Automatisierte mikrobielle Kultivierung und adaptive Evolution mit mikrobiellem Mikrotröpfchenkultursystem (MMC)

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt, wie das mikrobielle Mikrotröpfchenkultursystem (MMC) verwendet wird, um eine automatisierte mikrobielle Kultivierung und adaptive Evolution durchzuführen. MMC kann Mikroorganismen automatisch und kontinuierlich kultivieren und subkultivieren und ihr Wachstum online mit relativ hohem Durchsatz und guter Parallelisierung überwachen, wodurch der Arbeits- und Reagenzienverbrauch reduziert wird.

Zusammenfassung

Herkömmliche mikrobielle Kultivierungsmethoden haben in der Regel umständliche Operationen, einen geringen Durchsatz, eine geringe Effizienz und einen hohen Verbrauch an Arbeitskräften und Reagenzien. Darüber hinaus haben mikrotiterplattenbasierte Hochdurchsatz-Kultivierungsmethoden, die in den letzten Jahren entwickelt wurden, aufgrund ihres geringen gelösten Sauerstoffs, ihrer schlechten Mischung und ihrer starken Verdunstungs- und Wärmewirkung einen schlechten mikrobiellen Wachstumsstatus und eine schlechte Experimentparallelisierung. Aufgrund vieler Vorteile von Mikrotröpfchen, wie z. B. geringes Volumen, hoher Durchsatz und starke Kontrollierbarkeit, kann die tröpfchenbasierte mikrofluidische Technologie diese Probleme überwinden, die in vielen Arten der Erforschung der mikrobiellen Kultivierung, des Screenings und der Evolution mit hohem Durchsatz eingesetzt wurde. Die meisten früheren Studien befinden sich jedoch noch im Stadium des Laboraufbaus und der Anwendung. Einige Schlüsselthemen, wie hohe betriebliche Anforderungen, hohe Bauschwierigkeiten und das Fehlen automatisierter Integrationstechnologie, schränken die breite Anwendung der Tröpfchenmikrofluidik-Technologie in der mikrobiellen Forschung ein. Hier wurde erfolgreich ein automatisiertes mikrobielles Mikrotropfenkultursystem (MMC) entwickelt, das auf der Tröpfchenmikrofluidik-Technologie basiert und die Integration von Funktionen wie Impfung, Kultivierung, Online-Überwachung, Subkultivierung, Sortierung und Probenahme erreicht, die für den Prozess der mikrobiellen Tröpfchenkultivierung erforderlich sind. In diesem Protokoll wurden Wildtyp-Escherichia coli (E. coli) MG1655 und ein Methanol-essentieller E. coli-Stamm (MeSV2.2) als Beispiele genommen, um vorzustellen, wie die MMC verwendet werden kann, um automatisierte und relativ durchsatzfähige mikrobielle Kultivierung und adaptive Evolution im Detail durchzuführen. Diese Methode ist einfach zu bedienen, verbraucht weniger Arbeit und Reagenzien und hat einen hohen experimentellen Durchsatz und eine gute Datenparallelität, was im Vergleich zu herkömmlichen Anbaumethoden große Vorteile hat. Es bietet eine kostengünstige, betriebsfreundliche und ergebnissichere experimentelle Plattform für wissenschaftliche Forscher, um verwandte mikrobielle Forschung durchzuführen.

Einleitung

Die mikrobielle Kultivierung ist eine wichtige Grundlage für die mikrobiologische wissenschaftliche Forschung und industrielle Anwendungen, die bei der Isolierung, Identifizierung, Rekonstruktion, dem Screening und der Evolution von Mikroorganismen weit verbreitet ist ^1,2,3. Herkömmliche mikrobielle Kultivierungsmethoden verwenden hauptsächlich Reagenzgläser, Schüttelkolben und feste Platten als Kultivierungsbehälter, kombiniert mit Schüttelinkubatoren, Spektralphotometern, Mikroplattenlesern und anderen Geräten für die mikrobielle Kultivierung, Detektion und das Screening. Diese Methoden haben jedoch viele Probleme, wie umständliche Operationen, geringen Durchsatz, geringe Effizienz und großen Verbrauch von Arbeit und Reagenzien. Die in den letzten Jahren entwickelten Hochdurchsatz-Anbaumethoden basieren hauptsächlich auf der Mikrotiterplatte. Aber die Mikrotiterplatte hat einen geringen Gehalt an gelöstem Sauerstoff, eine schlechte Mischeigenschaft und eine starke Verdampfung und thermische Wirkung, die oft zu einem schlechten Wachstumsstatus und einer Experimentparallelisierung von Mikroorganismen führen 4,5,6,7; Auf der anderen Seite muss es mit teuren Geräten wie Liquid-Handling-Arbeitsplätzen und Mikroplattenlesern ausgestattet werden, um eine automatisierte Kultivierung und Prozesserkennung zu erreichen ^8,9.

