JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

בפרוטוקול זה, בדיקת מיקרופלואידים ביומימטיים, שיכולה לשכפל סביבה מיקרו-וסקולרית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית ולשכפל את כל מפל ההידבקות/הגירה של לויקוציטים, מועסקת כדי לחקור אינטראקציות של תאי לויקוציטים-אנדותל במחלות דלקתיות.

Abstract

אינטראקציות תאי לויקוציט-אנדותל ממלאות תפקיד חשוב במחלות דלקתיות כגון אלח דם. במהלך דלקת, הגירה מופרזת של לויקוציטים מופעלים על פני אנדותל כלי הדם לאיברים מרכזיים יכול להוביל לכשל איברים. בדיקה מיקרופלואידית ביומימטית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית (bMFA) פותחה ואומתה באמצעות מספר טכניקות ניסיוניות וחישוביות, שיכולות לשחזר את כל מפל הגלגול/הידבקות/הגירה של לויקוציטים כדי ללמוד אינטראקציות בין תאי לויקוציט אנדותל. רשתות מיקרו-וסקולריות שהושגו מתמונות in vivo במכרסמים עברו דיגיטציה באמצעות גישה של מערכת מידע גיאוגרפית (GIS) ומיקרו-פבריקט עם פולידימתילסילסילוקסן (PDMS) בשקופית מיקרוסקופ. כדי לחקור את ההשפעה של קצב הגזירה וטופולוגיית כלי הדם על אינטראקציות תאים לויקוציטים-אנדותל, פותח מודל דינמיקה של נוזל חישובי (CFD) כדי ליצור מפה מקבילה של קצבי הטיה ומהירויות ברחבי הרשת. bMFA מאפשר כימות של אינטראקציות תאי לויקוציטים אנדותל, כולל מהירות מתגלגלת, מספר לויקוציטים דבוקים בתגובה לשיעורי הטיה שונים, מספר לויקוציטים נודדים, חדירות תאי אנדותל, ביטוי מולקולת הידבקות ומשתנים חשובים אחרים. יתר על כן, על ידי שימוש בדגימות הקשורות לבני אדם, כגון תאי אנדותל אנושיים ולויקוציטים, bMFA מספקת כלי להקרנה מהירה של טיפולים פוטנציאליים כדי להגדיל את יכולת התרגום הקליני שלהם.

Introduction

דלקת היא התגובה המארחת לזיהום ופציעה, והאנדותל ממלא תפקיד חשוב בתגובה הדלקתית 1,2,3. דיסרגציה דלקתית היא הגורם הבסיסי למספר פתולוגיות מחלות כגון אלח דם, מחלות לב וכלי דם, אסתמה, מחלות מעי דלקתיות, סרטן ו- COVID-19. אינטראקציות בין תאי לויקוציטים אנדותל ממלאות תפקיד מרכזי במחלות דלקתיות אלה. במהלך דלקת, שחרור של PAMPS (דפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגן) מפתוגנים או DAMPS (דפוסים מולקולריים הקשורים לנזק) מרקמות פגומות להפעיל תאים חיסוניים כדי לשחרר ציטוקינים / כימותרפים ומתווכים פרואינפלמטוריים אחרים המובילים להפעלת אנדותל, וכתוצאה מכך שינויים בתפקוד מחסום אנדותל כלי הדם וחדירות מוגברת 3,4 . הפעלה מוגברת של תאי אנדותל במהלך דלקת גורמת לאינטראקציה משופרת בין תאי לויקוציטים אנדותל המובילים להגירה מופרזת של לויקוציטים מופעלים על פני אנדותל כלי הדם לאיברים מרכזיים 1,5,6,7.

הגיוס של לויקוציטים הוא ביוזמת כימותרפיה מגוונת מבחינה כימית המורכב שומנים ביואקטיביים, ציטוקינים, כימותרפיה ורכיבים משלימים 8,9. גיוס לויקוציטים הוא תהליך רב-שלבי הכולל חמישה שלבים נפרדים: 1) שולי לויקוציטים ולכידה/קובץ מצורף, 2) מתגלגלים, 3) מעצר מוצק, 4) התפשטות וזחילה ו-5) אקסטרווגנציה/הגירה (איור 1). כל שלב בתהליך זה דורש הצלבות בין לויקוציטים לתאי אנדותל כדי לתזמר תופעה דינמית זו 1,9. בסופו של דבר, לויקוציטים שנעצרו מתפשטים לרקמות מודלקות על פני אנדותל באמצעות תהליך רב-שלבי הנשלט על ידי אותות תלויי כימותרפיה בו זמנית, אירועי דבק וכוחות גזירה המודינמיים 1,9,10,10,11,12.

