עבור גורי עכברים ועיבוד תמונה מתוארים בפירוט גם כן.

Abstract

רטינופתיה הנגרמת על-ידי חמצן (OIR) נמצאת בשימוש נרחב לחקר צמיחת כלי דם חריגה במחלות רשתית איסכמיות, כולל רטינופתיה של פגות (ROP), רטינופתיה סוכרתית מתרבה (PDR) וחסימת ורידים ברשתית (RVO). רוב מחקרי OIR מתבוננים בניאו-וסקולריזציה של הרשתית בנקודות זמן ספציפיות; עם זאת, הצמיחה הדינמית של כלי שיט בעכברים חיים לאורך מסלול זמן, החיונית להבנת מחלות כלי הדם הקשורות ל-OIR, לא נחקרה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שלב אחר שלב להשראת מודל עכבר OIR, המדגיש את המלכודות הפוטנציאליות, ומספק שיטה משופרת לכימות מהיר של אזורים של מחיקת כלי דם (VO) וניאו-וסקולריזציה (NV) באמצעות צביעת אימונופלואורסצנציה. חשוב מכך, עקבנו אחר צמיחה מחדש של כלי דם בעכברים חיים מ-P15 עד P25 על-ידי ביצוע אנגיוגרפיה פלואורסצנטית פונדוס (FFA) במודל עכבר OIR. היישום של FFA למודל העכבר OIR מאפשר לנו לבחון את תהליך השיפוץ במהלך צמיחה מחדש של כלי שיט.

Introduction

ניאו-וסקולריזציה של הרשתית (RNV), המוגדרת כמצב שבו כלי דם פתולוגיים חדשים מקורם בוורידים קיימים ברשתית, משתרעת בדרך כלל לאורך המשטח הפנימי של הרשתית וגדלה לתוך הזגוגית (או החלל התת-קרקעי בתנאים מסוימים)¹. זהו סימן היכר ומאפיין נפוץ של רטינופתיות איסכמיות רבות, כולל רטינופתיה של פגות (ROP), חסימת ורידים ברשתית (RVO) ורטינופתיה סוכרתית מתפשטת (PDR)².

תצפיות קליניות וניסיוניות רבות הצביעו על כך שאיסכמיה היא הגורם העיקרי לניאו-וסקולריזציה של הרשתית ^3,4. ב- ROP, ילודים נחשפים לחמצן ברמה גבוהה באינקובטורים סגורים כדי להגדיל את שיעורי ההישרדות, שהוא גם מניע חשוב לעצירת צמיחת כלי הדם. לאחר סיום הטיפול, הרשתיות של תינוקות חווים תקופה היפוקסית יחסית⁵. מצבים אחרים נראים בחסימה של ורידים ברשתית מרכזית או מסועפת ב- RVO ונזק של נימי הרשתית נצפה גם אשר נגרמת על ידי מיקרואנגיופתיה ב PDR². היפוקסיה מגבירה עוד יותר את הביטוי של גורמים אנגיוגניים כגון גורם גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF) דרך מסלול האיתות המושרה על ידי היפוקסיה-1α (HIF-1α) אשר בתורו מנחה את תאי אנדותל כלי הדם לגדול לתוך האזור ההיפוקסי וליצור כלי דם חדשים ^6,7.

ROP הוא סוג של רטינופתיה שגשוגית וסקולרית בפגים וגורם מוביל לעיוורון ילדות^8,9, המאופיין בהיפוקסיה ברשתית, ניאו-וסקולריזציה של הרשתית והיפרפלזיה סיבית^10,11,12. בשנות ה-50 של המאה ה-20, חוקרים מצאו כי ריכוז גבוה של חמצן יכול לשפר באופן משמעותי את התסמינים הנשימתיים של פגים^13,14. כתוצאה מכך, טיפול בחמצן היה בשימוש הולך וגובר בפגים באותה תקופה¹⁵. עם זאת, במקביל לשימוש הנרחב בטיפול בחמצן בפגים, שכיחות ה-ROP עלתה משנה לשנה. מאז, חוקרים קישרו חמצן ל-ROP, וחקרו מודלים שונים של בעלי חיים כדי להבין את הפתוגנזה של ROP ו-RNV¹⁶.