Als wichtiger Zweig der mikrofluidischen Technologie wurde die Tröpfchenmikrofluidik in den letzten Jahren auf der Grundlage traditioneller mikrofluidischer Systeme mit kontinuierlicher Strömung entwickelt. Es ist eine diskrete mikrofluidische Technologie, die zwei nicht mischbare flüssige Phasen (normalerweise Öl-Wasser) verwendet, um dispergierte Mikrotröpfchen zu erzeugen und an ihnen^{zu arbeiten 10}. Da Mikrotröpfchen die Eigenschaften eines kleinen Volumens, einer großen spezifischen Oberfläche, einer hohen internen Stoffaustauschrate und keiner Kreuzkontamination durch Kompartimentierung sowie die Vorteile einer starken Kontrollierbarkeit und eines hohen Durchsatzes von Tröpfchen aufweisen, gab es viele Arten von Forschungen, die die Tröpfchenmikrofluidik-Technologie in der Hochdurchsatzkultivierung, dem Screening und der Evolution von Mikroorganismen anwenden¹¹ . Es gibt jedoch immer noch eine Reihe von Schlüsselfragen, um die mikrofluidische Tröpfchentechnologie populär und weit verbreitet zu machen. Erstens ist die Bedienung der Tröpfchenmikrofluidik umständlich und kompliziert, was zu hohen technischen Anforderungen an die Bediener führt. Zweitens kombiniert die Tröpfchenmikrofluidik-Technologie optische, mechanische und elektrische Komponenten und muss mit biotechnologischen Anwendungsszenarien in Verbindung gebracht werden. Es ist schwierig für ein einzelnes Labor oder Team, effiziente mikrofluidische Tröpfchenkontrollsysteme zu bauen, wenn es keine multidisziplinäre Zusammenarbeit gibt. Drittens ist es aufgrund des geringen Volumens an Mikrotröpfchen (von Picolitor (pL) bis Mikroliter (μL)) sehr schwierig, die präzise automatisierte Steuerung und Echtzeit-Online-Erkennung von Tröpfchen für einige grundlegende mikrobielle Operationen wie Subkultivierung, Sortierung und Probenahme zu realisieren, und es ist auch schwierig, ein integriertes Ausrüstungssystem^{zu konstruieren 12}.

Um die oben genannten Probleme anzugehen, wurde erfolgreich ein automatisches mikrobielles Tröpfchenkultursystem (MMC) entwickelt, das auf der Tröpfchenmikrofluidik-Technologie¹³ basiert. Das MMC besteht aus vier Funktionsmodulen: einem Tröpfchenerkennungsmodul, einem Tröpfchenspektrum-Detektionsmodul, einem mikrofluidischen Chipmodul und einem Probenahmemodul. Durch die Systemintegration und Steuerung aller Module wird ein automatisiertes Betriebssystem einschließlich der Erzeugung, Kultivierung, Messung (optische Dichte (OD) und Fluoreszenz), Spaltung, Fusion und Sortierung von Tröpfchen genau etabliert, wodurch die Integration von Funktionen wie Impfung, Kultivierung, Überwachung, Subkultivierung, Sortierung und Probenahme erreicht wird, die für den Prozess der mikrobiellen Tröpfchenkultivierung erforderlich sind. MMC kann bis zu 200 Replikat-Tröpfchen-Kultivierungseinheiten mit einem Volumen von 2-3 μL aufnehmen, was 200 Schüttelkolben-Anbaueinheiten entspricht. Das Mikrotröpfchen-Kultivierungssystem kann die Anforderungen an Nichtkontamination, gelösten Sauerstoff, Vermischung und Massen-Energie-Austausch während des Wachstums von Mikroorganismen erfüllen und die verschiedenen Anforderungen der mikrobiellen Forschung durch mehrere integrierte Funktionen erfüllen, z. B. Wachstumskurvenmessung, adaptive Evolution, Einzelfaktor-Mehrebenenanalyse und Metabolitenforschung und -analyse (basierend auf Fluoreszenzdetektion)^13,14.