בהתחשב בתפקיד המרכזי של מתח גזירה בוויסות תפקוד התא האנדותל ואת המשמעות של אינטראקציות תא לויקוציט-אנדותל13, מספר מודלים במבחנה פותחו במהלך העשורים האחרונים כדי ללמוד היבטים שונים של מפל הגירת לויקוציטים בסביבה מבוקרת יותר14. מכשירים נוזליים מסורתיים לחקר אינטראקציות תאי לויקוציטים-אנדותל יכולים להיות מסווגים לשתי קטגוריות רחבות14: א) התקנים לחקר גלגול לויקוציטים, ביטוי מולקולת הידבקות והידבקות כגון תאי זרימת צלחת מקבילים ו- b) התקנים לחקר נדידת לויקוציטים בתנאים סטטיים כגון תאי טרנסוול. מערכות כמו תאי זרימת לוחות מקבילים שימשו לחקר התפקידים של מולקולות הידבקות והליגנדים שלהם במפל ההדבקה תחת כוחות גזירה15. עם זאת, חיסרון משמעותי הוא כי אלה מכשירים פשטניים, אידיאליזציה (למשל, ערוץ ישר) אינם מסוגלים לשחזר את קנה המידה והגיאומטריה של microvasculature in vivo (למשל, bifurcations כלי דם רצופים, מורפולוגיה וסקולרית) ואת תנאי הזרימה וכתוצאה מכך (למשל, מתכנס או מתפצל זרמים ב bifurcations). כתוצאה מכך, התקנים אלה יכולים רק מודל הידבקות אבל לא טרנסגנציה. חדרי טרנסוול יכולים ללמוד הגירה רק בתנאים סטטיים מבלי לקחת בחשבון את התכונות הגיאומטריות של in vivo ותנאי הזרימה. לפיכך, מודלים מסורתיים אלה אינם מחקים את המיקרו-סביבה של רקמות חיות או פותרים הידבקות ונדידה מדורגת בבדיקה אחת6.

כדי להתמודד עם מגבלה זו, פיתחנו ואימתנו בהרחבה בדיקה מיקרופלואידית ביומימטית תלת-ממדית (bMFA) (איור 2), אשר מתרבה באופן מציאותי ברשתות מיקרו-וסקולריות של vivo על שבב 16,17,18. הפרוטוקול עבור microfabrication של מכשיר זה פורסם בעבר17 והוא מתואר רק בקצרה כאן. microvasculature של שריר קרמאסטר העכבר היה דיגיטציה באמצעות מערכת מידע גיאוגרפית שונה (GIS) גישה19. לאחר מכן, רשת המיקרו-וסקולרית הסינתטית נוצרה על פולידימתילסילוקסן (PDMS) באמצעות תהליכי ליטוגרפיה רכה המבוססים על רשת מיקרו-וסקולרית דיגיטלית 14,17,20,20,21,22. בקצרה, תמונות הרשת הדיגיטליות הודפסו על סרט Mylar, אשר שימש אז כמסכה כדי דפוס SU-8 פוטורזיסט חיובי על גבי רקיק סיליקון כדי ליצור את המאסטרים לייצור. עמודים microfabricated (קוטר 10 מיקרומטר, 3 מיקרומטר גבוה) שימשו ליצירת 3 מיקרומטר גבוה ו 100 מיקרומטר רחב נקבוביות, גודל אופטימלי עבור נדידת לויקוציטים 23,24,25, חיבור ערוצי כלי הדם ותאי הרקמות. PDMS הוכן על פי הוראות היצרן ושפך על המאסטרים המפותחים. יתר על כן, PDMS היה degassed והורשה לרפא לילה בתנור (65 °C (65 °F) כדי ליצור microchannels משלימים PDMS. לאחר מכן, PDMS נרפא היה קלוף מן מאסטר SU-8, ואחריו יציאות ניקוב עבור מפרצונים / שקעים. לאחר מכן, PMDS היה פלזמה מלוכד למגלשת זכוכית. פני השטח של המכשיר המיקרופלואידי כוללים זכוכית מקורית ו- PDMS. על מנת לקדם התקשרות לתאים, התפשטות והתפשטות, נדרש ציפוי מטריצה חוץ-סלוארית (ECM). ה-bMFA כולל רשת מיקרו-וסקולרית ותא רקמות המחובר באמצעות 3 מיקרומטר גבוה ונקבוביות רחבות של 100 מיקרומטר (איור 2). מערכת מיקרופלואידית זו משחזרת את כל מפל ההדבקה/הגירה של לויקוציטים בסביבה תלת-ממדית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית של רשת מיקרו-וסקולרית שלמה עם כלי חיבור וביזורים, כולל מחזור דם, שוליים, גלגול, הידבקות ונדידה של לויקוציטים לתא רקמת כלי הדם החוץ-וסקולריים במערכת אחת 14,16,17,21,26.

