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要約

このプロトコルは、微生物微小液滴培養システム(MMC)を使用して、自動微生物培養および適応進化を行う方法を説明しています。MMCは、微生物を自動的かつ継続的に培養および再培養し、比較的高いスループットと良好な並列化で微生物の成長をオンラインで監視し、労力と試薬の消費を削減することができます。

要約

従来の微生物培養方法は、通常、煩雑な操作、低スループット、低効率、および労力および試薬の大量消費を有する。また、近年開発されたマイクロプレートベースのハイスループット培養法は、溶存酸素が低く、混合性が悪く、蒸発や熱の影響が激しいため、微生物の生育状況や実験の並列化が劣っています。小容量、高スループット、強力な制御性などの微小液滴の多くの利点により、液滴ベースのマイクロ流体技術は、ハイスループット微生物培養、スクリーニング、および進化の多くの種類の研究に使用されているこれらの問題を克服することができます。しかし、ほとんどの先行研究は実験室の建設と応用の段階にとどまっています。高い運用要件、高い建設難易度、自動統合技術の欠如などのいくつかの重要な問題は、微生物研究における液滴マイクロ流体技術の幅広い適用を制限しています。ここでは、液滴マイクロ流体技術をベースとした自動微生物微小液滴培養システム(MMC)の開発に成功し、微生物液滴培養の過程で必要な接種、培養、オンラインモニタリング、副耕栽培、選別、サンプリングなどの機能の統合を実現しました。本プロトコールでは、野生型大腸菌(E. coli)MG1655とメタノール必須大腸菌株(MeSV2.2)を例にとり、MMCを用いて自動化された比較的ハイスループットな微生物培養と適応進化を行う方法を詳細に紹介した。この方法は、操作が容易であり、労力および試薬の消費が少なく、高い実験スループットおよび良好なデータ並列性を有し、従来の培養方法と比較して大きな利点を有する。これは、科学研究者が関連する微生物研究を行うための低コストで操作に優しく、結果信頼性の高い実験プラットフォームを提供します。

概要

微生物培養は、微生物の単離、同定、再構成、スクリーニング、および進化に広く使用されている微生物学的科学的研究および産業応用のための重要な基盤である1,2,3。従来の微生物培養方法は、主に試験管、振とうフラスコ、固体プレートを培養容器として使用し、振とう培養器、分光光度計、マイクロプレートリーダーなどの微生物培養・検出・スクリーニング装置と組み合わせていました。しかしながら、これらの方法は、煩雑な操作、低スループット、低効率、および労力および試薬の大量消費など、多くの問題を有する。近年開発されているハイスループット栽培法は、主にマイクロプレートをベースとしています。しかし、マイクロプレートは、低レベルの溶存酸素、貧弱な混合特性、および重度の蒸発および熱効果を有し、これはしばしば微生物の増殖状態および実験並列化をもたらす4,5,6,7;一方、自動栽培とプロセス検出を達成するためには、液体処理ワークステーションやマイクロプレートリーダーなどの高価な機器を装備する必要があります8,9。

マイクロ流体技術の重要な分野として、液滴マイクロ流体は、従来の連続流マイクロ流体システムに基づいて近年開発されている。これは、2つの非混和性液相(通常は油水)を使用して分散マイクロ液滴を生成し、それらを操作する離散流マイクロ流体技術です10。微小液滴は、小体積、大比表面積、高い内部物質移動速度、区画化による交差汚染がないという特徴と、液滴の強力な制御性と高スループットの利点を有するため、微生物のハイスループット培養、スクリーニング、進化に液滴マイクロ流体技術を適用した多くの種類の研究が行われています11.しかし、液滴マイクロ流体技術を普及させ、広く適用するための一連の重要な課題がまだあります。第一に、液滴マイクロフルイディクスの操作は煩雑で複雑であり、オペレータにとって高い技術的要件をもたらす。第二に、液滴マイクロ流体技術は、光学、機械、および電気コンポーネントを組み合わせており、バイオテクノロジーの応用シナリオに関連付ける必要があります。学際的なコラボレーションがなければ、単一の研究室やチームが効率的な液滴マイクロ流体制御システムを構築することは困難です。第3に、微小液滴量(ピコリター(pL)からマイクロリットル(μL)まで)が少ないため、転耕栽培、選別、サンプリングなどのいくつかの基本的な微生物操作において、液滴の正確な自動制御とリアルタイムのオンライン検出を実現することは非常に困難であり、統合機器システム12を構築することも困難である。