באדם, רוב התפתחות כלי הדם ברשתית מסתיימת לפני הלידה ואילו במכרסמים כלי הדם ברשתית מתפתחים לאחר הלידה, ומספקים מערכת מודל נגישה לחקר אנגיוגנזה בכלי הדם ברשתית². עם ההתקדמות המתמשכת של המחקר, מודלים של רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן (OIR) הפכו למודלים מרכזיים לחיקוי אנגיוגנזה פתולוגית הנובעת מאיסכמיה. אין מיני בעלי חיים ספציפיים במחקר של מודל OIR והמודל פותח במיני בעלי חיים שונים, כולל חתלתול 17, חולדה¹⁸, עכבר¹⁹, גור ביגל 20 ודג זברה²¹. כל המודלים חולקים את אותו מנגנון שבאמצעותו הם נחשפים להיפראוקסיה במהלך התפתחות הרשתית המוקדמת ולאחר מכן מוחזרים לסביבה הנורמוקסית. סמית' ואחרים הבחינו בכך שחשיפת גורי עכברים להיפרוקסיה מ-P7 במשך 5 ימים גרמה לצורה קיצונית של רגרסיה של כלי הדם ברשתית המרכזית והחזרתם לאוויר החדר ב-P12 עוררה בהדרגה ציצים ניאו-וסקולריים, שגדלו לכיוון הגוף הזגוגי¹⁹. זה היה דגם עכבר OIR סטנדרטי שנקרא גם כמודל סמית'. Connor et al. המשיכו לייעל את הפרוטוקול וסיפקו שיטה ישימה אוניברסלית לכימות האזור של VO (מחיקה של vaso) ו- NV (neovascularization) בשנת 2009, מה שהגדיל את הקבלה והניצול של מודל²². מודל עכבר OIR הוא עדיין המודל הנפוץ ביותר כיום בגלל גודלו הקטן, רבייה מהירה, רקע גנטי ברור, יכולת חזרה טובה ושיעור הצלחה גבוה.

בעכברים, כלי הדם ברשתית מתחילים לאחר הלידה עם צמיחה של כלי דם מראש עצב הראייה לתוך הרשתית הפנימית לכיוון ora serrata. במהלך התפתחות רשתית תקינה, כלי הרשתית הראשונים נובטים מראש עצב הראייה סביב הלידה, ויוצרים רשת מתרחבת (מקלעת ראשונית) המגיעה לפריפריה סביב היום שלאחר הלידה 7(P7)²³. לאחר מכן כלי הדם מתחילים לגדול לתוך הרשתית כדי ליצור שכבה עמוקה, לחדור את הרשתית, וליצור רשת למינרית סביב השכבה הגרעינית הפנימית (INL) כמו באדם²⁴. בסוף השבוע השלישי שלאחר הלידה (P21), פיתוח מקלעת עמוקה יותר כמעט הושלם. עבור מודל עכבר OIR, חסימת כלי הדם מופיעה תמיד ברשתית המרכזית בגלל התנוונות מהירה של מספר רב של רשתות כלי דם לא בשלות באזור המרכז במהלך חשיפה להיפרוקסיה. לכן, הצמיחה של neovascularization פתולוגי מתרחשת גם ברשתית ההיקפית האמצעית, שהיא הגבול של האזור שאינו זלוף ואת אזור כלי הדם. עם זאת, כלי רשתית אנושיים כמעט נוצרו לפני הלידה. באשר לפגים, הרשתית ההיקפית אינה וסקולרית לחלוטין כאשר היא נחשפת להיפרוקסיה^25,26. אז חסימת כלי דם וניאו-וסקולריזציה מופיעות בעיקר ברשתית ההיקפית^27,28. למרות הבדלים אלה, מודל OIR העכבר משחזר מקרוב את האירועים הפתולוגיים המתרחשים במהלך ניאו-וסקולריזציה הנגרמת על ידי איסכמיה.

ניתן לחלק את האינדוקציה של מודל OIR לשני שלבים²⁹: בשלב 1 (שלב היפרוקסיה), התפתחות כלי הדם ברשתית נעצרת או מפגרת עם חסימה ורגרסיה של כלי הדם כתוצאה מהירידה ב- VEGF והאפופטוזיס של תאי האנדותל ^24,30; בשלב 2 (שלב ההיפוקסיה), אספקת החמצן ברשתית תהפוך לבלתי מספקת בתנאי אוויר בחדר²⁹, החיוניים להתפתחות עצבית ולהומאוסטזיס ^19,31. מצב איסכמי זה גורם בדרך כלל לניאו-וסקולריזציה לא מפוקחת ולא תקינה.