יש לציין כי גם כאשר קצב הזרימה בכניסה של bMFA קבוע, תנאי הזרימה ברשת משתנים במיקומים שונים ולא ניתן לחשב על ידי נוסחה מתמטית פשוטה. פותח מודל מבוסס דינמיקת נוזלים חישובית (CFD) כדי לחשב פרמטרי זרימה שונים (לדוגמה, לחץ גזירה, קצב הטיה, מהירות) במיקומים שונים ברשת. מודל CFD זה שימש כדי לדמות את דפוסי זלוף הצבע ואת פרמטרי הזרימה ב- bMFA. אימות צולב עם תוצאות ניסיוניות העלה כי התנגדויות הזרימה ברחבי הרשת מנבאות היטב על ידי המודל החישובי (איור 3)17. מודל CFD זה שימש אז להערכת פרופיל המהירות וקצב הגזירה בכל כלי של bMFA (איור 4), המאפשר ניתוח של ההשפעות של זרימת גזירה וגיאומטריה על גלגול לויקוציטים, הידבקות והגירה16. לויקוציטים מעדיפים לדבוק ליד bifurcations ובאזורי גזירה נמוכה ב vivo, ודפוסים מרחביים אלה של הידבקות לויקוציטים הודגמו בהצלחה bMFA באמצעות נויטרופילים (איור 5)16. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול להכנת bMFA לחקר אינטראקציה תאי לויקוציטים-אנדותל בתנאים דלקתיים באמצעות תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של ריאות אנושיות (HLMVEC) ונויטרופילים אנושיים. מערכות מיקרופיזיולוגיות, כגון bMFA, יכולות לשמש לחקר אינטראקציות תאי אנדותל עם סוגים שונים של תאים כגון נויטרופילים, מונוציטים, לימפוציטים ותאי גידול 18,27,28,29,30. ניתן לזרוע את ה- bMFA עם תאי אנדותל ראשוניים מאיברים שונים (למשל, ריאה מול מוח) ומינים שונים (למשל, תאי אנדותל אנושיים לעומת תאי מורין), כמו גם קווי תאי אנדותל 21,27,31,32. ניתן להשתמש ב- bMFA כדי לחקור תגובות תאיות מרובות, אינטראקציות בין תאים, תפקוד מחסום, משלוח סמים ורעילות סמים.

Protocol

דם אנושי הפריניזציה מתקבל לבידוד נויטרופילים מתורמים מבוגרים ובריאים (זכרים ונקבות, בגילאי 21 עד 60), לאחר הסכמה מדעת כפי שאושרה על ידי ועדת הבדיקה המוסדית של אוניברסיטת טמפל (פילדלפיה, פנסילבניה, ארה"ב).

1. התחלה וציפוי המכשיר עם פיברונקטין אנושי

הערה: bMFA כולל שתי יציאות כניסה ושתי יציאות שקע המחוברות לתא כלי הדם. יש לו גם יציאה אחת המחוברת לתא הרקמות (איור 2).