Hier stellt das Protokoll vor, wie die MMC verwendet werden kann, um automatisierte und mikrobielle Kultivierung und adaptive Evolution im Detail durchzuführen (Abbildung 1). Wir nahmen den Wildtyp-Escherichia coli (E. coli) MG1655 als Beispiel, um die Messung der Wachstumskurve zu demonstrieren, und einen methanolessentiellen E. coli-Stamm MeSV2.2^15, um die adaptive Entwicklung in MMC zu demonstrieren. Für MMC wurde eine Bediensoftware entwickelt, die die Bedienung sehr einfach und übersichtlich macht. Während des gesamten Prozesses muss der Benutzer die anfängliche Bakterienlösung vorbereiten, die Bedingungen der MMC festlegen und dann die Bakterienlösung und die zugehörigen Reagenzien in die MMC injizieren. Anschließend führt die MMC automatisch Operationen wie Tröpfchengenerierung, Erkennung und Nummerierung, Kultivierung und adaptive Evolution durch. Es wird auch eine Online-Detektion (OD und Fluoreszenz) der Tröpfchen mit hoher Zeitauflösung durchführen und die zugehörigen Daten (die exportiert werden können) in der Software anzeigen. Der Bediener kann den Kultivierungsprozess je nach den Ergebnissen jederzeit stoppen und die Zieltröpfchen für nachfolgende Experimente extrahieren. Die MMC ist einfach zu bedienen, verbraucht weniger Arbeit und Reagenzien und verfügt über einen relativ hohen experimentellen Durchsatz und eine gute Datenparallelität, was im Vergleich zu herkömmlichen Anbaumethoden erhebliche Vorteile hat. Es bietet eine kostengünstige, betriebsfreundliche und robuste experimentelle Plattform für Forscher, um verwandte mikrobielle Forschung durchzuführen.

Protokoll

1. Geräte- und Softwareinstallation

1. Wählen Sie eine saubere und sterile Umgebung (z. B. eine saubere Bank) als dedizierten permanenten Raum für MMC. Installieren Sie die MMC stetig im Raum.
   HINWEIS: Halten Sie die MMC von der Interferenz starker elektrischer Felder, Magnetfelder und starker Wärmestrahlungsquellen fern. Vermeiden Sie starke Vibrationen, die die optischen Detektionskomponenten beeinträchtigen. Stellen Sie die Stromversorgung von AC220 V, 50 HZ für die MMC bereit. Weitere Informationen zu MMC finden Sie in der Materialtabelle und auf der Website von MMC¹⁶.
2. Installieren Sie die Betriebssoftware aus der MMC.zip Datei
   Hinweis: Wenden Sie sich an die Autoren der MMC.zip-Datei.
   1. Erstellen Sie einen dedizierten Ordner und speichern Sie die ZIP-Datei darin.
   2. Erstellen Sie einen weiteren dedizierten Ordner als "Installationsverzeichnis". Entpacken Sie die MMC.zip und speichern Sie die Dateien im neuen Ordner.
      HINWEIS: Die Computerkonfiguration ist am besten zu erfüllen: (1) Windows 7 64-Bit-Betriebssystem oder höher; (2) CPU: i5 oder höher; (3) Speicher: 4 GB oder mehr; (4) Festplatte: 300 GB oder mehr (Drehzahl größer als 7200 U/min oder Solid-State-Festplatte).