נכון לעכשיו, שיטת המידול הנפוצה היא חשיפה לחמצן גבוה/נמוך לסירוגין: אמהות והגורים שלהן נחשפים ל-75% חמצן במשך 5 ימים ב-P7 ולאחר מכן 5 ימים באוויר החדר עד ש-P17 הדגים תוצאות דומות²², שהיא נקודת הקצה של אינדוקציה של מודל עכבר OIR. (איור 1). בנוסף להדמיית ROP, זה neovascularization פתולוגי בתיווך איסכמיה יכול לשמש גם כדי לחקור מחלות רשתית איסכמיות אחרות. המדידות העיקריות של מודל זה כוללות כימות השטח של VO ו- NV, אשר מנותחים מתוך תושבות שטוחות רשתית על ידי צביעת אימונופלואורסצנציה או זלוף FITC-dextran. כל עכבר יכול להיחקר רק פעם אחת בגלל הפעולה הקטלנית. כיום, ישנן כמה שיטות לבחון שינויים דינמיים של כלי הדם ברשתית ברציפות במהלך תהליך של רגרסיה וסקולרית ואנגיוגנזה פתולוגית³². במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט של אינדוקציה של מודל OIR, ניתוח של תושבות שטוחות ברשתית, כמו גם זרימת עבודה של אנגיוגרפיה פלואורסצנטית פונדוס (FFA) על עכברים אשר יהיה מועיל להשיג הבנה מקיפה יותר של שינויים דינמיים של כלי הדם במהלך שני שלבים של מודל עכבר OIR.

Protocol

כל ההליכים הכרוכים בשימוש בעכברים אושרו על ידי ועדת האתיקה הניסויית בבעלי חיים של מרכז העיניים Zhongshan, אוניברסיטת סון יאט-סן, סין (מספר מורשה: 2020-082), ובהתאם להנחיות המאושרות של ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של מרכז העיניים Zhongshan והצהרת האגודה לחקר ראייה ועיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים בחקר עיניים וראייה.

1. אינדוקציה של מודל OIR עכבר

1. השתמש בעכברים עם שיעור נמוך יותר של מום מולד בעיניים, למשל עכברי C57BL/6J, והזדווג איתם ביחס של זכר/נקבה = 1:2. קבלו את הגורים שנולדו באותו היום והתחילו לגרום למודל OIR ב-P7. תעדו את משקל הגוף של גורי עכברים בקפדנות לפני הדוגמנות.
   הערה: שים לב ליום הלידה כ- P0. רשום את המשקל של כל עכבר באופן קבוע. משקל הגוף של גורים שזה עתה נולדו חשוב מאוד במהלך אינדוקציה של OIR כמו הרגישות של עכברים במצבים שונים לחמצן שונה. אל תכלול את הגורים במשקל של יותר מ-5 גרם ב-P7 כדי להבטיח תוצאות דומות.
2. לספק סביבת מחיה מתאימה לאמהות מניקות ולגורים שלהן, כגון קביעת הטמפרטורה על 23 מעלות צלזיוס ± 2 מעלות צלזיוס, שליטה על הלחות ב -40%-65%, לסירוגין 12 שעות של אור ו -12 שעות של חושך מדי יום, הוספת צמר גפן לכלוב לקינון, הבטחת מזון ומים מעוקרים מספיקים, ושמירתם בכלובים מאווררים בנפרד (IVC).
3. עקוב אחר רמת הלחות והטמפרטורה בתוך התא. לשלוט על הלחות בין 40% ל 65% ולשמור על הטמפרטורה ב 23 °C ± 2 °C (76 °F).
4. בדוק את אספקת החמצן באמצעות חיישני חמצן, שמור על רמת חמצן קבועה של 75% ושלוט בקצב זרימת החמצן ב 0.5-0.75 ליטר לדקה. שים 50 גרם סודה ליים בתחתית התא כדי לספוג CO2 עודף ולשמור על ערכי CO2 מתחת 3%²².
5. עקוב אחר התנהגויות של אמהות מניקות כגון התנהגות בניית קן, נשיכת הגורים שלהן וסירוב להנקה לפחות פעם ביום. לחסל אמהות מיניקות עם אמהות ענייה.
6. הכניסו את גורי ה-P7 (זכר ונקבה) ואת האימהות המניקות שלהם לתא חמצן שבו רמת החמצן היא 75% למשך 5 ימים עד P12. הימנע פתיחה מיותרת של החדר במהלך תקופת אינדוקציה המודל. יש לוודא כי ישנן אמהות פונדקאיות נוספות להחלפה, למקרה שהאמהות המניקות ימותו עקב פגיעה בריאות בזמן שהן נמצאות בהיפרוקסיה.
   הערה: כדי להבטיח את יכולת ההשוואה של הניסוי, הגבל את המספר ל-6-8 גורים עבור כל אם. שימו לב לבעיה הפוטנציאלית של רעילות חמצן, הגורמת למוות של כמה אמהות מיניקות. הסימנים לפגיעה ריאתית היפראוקסית אצל אמהות מניקות כוללים, בין היתר, תנודות בקצב הנשימה, ירידה בפעילות וירידה בהאכלה. כאשר התופעה הנ"ל מתרחשת, להרדים את האם המניקה עם 1% נתרן pentobarbital (50 מ"ג / ק"ג) בהקדם האפשרי. הכינו כמה אמהות פונדקאיות, למשל, 129S1/SvImJ להחלפה והשתמשו בהן רק במידת הצורך. לא מומלץ להחליף אמהות מניקות כשגרה, שכן הדבר יוביל לפתיחה תכופה של תא חמצן, וכתוצאה מכך לרמות חמצן לא יציבות ותוקפנות אימהית.
7. החזירו את הגורים ואת אמהותיהם המניקות לאוויר החדר ב-P12 ועקבו אחר משקלם של כל הגורים ברציפות עד ל-P17. קבץ את הגורים לפי המשקל כדי להבטיח שלכל קבוצת ניסוי תהיה חלוקת משקל דומה.