上記課題に対処するため、液滴マイクロ流体技術13に基づく微生物自動微小液滴培養システム(MMC)の開発に成功した。MMCは、液滴認識モジュール、液滴スペクトル検出モジュール、マイクロ流体チップモジュール、サンプリングモジュールの4つの機能モジュールで構成されています。すべてのモジュールのシステム統合と制御により、液滴の生成、培養、測定(光学密度(OD)と蛍光)、分割、融合、選別などの自動操作システムを正確に確立し、微生物液滴培養の過程で必要な接種、培養、監視、副耕作、選別、サンプリングなどの機能の統合を実現します。MMCは、2〜3μL容量の200複製液滴培養ユニットまで保持することができ、これは200シェイクフラスコ栽培ユニットに相当する。微小液滴培養システムは、微生物の増殖中の非汚染、溶存酸素、混合、および質量エネルギー交換の要件を満たすことができ、成長曲線測定、適応進化、単一因子マルチレベル分析、代謝産物研究および分析(蛍光検出に基づく)13,14などの複数の統合機能を通じて微生物研究のさまざまなニーズを満たすことができます。

ここでは、MMCを使用して自動微生物培養と適応進化を行う方法を詳細に紹介しています(図1)。増殖曲線測定を実証するために野生型大腸菌(E. coli)MG1655を例にとり、MMCにおける適応進化を実証するためにメタノール必須大腸菌株MeSV2.215を採った。MMC用の操作ソフトウェアを開発し、操作を非常に簡単で明確にしました。全プロセスにおいて、ユーザーは最初の細菌溶液を調製し、MMCの条件を設定し、次いで細菌溶液および関連試薬をMMCに注入する必要がある。その後、MMCは液滴生成、認識とナンバリング、栽培、適応進化などの操作を自動的に実行します。また、液滴のオンライン検出(ODおよび蛍光)を高い時間分解能で実行し、関連データ(エクスポート可能)をソフトウェアに表示します。操作者は、結果に応じていつでも培養工程を停止し、その後の実験のために標的液滴を抽出することができる。MMCは操作が容易で、労力と試薬の消費が少なく、比較的高い実験スループットと良好なデータ並列性を有し、従来の培養方法と比較して大きな利点を有する。これは、研究者が関連する微生物研究を行うための低コストで操作に優しく、堅牢な実験プラットフォームを提供します。

プロトコル

1. 機器とソフトウェアのインストール

  1. MMC専用の恒久的なスペースとして、清潔で無菌な環境(クリーンベンチなど)を選択してください。MMCをスペースにどんどん設置してください。
    メモ: MMC は、強い電界、磁場、および強い熱放射源の干渉から遠ざけてください。光学検出部品に影響を与える激しい振動を避けてください。MMC に AC220 V、50 HZ の電源を供給します。MMCの詳細については、 資料表 およびMMC16のウェブサイトを参照してください。
  2. MMC.zipファイルから操作ソフトウェアをインストールする
    メモ: MMC.zip ファイルの作成者に問い合わせてください。
    1. 専用のフォルダを作成し、その中にzipファイルを保存します。
    2. 別の専用フォルダを「インストールディレクトリ」として作成します。MMC を解凍し.zipファイルを新しいフォルダーに保存します。
      メモ: コンピュータ構成は、(1) Windows 7 64 ビットオペレーティングシステム以上を満たすのに最適です。(2) CPU: i5 以上(3)メモリ:4GB以上。(4)ハードディスク:300GB以上(回転数7200rpm以上またはソリッドステートディスク)