2. Vorbereitungen

1. Schließen Sie die Spritzennadel (Innendurchmesser 0,41 mm und der Außendurchmesser 0,71 mm), den Schnellverbinder A und die Reagenzflasche (Abbildung 2C) an und autoklavieren Sie sie bei 121 °C für 15 min.
   HINWEIS: Schrauben Sie die Kappe der Reagenzflasche während der Sterilisation leicht ab. Ein paar weitere Reagenzflaschen können jedes Mal für den Gebrauch vorbereitet werden.
2. Verwenden Sie einen 0,22 μm Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Filter, um MMC-Öl zu filtern. Legen Sie den Mikrofluidikchip (Abbildung 2B) und das MMC-Öl im Voraus in die Reinbank und sterilisieren Sie sie 30 Minuten lang durch ultraviolette Bestrahlung vor dem Gebrauch.
   HINWEIS: Details zu Schnellverbinder A, Reagenzflasche, MMC-Öl und Mikrofluidik-Chip finden Sie in der Materialtabelle.
3. Installieren Sie den Mikrofluidik-Chip
   1. Öffnen Sie die Tür der Operationskammer (Abbildung 2A), und heben Sie die optische Fasersonde an.
   2. Richten Sie die elektrischen Feldlöcher mit den elektrischen Feldnadeln aus und legen Sie den Chip vorsichtig auf den Chipsockel. Setzen Sie dann die beiden Positionierungssäulen in die Positionierungslöcher ein und legen Sie die optische Fasersonde ab (Abbildung 2D).
   3. Verbinden Sie den Schnellverbinder A am Chip entsprechend der Positionsnummer (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3) mit dem entsprechenden Port der MMC. Schließen Sie dann die Tür der Operationskammer.
4. Füllen Sie das MMC-Öl (auf ca. 80 ml) in der Ölflasche auf und entleeren Sie die Abfallflüssigkeit in der Abfallflasche vor dem Gebrauch.
   HINWEIS: Die Abfallflüssigkeit ist in der Regel organischer Abfall. Bitte beachten Sie bei der Entsorgung die Landesgesetze und -verordnungen, Änderungen aufgrund des Versuchsaufbaus vorbehalten.