2. הכנת תושבות שלמות ברשתית וכתמים אימונופלואורסצנטיים

1. רשמו את משקל הגוף של הגורים. הקריבו את הגורים על ידי מנת יתר של חומר הרדמה (1% נתרן פנטוברביטל 50 מ"ג/ק"ג) או שאיפת CO₂ . שיטות אחרות של המתת חסד, כגון פריקת צוואר הרחם וכריתת בית החזה הדו-צדדית, ניתן להשתמש במידת הצורך.
2. השתמש במספריים מעוקלים כדי לשחרר את הקשר בין גלגלי העין לרקמה מסלולית. לאחר מכן, הכניסו מלקחיים מעוקלים לחלק האחורי של גלגל העין, הידקו את עצב הראייה והרימו במהירות את העין מהמסלול. יש לשטוף את גלגלי העיניים במלח זרחתי (PBS) מקורר מראש כדי להסיר את השיער והדם מפני השטח של גלגלי העיניים.
3. הניחו את גלגלי העיניים המנוקים בצינור מיקרוצנטריפוגה בגודל 2 מ"ל מלא ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר במהירות של 12-15 סיבובים לדקה (סל"ד) (קיבוע ראשוני).
   אזהרה: פרפורמלדהיד ידוע כאלרגני, רעיל בדרך כלל וציטוטוקסי ביותר. יש להקפיד על הוראות הבטיחות ולהימנע משאיפה וממגע עם העור.
4. השתמשו בצלחת תרבית והכניסו טיפה של 1x PBS לחלק המרכזי ובצעו את השלבים הבאים תחת מיקרוסקופ מנתח והניחו גלגל עין אחד בטיפה זו. החזיקו את גלגל העין עם זוג מלקחיים ונקבו בזהירות את הקרנית בלימבוס הקרנית באמצעות מחט מזרק של 1 מ"ל. מכניסים את קצה המספריים לחור הזה וחותכים את הקרנית בזהירות לאורך הלימבוס של הקרנית. היזהר לא לחתוך את הרשתית.
5. הסר את הקשתית ואת העדשה עם זוג מלקחיים. לאחר מכן מניחים את ה-eyecup הנותר ב-PFA של 4% ומתקנים שוב למשך 45 דקות נוספות בטמפרטורת החדר על שייקר במהירות של 12-15 סל"ד (קיבוע משני).
6. השתמשו בצלחת תרבית והכניסו טיפה של 1x PBS לחלק המרכזי. מניחים את גלגל העין הקבוע בטיפה זו. החזיקו את גלגל העין עם זוג מלקחיים. מפרידים בעדינות את שכבות הרשתית והסקלרה באמצעות שני מלקחיים. מניחים את קצה המספריים בין שכבות הרשתית והסקלרה וחותכים את הסקלרה לכיוון עצב הראייה. מקלפים את הסקלרה מהרשתית ומקבלים את הרשתית.
   הערה: החזיקו את הגביע האחורי על ידי עצב הראייה בעזרת מלקחיים, ולאחר מכן השתמשו בקצה המעוקל של מלקחיים נוספים כדי ללחוץ על הסקלרה בראש עצב הראייה ולעסות בעדינות את הרשתית בתנועת טאטוא קדימה כחלופה לשחרור הרשתית.
7. השתמשו במלקחיים כדי לשחרר את החיבור בין כלי היאלואיד רדיאליים לרשתית ההיקפית, הידקו את שורש כלי ההיאלואיד הקרוב לראש עצב הראייה, וחתכו את כלי הדם ההיאלואידיים בזהירות.