2. 準備

  1. シリンジ針(内径0.41mm、外径0.71mm)、クイックコネクタA、試薬ボトル(図2C)を接続し、121°Cで15分間オートクレーブ処理します。
    メモ:滅菌中は、試薬ボトルのキャップを少し緩めてください。使用するたびにさらにいくつかの試薬ボトルを準備することができます。
  2. 0.22 μm のポリフッ化ビニリデン (PVDF) フィルターを使用して、MMC オイルをろ過します。マイクロ流体チップ(図2B)とMMCオイルを予めクリーンベンチに入れ、使用前に30分間紫外線照射して殺菌してください。
    注:クイックコネクタA、試薬ボトル、MMCオイル、マイクロ流体チップの詳細については、 材料表を参照してください。
  3. マイクロ流体チップの取り付け
    1. 操作室のドアを開け(図2A)、光ファイバプローブを持ち上げます。
    2. 電界穴を電界針に合わせ、チップをチップ台座にそっと置きます。次に、2つの位置決め列を位置決め穴に挿入し、光ファイバプローブを下に置きます(図2D)。
    3. チップ上のクイックコネクタAを、位置番号(C5-O5、C4-O4、C6-O6、C2-O2、CF-OF、C1-O1、C3-O3)に従ってMMCの対応するポートに接続します。その後、操作室のドアを閉めます。
  4. オイルボトル内のMMCオイル(約80mLまで)を補充し、使用前に廃液を空にしてください。
    注:廃液は通常有機廃棄物です。処分に関する地域の法律や規制をご参照ください(実験設定により変更される場合があります)。

3. MMCにおける成長曲線測定

  1. 初期菌液の調製
    1. 関連する標準規制に従って、ルリア・ベルターニ(LB)培地とオートクレーブを121°Cで15分間調製します。
      注:LB培地の成分:NaCl(10 g / L)、酵母エキス(5 g / L)およびトリプトン(10 g / L)。
    2. グリセロールストックから 大腸菌 MG1655株を取り出し、10mLのLB培地を入れた50mL振とうフラスコで、37°Cの振とう培養器(200rpm)で5~8時間培養する。
      注:栽培時間は特定の株によって異なります。株を対数周期/位相に培養することが最適である。
    3. 培養した 大腸菌 MG1655溶液を新鮮な培地でOD600が0.05~0.1となるように希釈し、初期菌液を得た(約10mL調製)。
  2. [ 初期化] をクリックして MMC を初期化します。初期化インターフェースが表示されたら、栽培温度を37°C、光電信号値を0.6に設定します(図3A)。初期化には約 20 分かかります。
  3. 初期化中にUVランプ(波長254 nm)をオンにします。
  4. 初期細菌溶液とMMCオイルを試薬ボトルに注入する。
    1. クリーンベンチの滅菌試薬ボトルを取り出し、キャップを締めます。
    2. 10 mLの滅菌シリンジを使用して、サイドチューブのシリンジ針から3〜5 mLのMMCオイルを注入します。試薬ボトルをゆっくりと傾けて回転させ、オイルが内壁に完全に浸透するようにします。
    3. 約5 mLの初期細菌溶液を注入し、次に5〜7 mLの油を再び注入することによって試薬ボトルを充填する。
    4. 独立したクイックコネクタAを引き出し、試薬ボトルのクイックコネクタAをクイックコネクタBに挿入して、サンプル注入操作を完了します(図4A)。
  5. 初期化が終了するのを待ってから、UVランプ(波長254nm)をオフにします。
  6. 操作室の扉を開き、試薬ボトルを金属浴に入れた。
  7. チップのC2コネクターと試薬ボトルのクイックコネクターAを引き出します。試薬ボトルのサイドチューブコネクタをC2コネクタに接続し、トップチューブコネクタをO2コネクタに接続します。その後、操作室のドアを閉めます。
  8. [成長曲線]をクリックして、 成長曲線 測定の機能を選択します(図3A)。パラメータ設定インターフェースで、 数値 を15として入力し、 OD検出 スイッチをオンにして 、波長 を600nmに設定します。[ 開始 ]をクリックしてドロップレットの生成を開始します。所要時間は約10分です。
    注:ここで、 数値 とは、生成される液滴の数を指す。波長は、検出対象のODの 波長 をいう。実験要件に応じて 、数 (最大200)と 波長 (350-800nm)を設定します。
  9. メインインターフェイスに「C2とO2の間の試薬ボトルを取り出し、完了後にOKボタンをクリックしてください」というポップアップウィンドウが表示されたら、操作室のドアを開けて試薬ボトルを取り出し、C2コネクタとO2コネクタを接続します。
  10. ドアを閉じ、ポップアップ ウィンドウの[OK ]ボタンをクリックすると、自動的に液滴が起動され、OD値が検出されます。
    メモ: MMC は、液滴が光ファイバプローブを通過するときに OD 値を検出します。したがって、検出期間は、発生する液滴の数に依存する。
  11. 成長曲線が定常段階に達したら、[ データのエクスポート] ボタンをクリックして OD データをエクスポートします。データ保存パスを選択し、栽培期間中に記録されたOD値を.csv形式でエクスポートし、適切なソフトウェア(Microsoft Excelなど)で開くことができます。次に、マッピングソフトウェア(EXCELやOrigin 9.0など)を使用して、成長曲線をプロットします。
    注: 耕作プロセス中は、いつでも [データのエクスポート] をクリックして、現在のすべてのドロップレットの OD データをエクスポートできます。