3. Wachstumskurvenmessung in MMC

1. Vorbereitung für die anfängliche bakterielle Lösung
   1. Befolgen Sie die entsprechenden Standardvorschriften, um Luria-Bertani (LB) Medium vorzubereiten und bei 121 ° C für 15 Minuten zu autoklavieren.
      HINWEIS: Bestandteile von LB-Medium: NaCl (10 g/L), Hefeextrakt (5 g/L) und Trypton (10 g/L).
   2. Nehmen Sie den E. coli MG1655 Stamm aus Glycerinmaterial heraus und kultivieren Sie ihn in einem 50 ml Schüttelkolben mit 10 mL LB-Medium in einem Schüttelinkubator (200 U/min) bei 37 °C für 5-8 h.
      HINWEIS: Die Kultivierungszeit hängt von den spezifischen Sorten ab. Es ist optimal, die Belastung bis zur logarithmischen Periode/Phase zu kultivieren.
   3. Die kultivierte E. coli MG1655-Lösung wird mit frischem Medium auf ein OD₆₀₀ von 0,05-0,1 verdünnt, um eine anfängliche Bakterienlösung zu erhalten (etwa 10 ml herstellen).
2. Klicken Sie auf Initialisierung , um die MMC zu initialisieren. Nachdem die Initialisierungsschnittstelle angezeigt wird, stellen Sie die Kultivierungstemperatur auf 37 °C und den photoelektrischen Signalwert auf 0,6 ein (Abbildung 3A). Die Initialisierung dauert ca. 20 Minuten.
3. Schalten Sie die UV-Lampe (Wellenlänge 254 nm) während der Initialisierung ein.
4. Injizieren Sie die anfängliche Bakterienlösung und das MMC-Öl in die Reagenzflasche.
   1. Nehmen Sie eine sterilisierte Reagenzflasche auf der sauberen Bank heraus und ziehen Sie die Kappe fest.
   2. Verwenden Sie eine sterile 10-ml-Spritze, um 3-5 ml MMC-Öl aus der Spritzennadel des Seitenrohrs zu injizieren. Kippen und drehen Sie die Reagenzflasche langsam, damit das Öl vollständig in die Innenwand eindringt.
   3. Injizieren Sie etwa 5 ml anfängliche Bakterienlösung und füllen Sie dann die Reagenzflasche, indem Sie erneut 5-7 ml des Öls injizieren.
   4. Ziehen Sie den unabhängigen Schnellverbinder A heraus, und setzen Sie den Schnellverbinder A der Reagenzflasche in den Schnellverbinder B ein, um die Probeninjektion abzuschließen (Abbildung 4A).
5. Warten Sie, bis die Initialisierung beendet ist, und schalten Sie dann die UV-Lampe (Wellenlänge 254 nm) aus.
6. Öffnen Sie die Tür der Operationskammer und legen Sie die Reagenzflasche in das Metallbad.
7. Ziehen Sie den C2-Stecker des Chips und den Schnellverbinder A der Reagenzflasche heraus. Schließen Sie den Seitenrohranschluss der Reagenzflasche an den C2-Stecker und den oberen Rohranschluss an den O2-Anschluss an. Schließen Sie dann die Tür der Operationskammer.
8. Klicken Sie auf Wachstumskurve , um die Funktion der Wachstumskurvenmessung auszuwählen (Abbildung 3A). Geben Sie in der Schnittstelle zur Parametrierung die Zahl als 15 ein, schalten Sie den OD-Erkennungsschalter ein und stellen Sie die Wellenlänge auf 600 nm ein. Klicken Sie auf Start , um die Droplet-Generierung zu starten. Es dauert ca. 10 min.
   HINWEIS: Hier bezieht sich Zahl auf die Anzahl der zu erzeugenden Tröpfchen. Die Wellenlänge bezieht sich auf die Wellenlänge des zu erfassenden OD. Stellen Sie die Anzahl (maximal 200) und die Wellenlänge (350-800 nm) entsprechend den Experimentanforderungen ein.
9. Wenn auf der Hauptoberfläche ein Popup-Fenster mit der Aufforderung: "Entfernen Sie die Reagenzflasche zwischen C2 und O2, dann klicken Sie bitte nach Abschluss auf die Schaltfläche OK" angezeigt wird, öffnen Sie die Tür der Operationskammer, um die Reagenzflasche herauszunehmen und die C2- und O2-Anschlüsse anzuschließen.
10. Schließen Sie die Tür und klicken Sie im Popup-Fenster auf die Schaltfläche OK, um die Tröpfchen automatisch zu kultivieren und die OD-Werte zu erkennen.
    HINWEIS: Die MMC erkennt den OD-Wert, wenn der Tropfen die Glasfasersonde passiert. Daher hängt die Nachweisdauer von der Anzahl der erzeugten Tröpfchen ab.
11. Wenn die Wachstumskurve die stationäre Phase erreicht, klicken Sie auf die Schaltfläche Datenexport , um die OD-Daten zu exportieren. Wählen Sie den Datenspeicherpfad aus und exportieren Sie den während des Anbauzeitraums erfassten OD-Wert im .csv-Format, der von entsprechender Software (z.B. Microsoft Excel) geöffnet werden kann. Verwenden Sie dann eine Mapping-Software (z. B. EXCEL und Origin 9.0), um die Wachstumskurve darzustellen.
    HINWEIS: Während des Kultivierungsprozesses ist es jederzeit möglich, auf den Datenexport zu klicken, um die OD-Daten aller aktuellen Tröpfchen zu exportieren.