  1. הכנס צינורות (O.D. של 0.06 אינץ' ותעודת זהות של 0.02 אינץ' (טבלת חומרים) לכל היציאות למעט יציאת כניסה אחת עם מלקחיים עדינים. מהדקים את שתי יציאות השקע ואת יציאת תא הרקמות עם מלחצי לסתות. ודא כי כל צינורות הוא ~ 1 אינץ 'אורך.
  2. לדלל פיברונקטין אנושי ל 100 מיקרוגרם / מ"ל עם PBS מפתרון מלאי פיברונקטין (1mg / mL). טען מזרק 1 מ"ל עם פתרון פיברונקטין מוכן. חבר את המזרק למחט קהה של 24 גרם ולצינורות באורך 4 אינץ'.
    הערה: כדי למנוע קישור צולב, אין להתגבר על פיברונקטין אנושי של תערובת/פיפטה. מטריצות חוץ-תאיות אחרות (ECM) כגון קולגן עשויות לשמש לסוגי תאים שונים.
  3. הכנס את הצינורות ליצירת הכניסה הפתוחה, דחף את הבוכנה עד שפיברונקטין אנושי יוצא מיציאת הכניסה השנייה, ואז הדק אותו. חזור על תהליך זה עבור שאר היציאות עד שכל הערוצים, תא הרקמות והצנרת מלאים בתמיסת הפיברונקטין האנושית. הסר את המחט אך שמור את הצינורות באורך 4 אינץ 'מוכנסים ולא מסומנים.
    הערה: ודאו שהאמבטיות מלאות בפיברונקטין לפני שהן מהודקות.
  4. עבור degassing, לחבר את צינורות לא מסומנים למיכל חנקן דחוס דרך פריימר פניאומטי, להתאים את הלחץ ~ 5 פסאיי ולרוץ במשך ~ 15 דקות.
  5. לאחר 15 דקות, בדוק מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שאין בועות אוויר לכודות במכשיר. אם יש בועות אוויר לכודות בתא הערוץ או הרקמה, חבר מחדש את ההתקן לפריימר הפניאומטי להסרת גזים שוב, כלומר, חזור על שלב 1.4.
    הערה: מיקרוסקופ הפוך משמש בכל השלבים הכרוכים במיקרוסקופיה בפרוטוקול זה.
  6. הסר את ההתקן מהפריימר הפניאומטי. דגירה על המכשיר ב 37 °C (65 °F) למשך שעה אחת, ולאחר מכן לשטוף את כל הערוצים ותא הרקמות עם מדיה תרבותית HLMVEC שחוממה מראש (טבלת חומרים), בדומה לשלב 1.3. ה-bMFA מוכן כעת לזריעת תאים.
    הערה: לפני הסרה/החדרה של צינורות מהנמל, הניחו תחילה טיפת מים עם פיפטה סביב בסיס צינור יציאת הכניסה כדי למנוע כניסת אוויר למכשיר.

2. זריעת bMFA עם HLMVEC

  1. תרבות HLMVEC ל 60%-80% מפגש על פי פרוטוקול הספק בבקבוק T-25.
  2. שאפו מדיה תרבותית HLMVEC מבקבוקון תרבית תאים. לשטוף פעמיים עם PBS.
  3. הוסיפו 2 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA שחוממה מראש (37°C) בבקבוקון T-25. יש לדגר במשך 3-5 דקות באינקובטור (37°C, 5% CO2) עד שרוב התאים מנותקים מהבקבוקון.
    הערה: זמן הדגירה עשוי להשתנות עבור סוגי תאים שונים וריכוז טריפסין-EDTA.
  4. הוסף 2 מ"ל של פתרון נטרול טריפסין (TNS, 37 °C) לבקבוקון כדי לנטרל טריפסין-EDTA.
  5. הקש בעדינות על הבקבוקון כדי לעזור לנתק את התאים. לאחר מכן, להעביר את פתרון ההשעיה התא צינור חרוטי 15 מ"ל.
  6. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 150 x גרם כדי גלולה את תאי האנדותל. הסר את התאים העל-טבעיים והמתחדשים ב- 3 מ"ל של מדיה של תרבית תאים. לספור את מספר התאים עם hemocytometer.
  7. צנטריפוגה שוב במשך 5 דקות ב 150 x g כדי גלולה התאים. הסר את supernatant ו resuspened התאים לצפיפות הזריעה הרצויה של 20 x 106/ מ"ל.
    הערה: בהתאם לסוגי התאים והמפגש, ניתן לאסוף כ-2 x 106 תאי אנדותל משני צלוחיות T-25, ועם צפיפות הזריעה של 20 x 106/mL, 100 μL של השעיית התא (2 x 106 תאי אנדותל), מספיק כדי לזרוע 5 התקנים.
  8. התקן מזרק 1 מ"ל במשאבת מזרק לתכנות, לצרף צינורות למחט קהה.
  9. צייר ~ 20 μL של ההשעיה התא לתוך הצינורות, לוודא את ההשעיה התא הוא רק בצינורות, לא בחבית מזרק.
  10. הסר את המלחציים מיציאת שקע של ההתקן. חבר את הצינורות לכניסה אחת של ההתקן. ודא שאין בועות אוויר מוכנסות לתוך הערוץ.
  11. התחל את המשאבה עם קצב זרימה של 4-8 μL / min. שים לב להתקן תחת מיקרוסקופ.
  12. כאשר הערוצים מלאים בתאים, עצרו את המשאבה, הידקו את השקע וחתכו את הצינורות הנכנסים.
    הערה: יש להקפיד לא להכניס בועות אוויר למכשיר.
  13. שים את המכשיר בחממה במשך 4 שעות ב 5% CO2 ו 37 °C (55 °F).
  14. לאחר דגירה של 4 שעות, הכינו מזרק נוסף מלא במדיה טרייה של תרבית התאים. הר את המזרק על משאבת מזרק, חבר את המזרק ליציאת הכניסה והסר את המלחציים מיציאת שקע.
  15. הפעל מדיה טרייה דרך המכשיר במשך כ 5 דקות ב 4-8 μL / min כדי לשטוף את תאים צפים / לא מחוברים.