4. MMCにおける適応進化

  1. 初期菌液の調製
    1. 関連する標準規制に従って、MeSV2.2用の特別な液体媒体および固体プレートを121°Cで15分間オートクレーブで調製します。
      メモ:特殊媒体のコンポーネントについては、表 1および 材料表を参照してください。
    2. MeSV2.2を固体プレート(直径=90mm)を用いて37°Cの恒温インキュベーター内で72時間培養する。次いで、独立したコロニーを選び、10mLの特殊液体培地を入れた50mL振とうフラスコ中で、37°Cの振とう培養器(200rpm)で72時間培養する。
    3. 培養したMeSV2.2溶液を培地でOD6000000に希釈し(全量が10mL以上であることを確認してください)、振とうフラスコ内で5時間培養を続け、初期菌液を得た。
      注:MeSV2.2はメタノール必須 の大腸菌 株です。特殊な液体培地には500ミリモル/Lのメタノールが含まれており、これはMeSV2.2にとって強いストレスであり、成長が非常に遅い。ここで初期菌液を得ることは、ステップ3.1で説明したものとは異なることに注意してください。
  2. 手順 3.2、3.3、および 3.5 の説明に従って MMC を初期化します。
  3. 滅菌された試薬ボトルを2本取り出し、そのうちの1本は初期細菌溶液用、もう1本は新鮮な培地用です。ステップ3.4で説明したように、初期細菌溶液(5mL)、新鮮な培地(12〜15mL)、およびMMCオイルを試薬ボトルに注入します。
    注:適応進化は複数の転耕栽培を伴う長期的なプロセスであるため、MMCにはできるだけ多くの新鮮な培地を保管してください。実験の実行中に培地を補充することはできません。
  4. 手順 3.6 で説明したように、2 つの試薬ボトルを MMC に取り付けます。1つはC2コネクタとO2コネクタの間に初期バクテリア溶液用、もう1つはC4コネクタとO4コネクタ間の新鮮な培地用に取り付けます。
  5. ALEをクリックして適応進化の機能を選択します(図3B)。パラメータ設定インタフェースで、OD検出スイッチをオンにします。
  6. 数値を 50、波長を 600 nm、濃度を 0%、タイプを時間、パラメータを 30 時間、繰り返しを 99 に設定します。[開始]をクリックしてドロップレットの生成を開始します。所要時間は約25分です。
    注:ここで、「濃度」とは、適応進化のための化学的因子の最大濃度を指す。異なる液滴に対して、異なる成長条件を提供するために異なる濃度の化学的因子を導入することはMMCにおいて実現可能である。導入された濃度は、次の式を使用して計算します。
    figure-protocol-5346
    ここで「C」 は、液滴に導入された化学因子の濃度を指す;「a」は、C4コネクタとO4コネクタの間の試薬ボトル中の化学因子の濃度を指す。「b」は、C6コネクタとO6コネクタとの間の試薬ボトル中の化学的因子の濃度を指す。「i」とは、利用可能な濃度をいう。MMCには8つの濃度があります。ここでいう化学因子は単一濃度(500ミリモル/Lメタノール)で培地の原料の一つであるため、化学因子を入れた試薬ボトルを1本だけ設置し、 濃度 を0%としています。タイプは、時間モード、OD値モード、蛍光モードの3つの タイプ に分けられる亜分化培養のモードを指す。前者は液滴を一定時間培養してから再耕作することを意味し、後者の2つは液滴を予め定義されたOD値/蛍光強度に培養してから再耕作することを意味する。パラメータは、サブカルチャのモードを選択する際に必要な関連 パラメータ を指す。 繰り返しは 、継耕栽培の数を指します。
