טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ואבולוציה מסתגלת באמצעות מערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית (MMC)

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במערכת תרבית המיקרו-טיפות המיקרוביאלית (MMC) כדי לבצע טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ואבולוציה אדפטיבית. MMC יכול לטפח ולטפח מיקרואורגניזמים באופן אוטומטי ורציף ולנטר באינטרנט את צמיחתם באופן מקוון עם תפוקה גבוהה יחסית והמקבילות טובות, מה שמפחית את צריכת העבודה והריאגנטים.

Abstract

שיטות גידול מיקרוביאליות קונבנציונליות כוללות בדרך כלל פעולות מסורבלות, תפוקה נמוכה, יעילות נמוכה וצריכה גדולה של עבודה וריאגנטים. יתר על כן, לשיטות גידול בתפוקה גבוהה המבוססות על מיקרו-פלטות שפותחו בשנים האחרונות יש מצב גידול מיקרוביאלי ירוד והקבלה ניסיונית בגלל החמצן המומס הנמוך שלהן, תערובת לקויה, אידוי חמור והשפעה תרמית. בשל יתרונות רבים של מיקרו-טיפות, כגון נפח קטן, תפוקה גבוהה ויכולת שליטה חזקה, הטכנולוגיה המיקרופלואידית מבוססת הטיפות יכולה להתגבר על בעיות אלה, אשר שימשה בסוגים רבים של מחקר של טיפוח מיקרוביאלי בתפוקה גבוהה, סינון ואבולוציה. עם זאת, רוב המחקרים הקודמים נשארים בשלב של בנייה ויישום מעבדה. כמה סוגיות מרכזיות, כגון דרישות תפעוליות גבוהות, קשיי בנייה גבוהים והיעדר טכנולוגיית אינטגרציה אוטומטית, מגבילים את היישום הרחב של טכנולוגיה מיקרופלואידית טיפות במחקר מיקרוביאלי. כאן, מערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית אוטומטית (MMC) פותחה בהצלחה על בסיס טכנולוגיה מיקרופלואידית של טיפות, והשיגה שילוב של פונקציות כגון חיסון, טיפוח, ניטור מקוון, תת-טיפוח, מיון ודגימה הנדרשים על ידי תהליך גידול הטיפות המיקרוביאליות. בפרוטוקול זה, Escherichia coli (E. coli) MG1655 מסוג פראי וזן E. coli חיוני למתנול (MeSV2.2) נלקחו כדוגמאות כדי להציג כיצד להשתמש ב- MMC כדי לבצע טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ובעל תפוקה גבוהה יחסית ואבולוציה מסתגלת בפירוט. שיטה זו קלה לתפעול, צורכת פחות עבודה וריאגנטים, ויש לה תפוקה ניסיונית גבוהה ומקבילות נתונים טובות, שיש לה יתרונות גדולים בהשוואה לשיטות טיפוח קונבנציונליות. הוא מספק פלטפורמה ניסיונית זולה, ידידותית לתפעול ואמינה לתוצאה עבור חוקרים מדעיים לביצוע מחקר מיקרוביאלי קשור.

Introduction

גידול מיקרוביאלי הוא בסיס חשוב למחקר מדעי מיקרוביולוגי וליישומים תעשייתיים, הנמצא בשימוש נרחב בבידוד, זיהוי, שחזור, סינון ואבולוציה של מיקרואורגניזמים ^1,2,3. שיטות גידול מיקרוביאליות קונבנציונליות משתמשות בעיקר במבחנות, צלוחיות שייק ולוחות מוצקים כמיכלי גידול, בשילוב עם אינקובטורים רועדים, ספקטרופוטומטרים, קוראי מיקרו-פלטות וציוד אחר לטיפוח, גילוי וסינון מיקרוביאליים. עם זאת, לשיטות אלה יש בעיות רבות, כגון פעולות מסורבלות, תפוקה נמוכה, יעילות נמוכה וצריכה גדולה של עבודה וריאגנטים. שיטות הטיפוח בתפוקה גבוהה שפותחו בשנים האחרונות מבוססות בעיקר על המיקרו-לוחית. אבל למיקרו-פלטה יש רמה נמוכה של חמצן מומס, תכונת ערבוב ירודה, והתאדות חמורה והשפעה תרמית, שלעתים קרובות מובילים למצב צמיחה ירוד ולהקבלה ניסיונית של מיקרואורגניזמים 4,5,6,7; מצד שני, הוא צריך להיות מצויד בציוד יקר, כגון תחנות עבודה לטיפול בנוזל וקוראי מיקרו-פלטות, כדי להשיג טיפוח אוטומטי וזיהוי תהליכים ^8,9.