3. תרבית תאים תחת זרימה במשך 48 שעות

  1. הכן מזרק מלא במדיה רעננה של תרבית תאים. הרכיבו את המזרק במשאבת מזרק, חברו את המזרק ליציאת כניסה אחת ושמרו על שקע פתוח. שים את המכשיר באינקובטור (5% CO2, 37 °C (57 °F).
  2. תכנת את משאבת המזרק לפולחן תאי אנדותל תחת זרימה באמצעות ההוראות הבאות המוזכרות בטבלה 1.
  3. בדוק את bMFA תחת מיקרוסקופ לאחר 48 שעות של תרבות תחת זרימה. HLMVEC צריך לכסות ערוצי כלי דם היוצרים לומן מלא (איור 6).
    הערה: ייתכן שיידרשו משטרי זרימה אחרים עבור סוגי תאים שונים.

4. ציטוקינים ו/או טיפול טיפולי

הערה: כדוגמה, סעיף זה מתאר את השימוש ב- bMFA כדי לחקור את ההשפעה של טיפול בתאים עם גורם נמק גידול-אלפא (TNF-α) ומעכב אנטי דלקתי חדשני (מעכב פפטיד חלבון Kinase C delta-TAT, PKCδ-i)18,27,32,33,34,35,36.

  1. הכן שלושה התקני bMFA שונים באמצעות הפרוטוקול לעיל (סעיף 1-3).
  2. טען שלושה מזרקים של 1 מ"ל עם מדיה של תרבית תאים, (TNF-α) (10 ננוגרם/מ"ל), TNF-α (10 ננוגרם/מ"ל) + PKCδ-i (5 מיקרומטר), בהתאמה.
    הערה: ציטוקינים משוחזרים במדיה של תרבית תאים.
  3. חבר את שלושת המזרקים לשלושה התקני bMFA. טיפול HLMVEC עם מאגר TNF-α או TNF-α + מעכב במשך 4 שעות ב 0.1 μL / min.
    הערה: בהתבסס על דרישות מחקר ספציפיות, ציטוקינים אחרים או קוקטיילים ציטוקינים (למשל, TNF-α + Interleukin 1 בטא (IL1-β) + אינטרפרון-גמא (IFN-γ)), עשוי לשמש לטיפול בתאי אנדותל.

5. בידוד נויטרופילים אנושי

  1. השתמש בכל הריאגנטים בטמפרטורת החדר (RT). ריאגנטים כוללים מדיית בידוד לויקוציטים , חיץ HEPES 1x עם Ca2 +/Mg2+ (טבלה 2), 6% דקסטרן מלוחים רגילים (0.9% NaCl), 3.6% פתרון NaCl ומים דה-יונים (DI).
  2. Pipette 20 מ"ל של תקשורת בידוד לויקוציטים לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל בזהירות שכבה 25 מ"ל של דם על התקשורת בידוד לויקוציטים. צנטריפוגה במשך 40 דקות ב 427 x g ב RT.
    הערה: בצע שלב זה לאט ובזהירות כדי למנוע ערבוב הדם ומדיית בידוד לויקוציטים.
  3. לשאוף עד ~ 5 מ"ל מעל תאי דם אדומים (RBC) שכבה. שכבת הבאפי הלבנה על גבי ה-RBC היא בעיקר נויטרופילים.
  4. הוסף מאגר HEPES כדי להכפיל את אמצעי האחסון הנוכחי (אמצעי אחסון קיים: מאגר HEPES = 1:1).
  5. הוסף כמות של 6% Dextran, אשר יהיה 20% של נפח הסופי. (אמצעי אחסון נוכחי/4 = נפח של 6% Dextran הוסיף).
  6. הופכים את הצינור בעדינות כמה פעמים כדי לערבב היטב ולתת את המשקעים RBC (~ 25 דקות).
  7. בזהירות pipette השכבה העליונה (שכבה עשירה בנויטרופילים) ולהעביר לצינור חדש 50 מ"ל, להיזהר לא לזהם עם RBC משקע.
  8. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 315 x גרם ב RT. להסיר את supernatant ולהחזיר את הכדור ב 8 מ"ל של חיץ HEPES.
  9. כדי ליסס את שאריות RBC, מוסיפים 24 מ"ל של מים DI ומערבבים בעדינות במשך 50 שניות. מיד, להוסיף 8 מ"ל של 3.6% פתרון NaCl, לערבב וצנטריפוגה במשך 10 דקות ב 315 x g ב RT.
  10. הסר את supernatant, לשטוף את גלולה התא עם 15 מ"ל של חיץ HEPES וצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 315 x גרם. resuspend את הכדור במאגר HEPES.