  7. 手順 3.8 の説明に従って、C2 コネクタと O2 コネクタの間にある試薬ボトルを取り外します。
  8. 各副耕栽培期間中の液滴の最大OD値が有意に増加したかどうかを観察する。増加が発生し、実験の要件を満たしている場合は、[ データのエクスポート] ボタンをクリックして、手順 3.9 で説明したように OD データをエクスポートします。
    注:ここで、サブ栽培期間は パラメータによって異なります。例えば、 タイプ を時間、 パラメータ を30時間に設定した場合、サブ栽培期間は30時間となる。各亜耕作期間中、液滴の最大OD値がある。適応進化が最大OD値の増加によって実験要件を満たしているかどうかを推定する(この増加は、株の実際の栽培プロセスに依存し、例えば、20%以上増加する)。
    警告: 保管されている新鮮な培地が使い果たされていないか注意してください。培地が枯渇した後でも有意な増加が起こらなかった場合は、よりよく成長する液滴を抽出し、適応進化の新しいラウンドを実行します。
  9. MMC からターゲット液滴を抽出します。
    1. [スクリーニング]ボタンをクリックして、液滴抽出の機能を選択します(図3C)。[収集]オプションを選択し、ターゲットドロップレットの数をクリックしてから、[OK]をクリックします。
      注:液滴スクリーニングには、「収集」、「廃棄」および「種子溶液の抽出」が含まれる。「抽出種子溶液」は、継代培養操作後に残りの液滴13を採取することを意味する。
    2. ポップアップウィンドウが「CFクイックコネクタを引き出し、EPチューブに入れてください」というプロンプトが表示されるのを待ちます。ソフトウェアプロンプトに従って収集するためにCFクイックコネクタをマイクロ遠心チューブに入れ、 OK をクリックします(図4D)。
    3. 1〜2分後、ソフトウェアインターフェイスに新しいウィンドウがポップアップ表示され、「コネクタを後ろに挿入し、終了したら [OK ]をクリックしてください」というプロンプトが表示されます。次に、CFクイックコネクタを挿入し、 OK をクリックしてMMCの実行を続行します(図4D)。次のターゲット液滴が液滴認識部位に到達したら、4.9.2~4.9.3を繰り返して収集します。
      注: すべてのターゲット液滴が収集された後、MMC は残りの液滴の培養を続けます。耕作が必要ない場合は、[停止]をクリックして操作を直接終了します。
    4. 2.5 μLのピペットを使用して液滴を抽出し、90 mmのアガロースプレートに滴下し、一辺の長さ3cmの三角形のガラス拡散棒で均等に広げます。その後、37°Cの恒温インキュベーターで72時間培養する。
    5. 3〜5個の独立したコロニーをピックし、37°Cの振とうインキュベーター(200rpm)で48〜72時間、10mLの新鮮な培地を含む50mL振とうフラスコで別々に培養する。関連する標準規制に従って、その後の実験のために培養細菌溶液をグリセロールチューブに保存する。

5. MMCのクリーン化

  1. 実験が完了したら、[ 停止 ] をクリックしてすべての操作を停止します。次に、[ クリーン] をクリックしてチップとチューブをクリーニングします。所要時間は約15分です。

結果

このプロトコルは 、大腸菌 MG1655およびMeSV2.2株を例として使用し、MMCにおける自動化された比較的高スループット戦略による微生物培養およびメタノール必須の適応進化を実証する。成長曲線測定は、主に微生物培養を特徴付けるために使用された。適応進化は、自動連続継耕栽培により行い、各継代培養中に選択圧として高濃度のメタノールを添加した。適応進化が実現したか否か?...

ディスカッション

このプロトコルは、微生物微小液滴培養システム(MMC)を使用して、自動微生物培養および長期的な適応進化を実行する方法を提示する。MMCは、小型化、自動化、ハイスループットの微生物培養システムです。従来の微生物ハイスループット培養方法や機器と比較して、MMCは、低労力および試薬消費、簡単な操作、オンライン検出(ODおよび蛍光)、高時間分解能データ収集、および優れた並列化?...

開示事項

著者らは開示するものは何もありません。

謝辞

この研究は、中国国家基幹研究開発プログラム(2018YFA0901500)、中国国家自然科学財団国家基幹科学機器プロジェクト(21627812)、清華大学イニシアチブ科学研究プログラム(20161080108)の支援を受けた。我々はまた、メタノール必須 大腸菌 株バージョン2.2(MeSV2.2)の提供について、ジュリア・A・フォルホルト教授(微生物学研究所、生物学部、ETHチューリッヒ、チューリッヒ8093、スイス)にも感謝する。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm PVDF filter membraneMerck Millipore Ltd.SLGPR33RBSterilize the MMC oil
4 °C refrigeratorHaierBCD-289BSWFor reagent storage
AgarBecton, Dickinson and Company214010For solid plate preparation
CaCl2·2H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.20011160Component of the special medium for MeSV2.2.
Clean benchBeijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.DL-CJ-INDIIFor aseptic operation and UV sterilization
CoCl2·6H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10007216Component of the special medium for MeSV2.2.
ComputerLenovoE450Software installation and MMC control
Constant temperature incubatorShanghai qixin scientific instrument co., LTDLRH 250For the microbial cultivation using solid medium
CuSO4·5H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10008218Component of the special medium for MeSV2.2.
Electronic balanceOHAUSAR 3130For reagent weighing
EP tubeThermo Fisher1.5 mLFor droplet collection
FeCl3·6H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10011928Component of the special medium for MeSV2.2.
Freezing TubeThermo Fisher2.0 mLFor strain preservation
GluconateSigma-AldrichS2054Component of the special medium for MeSV2.2.
GlycerolGENERAL-REAGENTG66258AFor strain preservation
High-Pressure Steam Sterilization PotSANYO ElectricMLS3020For autoclaved sterilization
isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG)Biotopped420322Component of the special medium for MeSV2.2.
Kanamycin sulfateSolarbioK8020Component of the special medium for MeSV2.2.
KH2PO4MACKLINP815661Component of the special medium for MeSV2.2.
MethanolMACKLINM813895Component of the special medium for MeSV2.2.
MgSO4·7H2OBIOBYING1305715Component of the special medium for MeSV2.2.
Microbial Microdroplet Culture System (MMC)Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. MMC-IPerforming growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Microfluidic chipLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-ALE-ODFor various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MMC oilLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-M/S-ODThe oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.20026118Component of the special medium for MeSV2.2.
NaClGENERAL-REAGENTG81793JComponent of the LB medium
Na2HPO4·12H2OGENERAL-REAGENTG10267BComponent of the special medium for MeSV2.2.
NH4ClSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10001518Component of the special medium for MeSV2.2.
Petri dishCorning Incorporated90 mmFor the preparation of solid medium
Pipetteeppendorf2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μLFor liquid handling
Quick connector ALuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.—For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Reagent bottleLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-PCBSampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Shake flaskUnion-Biotech50 mLFor microbial cultivation
Shaking incubatorShanghai Sukun Industrial Co., Ltd.SKY-210 2BFor the microbial cultivation in shake flask
Streptomycin sulfateSolarbioS8290Component of the special medium for MeSV2.2.
SyringeJIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD10 mLDraw liquid and inject it into the reagent bottle
Syringe needleOUBEL Hardware Store22GInner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.
TryptoneOxoid Ltd.LP0042Component of the LB medium
Ultra low temperature refrigeratorSANYO Ultra-lowMDF-U4086SFor strain preservation (-80 °C)
UV–Vis spectrophotometerGeneral Electric CompanyUltrospec 3100 proFor the measurement of OD values
Vitamin B1SolarbioSV8080Component of the special medium for MeSV2.2.
Yeast extractOxoid Ltd.LP0021Component of the LB medium
ZnSO4·7H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10024018Component of the special medium for MeSV2.2.

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