כענף חשוב של הטכנולוגיה המיקרופלואידית, מיקרופלואידיקה של טיפות פותחה בשנים האחרונות על בסיס מערכות מיקרופלואידיות מסורתיות של זרימה רציפה. זוהי טכנולוגיה מיקרופלואידית של זרימה בדידה המשתמשת בשני פאזות נוזליות בלתי חדירות (בדרך כלל מי שמן) כדי ליצור מיקרו-טיפות מפוזרות ולפעול עליהן¹⁰. מכיוון שלמיקרו-טיפות יש את המאפיינים של נפח קטן, שטח פנים ספציפי גדול, קצב העברת מסה פנימי גבוה, וללא זיהום צולב הנגרם על ידי מידור, והיתרונות של שליטה חזקה ותפוקה גבוהה של טיפות, היו סוגים רבים של מחקרים המיישמים טכנולוגיה מיקרופלואידית של טיפות בטיפוח, סינון ואבולוציה של מיקרואורגניזמים בתפוקה גבוהה¹¹ . עם זאת, יש עדיין סדרה של בעיות מפתח כדי להפוך את הטכנולוגיה microfluidic טיפות פופולרי ויישם באופן נרחב. ראשית, פעולת המיקרופלואידיקה של טיפות היא מסורבלת ומורכבת, וכתוצאה מכך דרישות טכניות גבוהות למפעילים. שנית, טכנולוגיה מיקרופלואידית טיפות משלבת רכיבים אופטיים, מכניים וחשמליים וצריכה להיות קשורה לתרחישי יישום ביוטכנולוגיה. קשה למעבדה או לצוות יחיד לבנות מערכות בקרה מיקרופלואידיות טיפות יעילות אם אין שיתוף פעולה רב-תחומי. שלישית, בגלל הנפח הקטן של מיקרו-טיפות (מפיקוליטר (pL) למיקרוליטר (μL)), נדרש קושי רב כדי להבין את הבקרה האוטומטית המדויקת ואת הזיהוי המקוון בזמן אמת של טיפות עבור כמה פעולות מיקרוביאליות בסיסיות כגון תת-גידול, מיון ודגימה, וקשה גם לבנות מערכת ציוד משולבת¹².

על מנת להתמודד עם הבעיות הנ"ל, פותחה בהצלחה מערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית אוטומטית (MMC) המבוססת על טכנולוגיה מיקרופלואידית טיפות¹³. ה- MMC מורכב מארבעה מודולים פונקציונליים: מודול זיהוי טיפות, מודול זיהוי ספקטרום טיפות, מודול שבב מיקרופלואידי ומודול דגימה. באמצעות אינטגרציה ובקרה של המערכת של כל המודולים, מערכת הפעלה אוטומטית כולל ייצור, טיפוח, מדידה (צפיפות אופטית (OD) ופלואורסצנציה), פיצול, היתוך, מיון של טיפות נקבע במדויק, השגת שילוב של פונקציות כגון חיסון, טיפוח, ניטור, תת-טיפוח, מיון ודגימה הנדרשים על ידי תהליך של טיפוח טיפות מיקרוביאליות. MMC יכול להכיל עד 200 יחידות גידול טיפות משוכפלות של נפח 2-3 μL, אשר שווה ערך ל -200 יחידות גידול של בקבוק שייק. מערכת גידול המיקרו-טיפות יכולה לספק את הדרישות של אי-זיהום, חמצן מומס, ערבוב והחלפת אנרגיה-מסה במהלך צמיחתם של מיקרואורגניזמים, ולענות על הצרכים השונים של מחקר מיקרוביאלי באמצעות פונקציות משולבות מרובות, למשל, מדידת עקומת גדילה, אבולוציה אדפטיבית, ניתוח רב-שכבתי של גורם יחיד, ומחקר וניתוח מטבוליטים (המבוססים על זיהוי פלואורסצנציה)^13,14.

כאן, הפרוטוקול מציג כיצד להשתמש ב-MMC כדי לבצע טיפוח אוטומטי ומיקרוביאלי ואבולוציה אדפטיבית בפירוט (איור 1). לקחנו את Escherichia coli (E. coli) MG1655 מסוג בר כדוגמה כדי להדגים את מדידת עקומת הגדילה ואת זן E. coli החיוני למתנול MeSV2.2¹⁵ כדי להדגים את האבולוציה ההסתגלותית ב-MMC. פותחה תוכנת הפעלה עבור MMC, מה שהופך את הפעולה לפשוטה וברורה מאוד. בכל התהליך, המשתמש צריך להכין את פתרון החיידקים הראשוני, להגדיר את התנאים של MMC, ולאחר מכן להזריק את תמיסת החיידקים ואת הריאגנטים הקשורים לתוך MMC. לאחר מכן, ה-MMC יבצע באופן אוטומטי פעולות כגון יצירת טיפות, זיהוי ומספור, טיפוח ואבולוציה אדפטיבית. הוא גם יבצע זיהוי מקוון (OD ופלואורסצנציה) של הטיפות ברזולוציית זמן גבוהה ויציג את הנתונים הקשורים (אותם ניתן לייצא) בתוכנה. המפעיל יכול לעצור את תהליך הטיפוח בכל עת על פי התוצאות ולחלץ את טיפות המטרה לניסויים הבאים. ה- MMC קל לתפעול, צורך פחות עבודה וריאגנטים, ויש לו תפוקה ניסיונית גבוהה יחסית ומקבילות נתונים טובות, שיש להן יתרונות משמעותיים בהשוואה לשיטות טיפוח קונבנציונליות. הוא מספק פלטפורמה ניסיונית זולה, ידידותית לתפעול וחזקה לחוקרים לביצוע מחקרים מיקרוביאליים קשורים.

Protocol

1. התקנת מכשירים ותוכנה

1. בחרו בסביבה נקייה וסטרילית (כגון ספסל נקי) כחלל קבוע ייעודי ל-MMC. התקן את ה- MMC בהתמדה בחלל.
   הערה: הרחיקו את ה-MMC מהפרעה של שדות חשמליים חזקים, שדות מגנטיים ומקורות קרינת חום חזקים. הימנע מרטט חמור מלהשפיע על רכיבי הגילוי האופטיים. ספק את ספק הכוח של AC220 V, 50 HZ ל- MMC. לפרטים על MMC עיין בטבלת החומרים ובאתר האינטרנט של MMC¹⁶.
2. התקן את תוכנת הפעולה מקובץ MMC.zip
   הערה: צור קשר עם המחברים עבור הקובץ .zip MMC.
   1. צור תיקיה ייעודית ושמור בה את קובץ ה- zip.
   2. צור תיקיה ייעודית נוספת כ"ספריית ההתקנה ". פתח את ה- MMC.zip ושמור את הקבצים בתיקיה החדשה.
      הערה: תצורת המחשב היא הטובה ביותר לעמידה: (1) מערכת ההפעלה Windows 7 64 סיביות ומעלה; (2) מעבד: i5 ומעלה; (3) זיכרון: 4 ג'יגה-בתים ומעלה; (4) דיסק קשיח: 300 ג'יגה-בתים ומעלה (מהירות סיבוב העולה על 7,200 סל"ד או דיסק במצב מוצק).

2. הכנות

1. חברו את מחט המזרק (הקוטר הפנימי הוא 0.41 מ"מ והקוטר החיצוני הוא 0.71 מ"מ), מחבר מהיר A ובקבוק ריאגנט (איור 2C), והצמידו אותם אוטומטית ל-121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
   הערה: פתח מעט את הפקק של בקבוק המגיבים במהלך העיקור. ניתן להכין עוד כמה בקבוקי ריאגנטים בכל פעם לשימוש.
2. השתמש במסנן 0.22 מיקרומטר פוליווינילידן פלואוריד (PVDF) כדי לסנן שמן MMC. מכניסים מראש את השבב המיקרופלואידי (איור 2B) ואת שמן ה-MMC לספסל הנקי ומעקרים אותם על ידי הקרנה אולטרה סגולה למשך 30 דקות לפני השימוש.
   הערה: לפרטים של מחבר מהיר A, בקבוק מגיב, שמן MMC ושבב מיקרופלואידי מתייחסים לטבלת החומרים.
3. התקנת השבב המיקרופלואידי
   1. פתחו את דלת תא הפעולה (איור 2A) והרימו את בדיקת הסיבים האופטיים.
   2. יישרו את חורי השדה החשמלי עם מחטי השדה החשמלי והניחו בעדינות את השבב על מעמד השבב. לאחר מכן הכנס את שתי עמודות המיקום לתוך חורי המיקום והניח את בדיקת הסיבים האופטיים (איור 2D).
   3. חבר את המחבר המהיר A על השבב ליציאה המתאימה של MMC בהתאם למספר המיקום (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). לאחר מכן סגרו את דלת תא הניתוח.
4. יש לחדש את שמן ה-MMC (לכ-80 מ"ל) בבקבוק השמן ולרוקן את נוזל הפסולת בבקבוק הפסולת לפני השימוש.
   הערה: נוזל הפסולת הוא בדרך כלל פסולת אורגנית. יש לעיין בחוקים וברגולציה האזוריים בעת הסילוק, בכפוף לשינויים המבוססים על מערך ניסיוני.

3. מדידת עקומת גדילה ב-MMC

1. הכנה לתמיסת חיידקים ראשונית
   1. עקוב אחר התקנות הסטנדרטיות הקשורות להכנת לוריא-ברטאני (LB) בינוני ואוטוקלב בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
      הערה: רכיבים של מדיום LB: NaCl (10 גרם/ליטר), תמצית שמרים (5 גרם/ל') וטריפטון (10 גרם/ל' ).
   2. מוציאים את זן E. coli MG1655 ממלאי הגליצרול ומטפחים אותו בבקבוקון שייק של 50 מ"ל עם 10 מ"ל בינוני של LB באינקובטור רועד (200 סל"ד) ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5-8 שעות.
      הערה: זמן הטיפוח תלוי בזנים הספציפיים. זה אופטימלי לטפח את הזן לתקופה / שלב לוגריתמי.
   3. דיללו את תמיסת E. coli MG1655 בתרבית עם מדיום טרי ל-OD₆₀₀ של 0.05-0.1 כדי לקבל תמיסת חיידקים ראשונית (הכינו כ-10 מ"ל).
2. לחץ על אתחול כדי לאתחל את MMC. לאחר הופעת ממשק האתחול, הגדר את טמפרטורת הטיפוח כ- 37 °C ואת ערך האות הפוטואלקטרי כ- 0.6 (איור 3A). האתחול ייקח כ-20 דקות.
3. הפעל את מנורת ה- UV (אורך גל 254 ננומטר) במהלך האתחול.
4. הזריקו את תמיסת החיידקים הראשונית ושמן MMC לבקבוק הריאגנטים.
   1. מוציאים בקבוק ריאגנט מעוקר על הספסל הנקי ומהדקים את הפקק.
   2. השתמש במזרק סטרילי 10 מ"ל כדי להזריק 3-5 מ"ל של שמן MMC ממחט המזרק של הצינור הצדדי. הטו וסובבו את בקבוק הריאגנטים באיטיות כדי לגרום לשמן לחדור באופן מלא לדופן הפנימית.
   3. להזריק כ 5 מ"ל של תמיסת חיידקים ראשונית, ולאחר מכן למלא את בקבוק המגיב על ידי הזרקת 5-7 מ"ל של השמן שוב.
   4. שלפו את המחבר המהיר העצמאי A, והכניסו את המחבר המהיר A של בקבוק המגיב למחבר המהיר B כדי להשלים את פעולת הזרקת הדגימה (איור 4A).
5. המתן עד שהאתחול יסתיים ולאחר מכן כבה את מנורת ה- UV (אורך גל של 254 ננומטר).
6. פתח את דלת תא הניתוח, והכניס את בקבוק המגיבים לאמבטיית המתכת.
7. שלף את מחבר C2 של השבב ואת המחבר המהיר A של בקבוק המגיב. חבר את מחבר הצינור הצדדי של בקבוק המגיב למחבר C2 ואת מחבר הצינור העליון למחבר O2. לאחר מכן סגרו את דלת תא הניתוח.
8. לחץ על עקומת גדילה כדי לבחור את הפונקציה של מדידת עקומת גדילה (איור 3A). בממשק הגדרת הפרמטרים, הזן את המספר כ- 15, הפעל את מתג זיהוי ה- OD והגדר את אורך הגל כ- 600 ננומטר. לחץ על התחל כדי להתחיל יצירת טיפות. זה ייקח בערך 10 דקות.
   הערה: כאן, מספר מתייחס למספר הטיפות שיש ליצור. אורך גל מתייחס לאורך הגל של ה-OD שיש לזהותו. הגדר את המספר (מקסימום 200) ואת אורך הגל (350-800 ננומטר) בהתאם לדרישות הניסוי.
9. כאשר חלון קופץ מופיע בממשק הראשי המבקש "הסר את בקבוק המגיבים בין C2 ל- O2, לחץ על לחצן אישור לאחר השלמתו", פתח את דלת תא הפעולה כדי להוציא את בקבוק המגיב ולחבר את מחברי C2 ו- O2.
10. סגור את הדלת ולחץ על הלחצן אישור בחלון הקופץ כדי לטפח באופן אוטומטי את הטיפות ולזהות את ערכי ה- OD.
    הערה: ה- MMC מזהה את ערך ה- OD כאשר הטיפה עוברת את בדיקת הסיבים האופטיים. לכן, תקופת הגילוי תלויה במספר הטיפות שנוצרו.
11. כאשר עקומת הגדילה מגיעה לשלב הנייח, לחץ על לחצן ייצוא נתונים כדי לייצא את נתוני ה- OD. בחר את נתיב שמירת הנתונים וייצא את ערך ה- OD שנרשם במהלך תקופת הטיפוח בתבנית .csv, אשר ניתן לפתוח על-ידי תוכנה מתאימה (לדוגמה, Microsoft Excel). לאחר מכן השתמש בתוכנת מיפוי (לדוגמה, EXCEL ו- Origin 9.0) כדי להתוות את עקומת הגדילה.
    הערה: במהלך תהליך הטיפוח, ניתן ללחוץ על ייצוא הנתונים בכל עת כדי לייצא את נתוני OD של כל הטיפות הנוכחיות.

4. אבולוציה אדפטיבית ב-MMC

1. הכנה לתמיסת חיידקים ראשונית
   1. עקוב אחר התקנות הסטנדרטיות הקשורות כדי להכין את התווך הנוזלי המיוחד ואת הלוחות המוצקים עבור MeSV2.2 ואת autoclave ב 121 °C (74 °F) למשך 15 דקות.
      הערה: עבור הרכיבים של המדיום המיוחד עיין בטבלה 1 ובטבלת החומרים.
   2. טפחו את MeSV2.2 באמצעות הלוח המוצק (קוטר = 90 מ"מ) באינקובטור טמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות. לאחר מכן בחרו מושבה עצמאית וטפחו אותה בבקבוקון שייק של 50 מ"ל עם 10 מ"ל של המדיום הנוזלי המיוחד באינקובטור רועד (200 סל"ד) ב-37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות.
   3. דיללו את תמיסת MeSV2.2 המתורבתת עם המדיום ל-OD₆₀₀ של 0.1-0.2 (ודא שהנפח הכולל אינו פחות מ-10 מ"ל) והמשיכו לטפח אותה בבקבוק השייק במשך 5 שעות כדי להשיג את תמיסת החיידקים הראשונית.
      הערה: MeSV2.2 הוא זן E. coli חיוני למתנול. המדיום הנוזלי המיוחד מכיל 500 מילימול/ל' מתנול, המהווה עקה חזקה עבור MeSV2.2, וכתוצאה מכך צמיחה איטית מאוד. שימו לב שהשגת תמיסת החיידקים הראשונית כאן שונה מזו המתוארת בשלב 3.1.
2. אתחל את ה-MMC כמוסבר בשלבים 3.2, 3.3 ו-3.5.
3. מוציאים שני בקבוקי ריאגנט מעוקרים, שאחד מהם מיועד לתמיסת החיידקים הראשונית והשני מיועד למדיום הטרי. הזריקו את תמיסת החיידקים הראשונית (5 מ"ל), מדיום טרי (12-15 מ"ל) ושמן MMC לבקבוקי הריאגנטים כפי שהוסבר בשלב 3.4.
   הערה: מכיוון שאבולוציה אדפטיבית היא תהליך ארוך טווח הכולל תת-גידולים מרובים, אחסן כמה שיותר מדיום טרי ב-MMC. לא ניתן לחדש את המדיום במהלך ריצת הניסוי.
4. התקינו את שני בקבוקי הריאגנטים ב-MMC כפי שהוסבר בשלב 3.6. התקן את האחד עבור תמיסת החיידקים הראשונית בין מחבר C2 ו- O2 והשני עבור המדיום הטרי בין מחבר C4 ל- O4.
5. לחצו על ALE כדי לבחור את הפונקציה של אבולוציה אדפטיבית (איור 3B). בממשק הגדרת הפרמטרים, הפעל את המתג זיהוי OD .
6. הגדר את המספר כ- 50, אורך גל כ- 600 ננומטר, ריכוז כ - 0%, סוג כזמן, פרמטר כ- 30 שעות וחזרות כ- 99. לחץ על התחל כדי להתחיל יצירת טיפות. זה ייקח בערך 25 דקות.
   הערה: כאן, "ריכוז" מתייחס לריכוז המרבי של גורמים כימיים לאבולוציה אדפטיבית. עבור טיפות שונות, ניתן לממש ב- MMC להציג ריכוזים שונים של גורמים כימיים כדי לספק תנאי גדילה שונים. חשב את הריכוזים המוצגים באמצעות המשוואה הבאה:
   