6. הידבקות נויטרופיל וניסוי הגירה עם bMFA

  1. Resuspend הנויטרופילים האנושיים המבודדים (15 מיליון) ב 999 μL של חיץ HEPES.
  2. הוסף 1 μL CFDA-SE (carboxyfluorescein diacetate succinimidyl אסתר) פתרון מלאי צבע (10 מ"מ) כדי השעיית נויטרופיל כדי לקבל ריכוז עובד של 10 מיקרומטר CFDA-SE ודגרה במשך 10 דקות ב RT. לשטוף את התאים פעמיים עם מאגר HEPES על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 315 x גרם.
  3. לספור את הנויטרופילים באמצעות hemocytometer ו resuspend ב 2 מיליון נויטרופילים / מ"ל עם מדיה תרבית התא, TNF-α (10 ng / mL) ו TNF-α (10 ng / mL) + PKCδ-i (5 מיקרומטר), בהתאמה; דגירה במשך 15 דקות ב RT לפני תחילת הניסוי.
  4. הכן מזרק מלא 1 μM N-formyl-met-leu-phe (fMLP), כימותרפיה למחקר, בתקשורת תרבות התא. קח את bMFA ופתח יציאת כניסה אחת ויציאת שקע אחת.
    הערה: תנאים ניסיוניים אלה משמשים כדי לחקות את התנאים של אלח דם הכוללים תגובה דלקתית מערכתית עם רמות גבוהות של ציטוקינים במחזור / כימותרפיה. יתר על כן, fMLP, פפטיד שמקורו חיידקים גרם שלילי, משמש כדי לדגמן את נוכחותם של חיידקים בריאה (כלומר, תא רקמות).
  5. הסר את צינורות יציאת תא הרקמות והכנס את צינורות fMLP. הזרק ~ 20 μL של fMLP לתוך תא הרקמה עבור כל bMFA, למעט אחד מטופל עם מדיה תרבית התא בלבד. ואז לחתוך את הצינורות ומהדקים אותו.
  6. מלא את המזרק עם ~ 200 μL של השעיית נויטרופיל ולהרכיב את המזרק על משאבת המזרק.
  7. שים את המכשיר על במת המיקרוסקופ ההפוכה (טבלת חומרים).
  8. התחל את המשאבה בקצב זרימה הוא 1 μL / דקה ולחכות עד טיפה קטנה של ההשעיה נויטרופיל יוצא הצינורות. הכנס את הצינורות ליציאת הכניסה. ראו איור 7 להגדרה.

7. לרכוש תמונות

  1. השתמש בפונקציה Scan Large Image בתוכנת ניתוח התמונה של המיקרוסקופ (טבלת חומרים) כדי להשיג את מפת ההדבקה ב-bMFA (איור 8) 10 דקות לאחר תחילת הניסוי. רוב הנויטרופילים נכנסים ל-bMFA במהלך 10 הדקות הראשונות.
    הערה: יש לכבות את נורית הפלואורסצנטיות כאשר אינכם מצלמים תמונות כדי להפחית את הלבנת התמונות.
  2. במהלך השעה הבאה, צלמו תמונות timelapse (תמונה אחת כל 5 דקות) של תא הרקמות (איור 8B,C) לניתוח נדידה כדי לקבל את מפת הנדידה.