8. יש להשתמש בפיפטה של 2 מ"ל כשהקצה חתוך כדי להעביר את הרשתית. מניחים את הרשתית לתוך באר אחת בצלחת של 48 באר ושוטפים אותה במשך 3 x 5 דקות עם 1x PBS בטמפרטורת החדר על שייקר במהירות של 12-15 סל"ד.
9. לדגום את הרשתית בתמיסה מעורבת של 1% טריטון X-100 (ב-PBS) ו-5% סרום חמור רגיל (ב-PBS) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
   1. לחלופין, יש לחסום ולחדור לרשתיות בטמפרטורת החדר למשך שעה כחלופה. שינוי סרום חוסם בהתאם למקור הנוגדן המשני.
10. אם מתייגים את כלי הדם ברשתית באמצעות איזולקטין B4, דגרו את הרשתית בבאר של 48 סרום חמור רגיל עם סרום חמור רגיל של 0.1% (400 μL) ואיזולקטיןB4-594 (1:400) למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על שייקר במהירות של 12-15 סל"ד.
    הערה: אם אתה מתייג את כלי הדם עם סמנים אחרים, כגון CD31, או מתייג תאים אחרים, השתמש בנוגדנים ראשוניים ספציפיים כדי לסמן אותם.
11. לדגום את הרשתית עם נוגדנים ראשוניים ספציפיים 1:100-1:500 (בסרום חמור רגיל של 400 μL 0.1%) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על שייקר במהירות של 12-15 סל"ד למשך 48 שעות (אופציונלי)
12. לאחר החזרה לטמפרטורת החדר, יש לשטוף את הרשתית עם 0.1% PBST (0.1% TritonX-100 ב-PBS) למשך 3 x 20 דקות על שייקר במהירות של 12-15 סל"ד.
13. לדגום את הרשתית עם 1:1,000 נוגדנים משניים (ב 400 μL 0.1% סרום חמור רגיל) לילה ב 4 מעלות צלזיוס על שייקר במהירות של 12-15 סל"ד. (אופציונלי)
    1. לחלופין, יש לדגור על הרשתית עם נוגדנים משניים בעלי זיקה גבוהה בטמפרטורת החדר למשך שעה.
14. דגרו את הרשתית עם DAPI (1:1,000) בטמפרטורת החדר למשך 20-25 דקות כדי לסמן את הגרעין.
    הערה: בדוק את יחסי הדילול האופטימליים עבור כל הנוגדנים המשמשים בשלבים 10-11 ו- 13-14 לפני הניסוי.
15. שטפו את הרשתית במשך 3 x 30 דקות עם PBST של 0.1% על שייקר במהירות של 12-15 סל"ד בטמפרטורת החדר.
16. מעבירים את הרשתית למגלשה נקייה כשהפתח פונה כלפי מעלה. חתכו את הרשתית באופן רדיאלי בעמדות 3, 6, 9 ו-12 מהיקפית למרכז על ידי חיתוך במרחק של כ-1-1.5 מ"מ מראש עצב הראייה.
17. הוסיפו כמה טיפות של 1x PBS כדי לשטוף את הרשתית שלוש פעמים. השתמש בנייר מונח אוויר כדי לייבש ולשטח את הרשתית. הוסיפו טיפה של מדיום הרכבה (ראו טבלת חומרים) למרכז הכיסוי והפסיקו להוסיף אותה עד שקוטר הטיפה יעלה למחצית מהכריכה. הפכו במהירות את הכיסוי והניחו אותו על גבי הרשתית החיצונית. הימנעו מיצירת בועות.
18. צלם תמונות של התושבות השטוחות של הרשתית או אחסן והגן על השקופיות מפני אור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