   כאן "C" מתייחס לריכוז הגורמים הכימיים שהוכנסו לטיפות; "a" מתייחס לריכוז הגורמים הכימיים בבקבוקי המגיבים בין מחבר C4 ל- O4; "b" מתייחס לריכוז הגורמים הכימיים בבקבוקי המגיבים בין מחבר C6 ל- O6; ו-"i" מתייחס לריכוז הזמין. ישנם שמונה ריכוזים זמינים ב- MMC. מכיוון שלגורם הכימי כאן יש ריכוז יחיד (500 mmol/L מתנול) והוא אחד המרכיבים של המדיום, רק בקבוק מגיב אחד המכיל את הגורם הכימי מותקן כאן, והריכוז מוגדר כ-0%. כתב מתייחס למצב של תת-טיפוח, המחולק לשלושה סוגים: מצב זמן, מצב ערך OD ומצב פלואורסצנציה. הראשון פירושו לטפח את הטיפות למשך זמן קבוע ולאחר מכן תת-טיפוח, בעוד ששני האחרונים האמצעים לטפח את הטיפות לערך OD מוגדר מראש / עוצמת פלואורסצנציה ולאחר מכן תת-טיפוח. פרמטר מתייחס לפרמטר הקשור הנדרש בעת בחירת מצב של תת-טיפוח. חזרות מתייחסות למספר תת-הטיפוחים.
7. הסר את בקבוק המגיבים הממוקם בין מחבר C2 ל- O2 כפי שמוסבר בשלב 3.8.
8. שימו לב אם ערכי ה-OD המרביים של הטיפות במהלך כל תקופת טיפוח עלו באופן משמעותי. אם העלייה מתרחשת ועומדת בדרישות הניסוי, לחץ על לחצן ייצוא נתונים כדי לייצא את נתוני ה- OD כפי שמוסבר בשלב 3.9.
   הערה: כאן, תקופת הטיפוח המשני תלויה בפרמטר. לדוגמה, בעת הגדרת סוג כזמן ופרמטר כ- 30 שעות, תקופת הטיפוח המשני היא 30 שעות. במהלך כל תקופת תת-טיפוח, ישנם ערכי ה- OD המרביים של הטיפות. להעריך אם האבולוציה ההסתגלותית עונה על דרישות הניסוי על ידי עלייה של ערכי OD מקסימליים (העלייה תלויה בתהליך הטיפוח בפועל של הזן, למשל, גדל ביותר מ -20%).
   אזהרה: שימו לב אם המדיום הטרי המאוחסן מותש. אם העלייה המשמעותית לא התרחשה גם לאחר שהמדיום מותש, הוציאו את הטיפות הגדלות טוב יותר ובצעו סבב חדש של אבולוציה מסתגלת.
9. חלץ את טיפות המטרה מה- MMC.
   1. לחצו על כפתור הסינון כדי לבחור את הפונקציה של חילוץ טיפות (איור 3C). בחר באפשרות איסוף , לחץ על מספרי טיפות היעד ולאחר מכן לחץ על אישור.
      הערה: סינון טיפות כולל "לאסוף", "להשליך" ו "לחלץ תמיסת זרעים". "תמיסת זרעים לחלץ" פירושה לאסוף את הטיפות הנותרות¹³ לאחר פעולת הטיפוח התת-קרקעית.
   2. המתן עד שהחלון הקופץ יבקש, "אנא שלף את המחבר המהיר של CF והכנס אותו לצינור ה- EP". הכניסו את המחבר המהיר של CF לצינור ה-microcentrifuge לאיסוף בהתאם להנחיות התוכנה ולאחר מכן לחצו על אישור (איור 4D).
   3. לאחר 1-2 דקות, ממשק התוכנה יצוץ חלון חדש המבקש, "אנא הכנס את המחבר בחזרה ולחץ על אישור אם סיים". לאחר מכן, הכנס את המחבר המהיר של CF בחזרה ולחץ על אישור כדי לגרום ל- MMC להמשיך לפעול (איור 4D). כאשר טיפת היעד הבאה מגיעה לאתר זיהוי הטיפות, חזור על 4.9.2-4.9.3 כדי לאסוף אותה.
      הערה: לאחר שכל טיפות המטרה נאספו, ה- MMC ימשיך לטפח את הטיפות הנותרות. אם הטיפוח אינו נחוץ, לחץ על עצור כדי לסיים ישירות את הפעולה.
   4. מחלצים את הטיפה באמצעות פיפטה של 2.5 μL, מפילים אותה על צלחת האגרוס בקוטר 90 מ"מ ומפזרים אותה באופן שווה עם מוט התפשטות זכוכית משולש באורך צדדי של 3 ס"מ. לאחר מכן לטפח אותו באינקובטור טמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות.
   5. בחרו 3-5 מושבות עצמאיות וטפחו אותן בנפרד בצלוחיות שייק 50 מ"ל עם 10 מ"ל של מדיום טרי באינקובטור רועד (200 סל"ד) ב-37 מעלות צלזיוס למשך 48-72 שעות. עקוב אחר התקנות הסטנדרטיות הקשורות כדי לאחסן את תמיסת החיידקים בתרבית בצינור הגליצרול לניסויים הבאים.

5. נקי מה-MMC

1. לאחר השלמת הניסוי, לחץ על עצור כדי להפסיק את כל הפעולות. לאחר מכן לחץ על נקה כדי לנקות את השבב והצינורות. זה ייקח בערך 15 דקות.

תוצאות

פרוטוקול זה משתמש ב-E. coli MG1655 ובזן MeSV2.2 כדוגמאות להדגמת הטיפוח המיקרוביאלי והאבולוציה האדפטיבית החיונית למתנול עם תפוקה אוטומטית ובעלת תפוקה גבוהה יחסית ב-MMC. מדידת עקומת הגדילה שימשה בעיקר לאפיון גידול מיקרוביאלי. האבולוציה ההסתגלותית נערכה על ידי תת-גידול רציף אוטומטי והוספת ריכוז ...