8. ניתוח תמונה דיגיטלית

  1. עבור מפת ההידבקות, לספור את מספר הנויטרופילים דבוקים בכל כלי. עבור כל bifurcation, ליצור אזור מעגלי של עניין (ROI) עם קוטר שווה פי שניים קוטר הכלי ולספור את מספר הנויטרופילים דבוקים.
  2. השתמש בספירה ידנית או בפונקציה האוטומטית Object Count כדי לכמת את מספר הנויטרופילים הדביקים בכל כלי שיט ואזור ביפורציה.
  3. השתמש במפת קצב ההטיה של הרשת שנוצרה באמצעות סימולציית CFD17 כדי לקבוע את קצב ההטיה בכל כלי שיט. לאחר מכן התווה את מספר הנויטרופילים הדבוקים בכלי נתון כנגד קצב הגזירה בכלי זה כדי ליצור מפת קצב גזירה ב-bMFA כפי שמוצג באיור 9A.
  4. נויטרופילים נספרים כנדודים אם הם חצו דרך האנדותל לתא הרקמות. לספור את מספר הנויטרופילים שנדדו ב 10 דקות, 15 דקות, 30 דקות ו 60 דקות. התווה את מספר הנויטרופילים שהועברו לעומת הזמן כפי שמוצג באיור 9B.

תוצאות

לאחר 48 שעות של תרבית תחת זרימת גזירה ב-bMFA, תאי אנדותל כיסו את פני השטח של ערוצי כלי הדם ב-bMFA והתיישרו לכיוון הזרימה (איור 6). מיקרוסקופיה קונפוקלית הצביעה על כך שכל המשטחים של ערוצי כלי הדם כוסו על ידי תאי אנדותל, ויצרו לומן תלת-ממדי שלם ב- bMFA18.

באמצע...

Discussion

ה- bMFA משחזר את הטופוגרפיה ואת תנאי הזרימה של רשתות מיקרו-וסקולריות in vivo וניתן להשתמש בו כדי ללמוד אינטראקציה תאי לויקוציטים אנדותל ותפקוד אנדותל במבחנה בתנאים מציאותיים מבחינה פיזיולוגית. במיקרו-וואסקטור של עכבר או אדם, הגיאומטריה של רשתות המיקרו-וסקולריות דומה לעצמם ופרקטלית, ...

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, מספר מענק: GM1114359 ו- GM134701 (M.F.K. ו- L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), והסוכנות להפחתת איומי הגנה, מספר מענק: HDTRA11910012 (M.F.K. ו- L.E.K.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringeFisher Scientific14-823-30
Biomimetic microfluidic assay (bMFA)SynVivoSMN1-C001Exclusive at SynVivo
Blunt needleJensen GlobalJG24-0.5
Calcium ChlorideFisher ScientificC70-500
CFDA, SEThermoFisherC1157
Dextran, 250,000, PowderSpectrum Chemical Mfg. CorpDE-130
Ficoll-Paque PremiumGE Health Care17-5442-02Leukocyte isolation media
fMLPSigma-AldrichF3506
HepesFisher ScientificAAJ1692630
Human fibronectinFisher Scientific33-016-015use vendor recommended ECM for different cell lines
Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitLonzacc-3202Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC).
Human lung microvascular endothelial cellsLonzacc-2527use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS
Magnesium ChlorideFisher ScientificBP214-500
Nikon Eclipse Ti2Nikon Instruments Inc.Microscope
NIS-elements, 5.20.01Nikon Instruments Inc.Imaging software
PBSFisher ScientificMT21040CV
PhD Ultra Syringe PumpHarvard Apparatus70-3007Syringe Pump
Potassium HydroxideFisher Scientific02-003-763
Recombinant Human TNF-alphaR&D Systems210-TA
Slide clampSynVivo
Sodium ChlorideFisher ScientificS640-500
Synvivo Pneumatic PrimerSynVivo
Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS)Lonzacc-5034
Tygon tubingFisher Scientific50-206-8921Tubing