4. Adaptive Entwicklung in MMC

1. Vorbereitung für die anfängliche bakterielle Lösung
   1. Befolgen Sie die entsprechenden Standardvorschriften, um das spezielle flüssige Medium und die festen Platten für die MeSV2.2 vorzubereiten und bei 121 °C für 15 min zu autoklavieren.
      HINWEIS: Für die Komponenten des Spezialmediums siehe Tabelle 1 und die Materialtabelle.
   2. Kultivieren Sie die MeSV2.2 mit der festen Platte (Durchmesser = 90 mm) in einem 37 °C Konstanttemperatur-Inkubator für 72 h. Dann pflücken Sie eine unabhängige Kolonie und kultivieren Sie sie in einem 50 ml Schüttelkolben mit 10 ml des speziellen flüssigen Mediums in einem Schüttelinkubator (200 U / min) bei 37 ° C für 72 h.
   3. Verdünnen Sie die kultivierte MeSV2.2-Lösung mit dem Medium auf einen OD₆₀₀ von 0,1-0,2 (stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen nicht weniger als 10 ml beträgt) und kultivieren Sie es im Schüttelkolben für 5 h weiter, um die anfängliche Bakterienlösung zu erhalten.
      HINWEIS: Der MeSV2.2 ist ein Methanol-essentieller E. coli-Stamm. Das spezielle flüssige Medium enthält 500 mmol/L Methanol, was eine starke Belastung für MeSV2.2 darstellt, was zu einem sehr langsamen Wachstum führt. Beachten Sie, dass sich der Erhalt der anfänglichen Bakterienlösung hier von der in Schritt 3.1 beschriebenen unterscheidet.
2. Initialisieren Sie die MMC wie in den Schritten 3.2, 3.3 und 3.5 erläutert.
3. Nehmen Sie zwei sterilisierte Reagenzflaschen heraus, von denen eine für die anfängliche Bakterienlösung und die andere für das frische Medium bestimmt ist. Injizieren Sie die anfängliche Bakterienlösung (5 ml), das frische Medium (12-15 ml) und das MMC-Öl in die Reagenzflaschen, wie in Schritt 3.4 erläutert.
   HINWEIS: Da die adaptive Evolution ein langfristiger Prozess ist, an dem mehrere Teilkulturen beteiligt sind, lagern Sie so viel frisches Medium wie möglich in MMC. Das Medium kann während des laufenden Experiments nicht wieder aufgefüllt werden.
4. Installieren Sie die beiden Reagenzflaschen in MMC, wie in Schritt 3.6 erläutert. Installieren Sie die eine für die anfängliche Bakterienlösung zwischen dem C2- und O2-Steckverbinder und die andere für das frische Medium zwischen dem C4- und O4-Stecker.
5. Klicken Sie auf ALE , um die Funktion der adaptiven Evolution auszuwählen (Abbildung 3B). Schalten Sie in der Parametrierschnittstelle den Schalter OD-Erkennung ein.
6. Legen Sie die Zahl auf 50, die Wellenlänge auf 600 nm, die Konzentration auf 0%, den Typ auf die Zeit, den Parameter auf 30 h und die Wiederholungen auf 99 fest. Klicken Sie auf Start, um die Droplet-Generierung zu starten. Es dauert ca. 25 min.
   HINWEIS: Hier bezieht sich "Konzentration" auf die maximale Konzentration chemischer Faktoren für die adaptive Evolution. Für verschiedene Tröpfchen ist es in MMC realisierbar, unterschiedliche Konzentrationen chemischer Faktoren einzuführen, um unterschiedliche Wachstumsbedingungen zu schaffen. Berechnen Sie die eingeführten Konzentrationen mit der folgenden Gleichung:
   