Discussion

פרוטוקול זה מציג כיצד להשתמש במערכת תרבית המיקרו-טיפות המיקרוביאלית (MMC) כדי לבצע טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ואבולוציה אדפטיבית ארוכת טווח. MMC היא מערכת גידול מיקרוביאלית ממוזערת, אוטומטית ובעלת תפוקה גבוהה. בהשוואה לשיטות ומכשירים קונבנציונליים לטיפוח בתפוקה גבוהה של מיקרוביאל בתפוקה גב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm PVDF filter membrane	Merck Millipore Ltd.	SLGPR33RB	Sterilize the MMC oil
4 °C refrigerator	Haier	BCD-289BSW	For reagent storage
Agar	Becton, Dickinson and Company	214010	For solid plate preparation
CaCl2·2H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	20011160	Component of the special medium for MeSV2.2.
Clean bench	Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.	DL-CJ-INDII	For aseptic operation and UV sterilization
CoCl2·6H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10007216	Component of the special medium for MeSV2.2.
Computer	Lenovo	E450	Software installation and MMC control
Constant temperature incubator	Shanghai qixin scientific instrument co., LTD	LRH 250	For the microbial cultivation using solid medium
CuSO4·5H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10008218	Component of the special medium for MeSV2.2.
Electronic balance	OHAUS	AR 3130	For reagent weighing
EP tube	Thermo Fisher	1.5 mL	For droplet collection
FeCl3·6H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10011928	Component of the special medium for MeSV2.2.
Freezing Tube	Thermo Fisher	2.0 mL	For strain preservation
Gluconate	Sigma-Aldrich	S2054	Component of the special medium for MeSV2.2.
Glycerol	GENERAL-REAGENT	G66258A	For strain preservation
High-Pressure Steam Sterilization Pot	SANYO Electric	MLS3020	For autoclaved sterilization
isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG)	Biotopped	420322	Component of the special medium for MeSV2.2.
Kanamycin sulfate	Solarbio	K8020	Component of the special medium for MeSV2.2.
KH2PO4	MACKLIN	P815661	Component of the special medium for MeSV2.2.
Methanol	MACKLIN	M813895	Component of the special medium for MeSV2.2.
MgSO4·7H2O	BIOBYING	1305715	Component of the special medium for MeSV2.2.
Microbial Microdroplet Culture System (MMC)	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-I	Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Microfluidic chip	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-ALE-OD	For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MMC oil	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-M/S-OD	The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	20026118	Component of the special medium for MeSV2.2.
NaCl	GENERAL-REAGENT	G81793J	Component of the LB medium
Na2HPO4·12H2O	GENERAL-REAGENT	G10267B	Component of the special medium for MeSV2.2.
NH4Cl	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10001518	Component of the special medium for MeSV2.2.
Petri dish	Corning Incorporated	90 mm	For the preparation of solid medium
Pipette	eppendorf	2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL	For liquid handling
Quick connector A	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	—	For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Reagent bottle	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-PCB	Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Shake flask	Union-Biotech	50 mL	For microbial cultivation
Shaking incubator	Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.	SKY-210 2B	For the microbial cultivation in shake flask
Streptomycin sulfate	Solarbio	S8290	Component of the special medium for MeSV2.2.
Syringe	JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD	10 mL	Draw liquid and inject it into the reagent bottle
Syringe needle	OUBEL Hardware Store	22G	Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.
Tryptone	Oxoid Ltd.	LP0042	Component of the LB medium
Ultra low temperature refrigerator	SANYO Ultra-low	MDF-U4086S	For strain preservation (-80 °C)
UV–Vis spectrophotometer	General Electric Company	Ultrospec 3100 pro	For the measurement of OD values
Vitamin B1	Solarbio	SV8080	Component of the special medium for MeSV2.2.
Yeast extract	Oxoid Ltd.	LP0021	Component of the LB medium
ZnSO4·7H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10024018	Component of the special medium for MeSV2.2.