3. ניתוח וכימות של תושבות שטוחות רשתית

הערה: עבור מודל עכבר OIR, החוקרים רושמים לעתים קרובות את האזור של חסימת כלי הדם ברשתית המרכזית ואת הניאו-וסקולריזציה הפתולוגית של הרשתית ההיקפית במהלך P12-P25. מחקרים קודמים הראו כי האזור הווסקולרי המרכזי של הרשתית מגיע למקסימום ב- P12 ומתכווץ בהדרגה מ- P13 ל- P17; במקביל, הרשתית של עכברי OIR מגיעה לשיא אזור הניאו-וסקולריזציה בסביבות P17^22,29. מ- P17, הניאו-בסים נסוגים בהדרגה וכלי הדם הפונקציונליים צומחים מחדש לאזור הוואסקולרי. כלי הדם ברשתית בעצם חוזרים לנורמה ב-P25³³.

1. צלם תמונות של תושבות שטוחות רשתית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ראו טבלת חומרים) עם עדשה אובייקטיבית של פי 10. ראשית, בחר את ערוץ DAPI וקבע את ראש עצב הראייה במרכז שדה הראייה. לאחר מכן, התאימו ערוצים אחרים והתמקדו בכלי הדם השטחיים של הרשתית. בדוק אריחים בתוכנת תמונות (ראה טבלת חומרים) והגדר את מספר התמונות שיש לתפור. לחץ על התחל ניסוי כדי ללכוד את כל הרשתית.
2. השתמש בתוכנית עיבוד תמונה (ראה טבלת חומרים) כדי לכמת את האזור של מחיקת כלי דם (VO) וניאו-וסקולריזציה (NV) לאחר צביעת אימונופלואורסצנציה.
   1. ראשית, לחץ על הכלי מטה הקסם והגדר סובלנות מתאימה בהתאם להבדל הבהירות והזז את הסמן לרקע ולחץ על העכבר. לאחר מכן, בחר הפוך כדי לקבל חלוקה לרמות בסיסית של הרשתית. השתמש בכלי לאסו כדי להמשיך ולתאר את פרטי הרשתית. באמצעות פונקציית היסטוגרמה , רשום את ערך הפיקסלים של הרשתית כולה וכתוב אותו או צור טבלה בתוכנית מסד נתונים.
   2. מחלקים את תמונת הרשתית לארבעה רבעים. בכל רבע, השתמשו בכלי לאסו כדי לצייר את אזור ה-VO (איור 2A-C), והשתמשו בכלי מטה הקסם כדי לבחור את אזור ה-NV (איור 2D-F). באמצעות נתוני הפיקסלים בהיסטוגרמה, חשב את יחס הפיקסלים של VO ו- NV לכל הרשתית, כלומר, אחוז שטח VO או NV ביחס לרשתית כולה.
      הערה: יש גם צינור קוד פתוח ואוטומטי לחלוטין לכימות אזורי VO ו- NV בתמונות OIR באמצעות רשתות עצביות של למידה עמוקה (http://oirseg.org/), המספק דרך אמינה וחוסכת זמן לחוקרים, כמו גם מאחד את הסטנדרט של הכימות³⁴.
3. הקלט נתוני פיקסלים בטבלת גיליון אלקטרוני, הנוחה לניתוח הבא.

4. הדמיית In vivo עם אנגיוגרפיה פלואורסצנטית פונדוס (FFA)

הערה: עבור עכברי OIR, ניתן להשתמש הן בפרפוזיה של FITC והן בכתמים אימונופלואורסצנטיים רק פעם אחת בגלל מותם של חיות ניסוי. בהשוואה לכך, אחד היתרונות של FFA הוא תצפית על השינויים הדינמיים של כלי הרשתית של עכברים במהלך הפיתוח והמצב הפתולוגי in vivo^35,36.

1. שקלו את הגורים לפני ההרדמה.
2. הרדמת גורים בהזרקה תוך-צפקית של 0.3% נתרן פנטוברביטל במינון של 30-50 מ"ג/ק"ג.
   הערה: לעכברים בתוך חודש אחד, שימו לב למינוני ההרדמה. השתמש בריכוזים ובמינונים נמוכים יותר של חומר הרדמה כדי להפחית את מותם של עכברים הנגרם על ידי הרדמה. לאחר הרדמת הגורים, השתמשו בכרית חימום קטנה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף. היפותרמיה לא רק משפיעה על התפקוד הפיזיולוגי של הגורים, אלא גם מובילה לשינויים בקריסטלין ומאיצה את התפתחות הקטרקט.
3. השתמשו ב-20 μL טיפות עיניים מידריאטיות (0.5% טרופיקמיד + 0.5% פנילפרין הידרוכלוריד) עבור כל גור והמתינו 5 דקות כדי להשיג התרחבות אישונים לאורך זמן (איור 3A,B).
4. הביאו את הגורים המורדמים לפני מכשיר ההדמיה (ראו טבלת חומרים). השאירו את הגורים על כרית חימום קטנה, הניחו את הגורים בתנוחה יציבה והשתמשו בקרעים מלאכותיים באופן קבוע כדי לשמור על לחות בקרנית. לחץ על מצב הדמיית פונדוס אינפרא אדום (IR) כדי להתאים את ראש עצב הראייה למרכז המסך.
   הערה: כאשר מתבוננים בעין אחת של הגורים, אל תשכחו להגן על העין השנייה. השתמשו בטיפות עיניים היפרומלוז כדי למנוע מהקרנית להלבין עקב יובש.
5. לאחר הזרקה תוך צפקית של 0.15 מ"ל תמיסת מלח נתרן פלואורסצין 0.5%, לחץ על כפתור FA ועל כפתור ההזרקה מיד בלוח המגע של מכשיר ההדמיה כדי להתחיל בתזמון. הקלט את התמונות לאחר 3 דקות כאשר זרימת הדם של הרשתית נכנסת לשלב הוורידי ולבחון את הרשתית לא פחות מ 6-8 דקות.
   הערה: לאחר הזרקה תוך-צפקית של תמיסת מלח נתרן פלואורסצין, העור, הרירית והשתן של הגורים מראים ירוק צהבהב ברור. רוב הפלואורסצין מופרש על ידי הגורים תוך יום. הזרקת נתרן פלואורסצין תוך צפק כל יומיים במשך שש פעמים אינה גורמת לתופעות לוואי משמעותיות³⁷.
6. הזז את ראש עצב הראייה למרכז אזור רכישת התמונה וצלם את התמונה הראשונה של הרשתית המרכזית. לאחר מכן, הזז את העדשה של מכשיר ההדמיה אופקית לצד האף של העין עד שראש עצב הראייה ממוקם בנקודת האמצע של צד אחד של אזור רכישת התמונה וצלם את התמונה השנייה. המשיכו לצלם תמונות של הרשתית הטמפורלית, העליונה והנחותה, בהתאמה בשיטה זו (איור 3C).
   הערה: צלם תמונות "עם חמישה כיוונים" תוך 12 דקות כאשר שלב הרגרסיה מתרחש. המיקום של ראש עצב הראייה בתמונה נחותה מותר לא ליפול על הצד בשל התאמת זווית מוגבלת של העדשה.
7. שמור את התמונות והשתמש בתוכנית עיבוד תמונה לתפירה.

5. עיבוד תמונה של אנגיוגרפיה פלואורסצנטית פונדוס (FFA)

1. פתח את תוכנית עיבוד ההדמיה ולחץ על חדש בקובץ כדי ליצור בד ציור חדש עם רקע שחור (איור 4A).
2. פתחו תמונה של הרשתית המרכזית תחילה בשכבת הרקע. לחץ על קובץ והוסף את התמונה השנייה. התאימו את האטימות של התמונה השנייה ל- 60%, הזיזו את התמונה השנייה ושנו את גודלה עד שאותם חלקים של שתי התמונות יחפפו מאוד. לחץ על הלחצן עבור בין מצבי שינוי צורה ועיקום חופשיים ובצע התאמות עדינות בכלי השיט במידת הצורך. לאחר מכן, החזירו את האטימות של התמונה השנייה ל-100% (איור 4A,B).
3. בחרו שתי תמונות בו-זמנית ולחצו על 'מיזוג שכבות אוטומטי'. בדוק את פנורמה כשיטת המיזוג וכן בחר את שני המשפטים הבאים. לחץ על אישור וסיים את תפירת התמונה של שתי התמונות הראשונות (איור 4C,D).
4. קח את שתי התמונות התפורות הראשונות כמכלול, הוסף את התמונה השלישית והמשך למזג. חזור על השיטות לעיל כדי להשלים את התפירה של חמש תמונות (איור 4E).
5. השתמש בכלי החיתוך כדי לחתוך תמונות של FFA בנקודות זמן שונות לגודל אחיד ולבחון שינויים דינמיים של כלי הדם ברשתית מ- P15 ל- P25 הן בגורים רגילים והן בגורים OIR.

6. ניתוח סטטיסטי

1. הצגת ערכים כממוצע ± סטיית תקן (s.d.).
2. השתמש במבחן t של סטודנט כדי להשוות בין שתי דגימות בלתי תלויות. השתמש ב- ANOVA חד-כיווני כדי להשוות קבוצות מרובות של נתונים ולשלב עם המבחן של Dunnett או Tukey, שהוא מבחן השוואה מרובה נפוץ.
3. עבור נתונים שאינם מופצים בדרך כלל, השתמש במבחן Mann-Whitney U או במבחן Kruskal Wallis. שקול הבדלים סטטיסטיים משמעותיים כאשר P < 0.05.

תוצאות

במודל עכבר OIR, התוצאה החשובה והבסיסית ביותר היא כימות אזור ה- VO וה- NV. לאחר שחיו בסביבת היפרוקסיה במשך 5 ימים מ-P7, הרשתית המרכזית של הגורים הראתה את האזור הגדול ביותר ללא זילוף. תחת גירוי של היפוקסיה בעוד 5 ימים, neovascularization הרשתית הופק בהדרגה אשר פלואורסצנטי בעוצמה רבה יותר מאשר סביב כלי הדם הרג...

Discussion

הרגישות של עכברים ל- OIR מושפעת מגורמים רבים. לא ניתן להשוות בין גורים בעלי רקע גנטי וזנים שונים. בעכברי לבקנים BALB/c, כלי הדם צומחים מחדש לאזור ה-VO במהירות עם הפחתה משמעותית של ציצים ניאו-וסקולריים³⁸, מה שמביא כמה קשיים למחקר. בעכברי C57BL/6 יש נזק מוגבר לפוטורצפטור בהשוואה לזן עכבר BALB...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL sterile syringe	Solarbio	YA0550	For preparation of retinal flat mounts and intraperitoneal injection
1× Phosphate buffered saline (PBS)	Transgen Biotech	FG701-01	For preparation of retinal flat mounts
2 ml Microcentrifuge Tube	Corning	MCT-200-C	For preparation of retinal flat mounts
48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates	Corning	3548	For preparation of retinal flat mounts
Adhesive microscope slides	Various		For preparation of retinal flat mounts
Adobe Photoshop CC 2019	Adobe Inc.		For image analysis
Carbon dioxide gas	Various		For sacrifice
Cover slide	Various		For preparation of retinal flat mounts
Curved forceps	World Precision Instruments	14127	For preparation of retinal flat mounts
DAPI staining solution	Abcam	ab228549	For labeling nucleus on retinal flat mounts
Dissecting microscope	Olmpus	SZ61	For preparation of retinal flat mounts
Fluorescein sodium	Sigma-Aldrich	F6377	For in vivo imaging
Fluorescent Microscope	Zeiss	AxioImager.Z2	For acquisition of fluorescence images of retinal flat mounts
Fluoromount-G Mounting media	SouthernBiotech	0100-01	For preparation of retinal flat mounts
Hydroxypropyl Methylcellulose	Maya	89161	For in vivo imaging
Isolectin B4 594 antibody	Invitrogen	I21413	For labeling retinal vasculature on retinal flat mounts
Mice C57/BL6J	GemPharmatech of Jiangsu Province		For OIR model induction
Micro dissecting scissors-straight blade	World Precision Instruments	503242	For preparation of retinal flat mounts
No.4 straight forceps	World Precision Instruments	501978-6	For preparation of retinal flat mounts
Normal donkey serum	Abcam	ab7475	For preparation of retinal flat mounts
O2 sensor	Various		For monitoring the level of O2
OxyCycler	Biospherix	A84XOV	For OIR model induction
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148-1KG	For tissue fixation
Pentobarbital sodium	Various		For anesthesia
Soda lime	Various		For absorbing excess CO2 in the oxygen chamber
SPECTRALIS HRA+OCT	Heidelberg	HC00500002	For in vivo imaging
SPSS Statistics 22.0	IBM		For statistical analysis
Tansference decloring shaker	Kylin-Bell	ZD-2008	For preparation of retinal flat mounts
Tissue culture dish (Low attachment)	Corning	3261-20EA	For preparation of retinal flat mounts
Transfer pipettes	Various		For preparation of retinal flat mounts
Triton X-100	Sigma-Aldrich	SLBW6818	For preparation of retinal flat mounts
Tropicamide	Various		For in vivo imaging
ZEN Imaging Software	ZEISS		For image acquisition and export