   Hier bezieht sich "C" auf die Konzentration chemischer Faktoren, die in Tröpfchen eingebracht werden; "a" bezieht sich auf die Konzentration chemischer Faktoren in den Reagenzflaschen zwischen dem C4- und O4-Verbinder; "b" bezieht sich auf die Konzentration chemischer Faktoren in den Reagenzflaschen zwischen dem C6- und O6-Verbinder; und "i" bezieht sich auf die verfügbare Konzentration. In MMC stehen acht Konzentrationen zur Verfügung. Da der chemische Faktor hier eine einzige Konzentration (500 mmol/L Methanol) hat und einer der Inhaltsstoffe des Mediums ist, wird hier nur eine Reagenzflasche mit dem chemischen Faktor installiert, und die Konzentration wird auf 0% festgelegt. Typ bezieht sich auf den Modus der Subkultivierung, der in drei Typen unterteilt ist: Zeitmodus, OD-Wertmodus und Fluoreszenzmodus. Ersteres bedeutet, die Tröpfchen für eine bestimmte Zeit zu kultivieren und dann zu subkultivieren, während die beiden letzteren bedeuten, die Tröpfchen zu einem vordefinierten OD-Wert / Fluoreszenzintensität zu kultivieren und dann zu subkultivieren. Parameter bezieht sich auf den zugehörigen Parameter , der bei der Auswahl eines Teilkultivierungsmodus erforderlich ist. Wiederholungen beziehen sich auf die Anzahl der Teilkultivierungen.
7. Entfernen Sie die Reagenzflasche, die zwischen dem C2- und dem O2-Anschluss platziert ist, wie in Schritt 3.8 erläutert.
8. Beobachten Sie, ob die maximalen OD-Werte der Tröpfchen während jeder Teilkultivierungsperiode signifikant gestiegen sind. Wenn die Erhöhung auftritt und die Testanforderungen erfüllt, klicken Sie auf die Schaltfläche Datenexport , um die OD-Daten wie in Schritt 3.9 beschrieben zu exportieren.
   HINWEIS: Hier hängt der Teilanbauzeitraum vom Parameter ab. Wenn Sie beispielsweise Typ als Zeit und Parameter als 30 h festlegen, beträgt der Subkultivierungszeitraum 30 h. Während jeder Teilkultivierungsperiode gibt es die maximalen OD-Werte der Tröpfchen. Schätzen Sie, ob die adaptive Evolution die experimentellen Anforderungen durch die Erhöhung der maximalen OD-Werte erfüllt (Die Zunahme hängt vom tatsächlichen Kultivierungsprozess der Sorte ab, z. B. um mehr als 20% erhöht).
   ACHTUNG: Achten Sie darauf, ob das gespeicherte frische Medium erschöpft ist. Wenn der signifikante Anstieg auch nach Erschöpfung des Mediums nicht eingetreten ist, extrahieren Sie die besser wachsenden Tröpfchen und führen Sie eine neue Runde der adaptiven Evolution durch.
9. Extrahieren Sie die Zieltröpfchen aus der MMC.
   1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Screening, um die Funktion der Tröpfchenextraktion auszuwählen (Abbildung 3C). Wählen Sie die Option Sammeln, klicken Sie auf die Anzahl der Zieltröpfchen und klicken Sie dann auf OK.
      HINWEIS: Das Tröpfchenscreening umfasst "Collect", "Discard" und "Extract seed solution". "Extraktsamenlösung" bedeutet, die verbleibenden Tröpfchen¹³ nach dem Teilanbauvorgang zu sammeln.
   2. Warten Sie, bis das Popup-Fenster aufgefordert wird: "Bitte ziehen Sie den CF-Schnellverbinder heraus und stecken Sie ihn in den EP-Schlauch ein". Stecken Sie den CF-Schnellverbinder zur Abholung gemäß der Software-Eingabeaufforderung in das Mikrozentrifugenröhrchen und klicken Sie dann auf OK (Abbildung 4D).
   3. Nach 1-2 Minuten öffnet die Softwareoberfläche ein neues Fenster mit der Aufforderung: "Bitte setzen Sie den Stecker wieder ein und klicken Sie auf OK, wenn Sie fertig sind". Setzen Sie dann den CF-Schnellverbinder wieder ein und klicken Sie auf OK, damit MMC weiterhin ausgeführt wird (Abbildung 4D). Wenn das nächste Zieltröpfchen die Tröpfchenerkennungsstelle erreicht, wiederholen Sie 4.9.2-4.9.3, um es zu sammeln.
      HINWEIS: Nachdem alle Zieltröpfchen gesammelt wurden, wird die MMC die verbleibenden Tröpfchen weiter kultivieren. Wenn der Anbau nicht notwendig ist, klicken Sie auf Stopp, um den Vorgang direkt zu beenden.
   4. Extrahieren Sie das Tröpfchen mit einer 2,5 μL Pipette, lassen Sie es auf die 90 mm Agaroseplatte fallen und verteilen Sie es gleichmäßig mit einem dreieckigen Glasstreustab mit einer Seitenlänge von 3 cm. Dann kultivieren Sie es in einem 37 °C Konstanttemperatur-Inkubator für 72 h.
   5. Pflücken Sie 3-5 unabhängige Kolonien und kultivieren Sie sie separat in den 50 ml Schüttelkolben mit 10 ml frischem Medium in einem Schüttelinkubator (200 U / min) bei 37 ° C für 48-72 h. Befolgen Sie die entsprechenden Standardvorschriften, um die kultivierte Bakterienlösung für nachfolgende Experimente im Glycerinröhrchen zu lagern.

5. Reinigung der MMC

1. Klicken Sie nach Abschluss des Experiments auf Stopp , um alle Vorgänge zu stoppen. Klicken Sie dann auf Reinigen , um den Chip und die Rohre zu reinigen. Es dauert ca. 15 min.

Ergebnisse

Dieses Protokoll verwendet E. coli MG1655 und einen MeSV2.2-Stamm als Beispiele, um die mikrobielle Kultivierung und die methanolessentielle adaptive Evolution mit einer automatisierten und relativ hohen Durchsatzstrategie in MMC zu demonstrieren. Die Messung der Wachstumskurve wurde hauptsächlich zur Charakterisierung der mikrobiellen Kultivierung verwendet. Die adaptive Evolution wurde durch automatisierte kontinuierliche Subkultivierung und Zugabe einer hohen Konzentration von Methanol als Selektionsdruck w?...

Diskussion

Dieses Protokoll zeigt, wie das mikrobielle Tröpfchenkultursystem (MMC) verwendet werden kann, um eine automatisierte mikrobielle Kultivierung und langfristige adaptive Evolution durchzuführen. MMC ist ein miniaturisiertes, automatisiertes und mikrobielles Hochdurchsatz-Kultivierungssystem. Im Vergleich zu herkömmlichen mikrobiellen Hochdurchsatz-Kultivierungsmethoden und -instrumenten bietet MMC viele Vorteile wie geringen Arbeits- und Reagenzverbrauch, einfache Bedienung, Online-Detektion (OD und Fluoreszenz), hochz...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm PVDF filter membrane	Merck Millipore Ltd.	SLGPR33RB	Sterilize the MMC oil
4 °C refrigerator	Haier	BCD-289BSW	For reagent storage
Agar	Becton, Dickinson and Company	214010	For solid plate preparation
CaCl2·2H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	20011160	Component of the special medium for MeSV2.2.
Clean bench	Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.	DL-CJ-INDII	For aseptic operation and UV sterilization
CoCl2·6H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10007216	Component of the special medium for MeSV2.2.
Computer	Lenovo	E450	Software installation and MMC control
Constant temperature incubator	Shanghai qixin scientific instrument co., LTD	LRH 250	For the microbial cultivation using solid medium
CuSO4·5H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10008218	Component of the special medium for MeSV2.2.
Electronic balance	OHAUS	AR 3130	For reagent weighing
EP tube	Thermo Fisher	1.5 mL	For droplet collection
FeCl3·6H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10011928	Component of the special medium for MeSV2.2.
Freezing Tube	Thermo Fisher	2.0 mL	For strain preservation
Gluconate	Sigma-Aldrich	S2054	Component of the special medium for MeSV2.2.
Glycerol	GENERAL-REAGENT	G66258A	For strain preservation
High-Pressure Steam Sterilization Pot	SANYO Electric	MLS3020	For autoclaved sterilization
isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG)	Biotopped	420322	Component of the special medium for MeSV2.2.
Kanamycin sulfate	Solarbio	K8020	Component of the special medium for MeSV2.2.
KH2PO4	MACKLIN	P815661	Component of the special medium for MeSV2.2.
Methanol	MACKLIN	M813895	Component of the special medium for MeSV2.2.
MgSO4·7H2O	BIOBYING	1305715	Component of the special medium for MeSV2.2.
Microbial Microdroplet Culture System (MMC)	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-I	Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Microfluidic chip	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-ALE-OD	For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MMC oil	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-M/S-OD	The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	20026118	Component of the special medium for MeSV2.2.
NaCl	GENERAL-REAGENT	G81793J	Component of the LB medium
Na2HPO4·12H2O	GENERAL-REAGENT	G10267B	Component of the special medium for MeSV2.2.
NH4Cl	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10001518	Component of the special medium for MeSV2.2.
Petri dish	Corning Incorporated	90 mm	For the preparation of solid medium
Pipette	eppendorf	2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL	For liquid handling
Quick connector A	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	—	For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Reagent bottle	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-PCB	Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Shake flask	Union-Biotech	50 mL	For microbial cultivation
Shaking incubator	Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.	SKY-210 2B	For the microbial cultivation in shake flask
Streptomycin sulfate	Solarbio	S8290	Component of the special medium for MeSV2.2.
Syringe	JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD	10 mL	Draw liquid and inject it into the reagent bottle
Syringe needle	OUBEL Hardware Store	22G	Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.
Tryptone	Oxoid Ltd.	LP0042	Component of the LB medium
Ultra low temperature refrigerator	SANYO Ultra-low	MDF-U4086S	For strain preservation (-80 °C)
UV–Vis spectrophotometer	General Electric Company	Ultrospec 3100 pro	For the measurement of OD values
Vitamin B1	Solarbio	SV8080	Component of the special medium for MeSV2.2.
Yeast extract	Oxoid Ltd.	LP0021	Component of the LB medium
ZnSO4·7H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10024018	Component of the special medium for MeSV2.2.