References

  1. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
  2. Yang, Q., Wijerathne, H., Langston, J. C., Kiani, M. F., Kilpatrick, L. E. Emerging approaches to understanding microvascular endothelial heterogeneity: A roadmap for developing anti-inflammatory therapeutics. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7770 (2021).
  3. Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H. Endothelial responses in sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202, 361-370 (2020).
  4. Ince, C., et al. The endothelium in sepsis. Shock. 45, 259-270 (2016).
  5. Ruparelia, N., Chai, J. T., Fisher, E. A., Choudhury, R. P. Inflammatory processes in cardiovascular disease: a route to targeted therapies. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 133-144 (2017).
  6. Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. Experimental approaches to evaluate leukocyte-endothelial cell interactions in sepsis and inflammation. Shock. 53, 585-595 (2020).
  7. Langer, H. F., Chavakis, T. Leukocyte-endothelial interactions in inflammation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (7), 1211-1220 (2009).
  8. Sadik, C. D., Luster, A. D. Lipid-cytokine-chemokine cascades orchestrate leukocyte recruitment in inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 91 (2), 207-215 (2012).
  9. Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature Medicine. 17, 1381-1390 (2011).
  10. Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Current Opinion in Critical Care. 14, 22-30 (2008).
  11. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).
  12. Molteni, R., Fabbri, M., Bender, J. R., Pardi, R. Pathophysiology of leukocyte-tissue interactions. Current Opinion in Cell Biology. 18, 491-498 (2006).
  13. Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
  14. Prabhakarpandian, B., Shen, M. -. C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
  15. Zou, X., et al. PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 289, 415-424 (2005).
  16. Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Analytical Chemistry (Journal). 86, 8344-8351 (2014).
  17. Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion. Biomedical Microdevices. 10 (4), 585-595 (2008).
  18. Soroush, F., et al. A novel microfluidic assay reveals a key role for protein kinase C delta in regulating human neutrophil-endothelium interaction. Journal of Leukocyte Biology. 100, 1027-1035 (2016).
  19. Roth, N. M., Kiani, M. F. A "geographic information systems" based technique for the study of microvascular networks. Annals of Biomedical Engineering. 27, 42-47 (1999).
  20. Prabhakarpandian, B., Wang, Y. I., Rea-Ramsey, A., Sundaram, S., Kiani, M. F., Pant, K. Bifurcations: Focal points of particle adhesion in microvascular networks. Microcirculation. 18, 380-389 (2011).
  21. Rosano, J., et al. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
  22. Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent. Microvascular Research. 80, 384-388 (2010).
  23. Yona, S., Hayhoe, R., Avraham-Davidi, I. Monocyte and neutrophil isolation and migration assays. Current Protocols in Immunology. 88 (1), 11-14 (2010).
  24. Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Experimental Cell Research. 307 (2), 418-426 (2005).
  25. Chen, H. -. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , (2005).
  26. Deosarkar, S. P., Prabhakarpandian, B., Wang, B., Sheffield, J. B., Krynska, B., Kiani, M. F. A novel dynamic neonatal blood-brain barrier on a chip. PloS one. 10, 142725 (2015).
  27. Soroush, F., et al. Neutrophil-endothelial interactions of murine cells is not a good predictor of their interactions in human cells. The FASEB Journal. 34, 2691-2702 (2020).
  28. Soroush, F., et al. Protein Kinase C-Delta (PKCδ) tyrosine phosphorylation is a critical regulator of neutrophil-endothelial cell interaction in inflammation. Shock. 51 (5), 538-547 (2019).
  29. Soroush, F., Tang, Y., Zaidi, H. M., Sheffield, J. B., Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. PKCδ inhibition as a novel medical countermeasure for radiation-induced vascular damage. The FASEB Journal. 32, 6436-6444 (2018).
  30. Pradhan, S., et al. A microvascularized tumor-mimetic platform for assessing anti-cancer drug efficacy. Scientific Reports. 8 (1), 3171 (2018).
  31. Tang, Y., et al. A biomimetic microfluidic tumor microenvironment platform mimicking the EPR effect for rapid screening of drug delivery systems. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
  32. Tang, Y., et al. Protein kinase C-delta inhibition protects blood-brain barrier from sepsis-induced vascular damage. Journal of Neuroinflammation. 15, 309 (2018).
  33. Mondrinos, M. J., et al. Pulmonary endothelial protein kinase C-delta (PKCd) regulates neutrophil migration in acute lung inflammation. The American Journal of Pathology. 184, 200-213 (2014).
  34. Kilpatrick, L. E., et al. Protection against sepsis-induced lung injury by selective inhibition of protein kinase C-d (d-PKC). Journal of Leukocyte Biology. 89, 3-10 (2011).
  35. Mondrinos, M. J., et al. Biodistribution and efficacy of targeted pulmonary delivery of a protein kinase C-d inhibitory peptide: Impact on Indirect lung Injury. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355, 86-98 (2015).
  36. Liverani, E., Mondrinos, M. J., Sun, S., Kunapuli, S. P., Kilpatrick, L. E. Role of protein kinase C-delta in regulating platelet activation and platelet-leukocyte interaction during sepsis. PloS one. 13, 0195379 (2018).
  37. Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of shear adhesion map using SynVivo synthetic microvascular networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51025 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

178

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved