JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokolde, fizyolojik olarak ilgili bir mikrovasküler ortamı yeniden üretebilen ve tüm lökosit adezyon / migrasyon kaskadını yeniden üretebilen bir biyomimetik mikroakışkan testi, inflamatuar hastalıkta lökosit-endotel hücre etkileşimlerini incelemek için kullanılmaktadır.

Özet

Lökosit-endotelyal hücre etkileşimleri sepsis gibi inflamatuar hastalıklarda önemli rol oynamaktadır. Enflamasyon sırasında, aktif lökositlerin vasküler endotel boyunca anahtar organlara aşırı göçü organ yetmezliğine yol açabilir. Fizyolojik olarak ilgili bir biyomimetik mikroakışkan testi (bMFA), lökosit-endotelyal hücre etkileşimlerini incelemek için tüm lökosit haddeleme / adezyon / migrasyon kaskadını yeniden üretebilen çeşitli deneysel ve hesaplama teknikleri kullanılarak geliştirilmiş ve doğrulanmıştır. Kemirgenlerde in vivo görüntülerden elde edilen mikrovasküler ağlar, Coğrafi Bilgi Sistemi (CBS) yaklaşımı kullanılarak sayısallaştırıldı ve mikroskop slaytı üzerinde polidimetilsiloksan (PDMS) ile mikrofabrikasyona tabi tutuldu. Kesme hızının ve vasküler topolojinin lökosit-endotel hücre etkileşimleri üzerindeki etkisini incelemek için, ağ boyunca kayma hızlarının ve hızlarının karşılık gelen bir haritasını oluşturmak için bir Hesaplamalı Akışkanlar Dinamiği (CFD) modeli geliştirilmiştir. bMFA, yuvarlanma hızı, farklı kesme oranlarına yanıt olarak yapıştırılmış lökosit sayısı, göç eden lökosit sayısı, endotel hücre geçirgenliği, adezyon molekülü ekspresyonu ve diğer önemli değişkenler dahil olmak üzere lökosit-endotel hücre etkileşimlerinin miktarını sağlar. Ayrıca, insan endotel hücreleri ve lökositler gibi insanla ilgili örnekleri kullanarak, bMFA, klinik çevrilebilirliklerini artırmak için potansiyel terapötiklerin hızlı bir şekilde taranması için bir araç sağlar.

Giriş

Enflamasyon, enfeksiyon ve yaralanmaya karşı konakçı yanıtıdır ve endotel, inflamatuar yanıtta önemli bir rol oynar 1,2,3. İnflamatuar disregülasyon, sepsis, kardiyovasküler hastalıklar, astım, inflamatuar bağırsak hastalığı, kanser ve COVID-19 gibi bir dizi hastalık patolojisinin altında yatan nedendir. Lökosit-endotelyal hücre etkileşimleri bu inflamatuar hastalıklarda merkezi bir rol oynamaktadır. Enflamasyon sırasında, patojenlerden PAMPS'nin (patojenle ilişkili moleküler paternler) veya hasarla ilişkili moleküler paternler) yaralı dokulardan DAMPS'lerin (hasarla ilişkili moleküler paternler) salınması, endotelin aktivasyonuna yol açan sitokinler / kemokinler ve diğer proinflamatuar mediatörleri serbest bırakmak için bağışıklık hücrelerini aktive eder, bu da vasküler endotel bariyer fonksiyonunda değişikliklere ve geçirgenliğin artmasına neden olur 3,4 . Enflamasyon sırasında endotel hücrelerinin artan aktivasyonu, artmış lökosit-endotel hücre etkileşimi ile sonuçlanır ve aktif lökositlerin vasküler endotel boyunca anahtar organlara aşırı göçüne yol açar 1,5,6,7.

Lökositlerin işe alımı, biyoaktif lipitler, sitokinler, kemokinler ve kompleman bileşenlerinden oluşan kimyasal olarak çeşitli kemoattractantlar tarafından başlatılır 8,9. Lökosit işe alımı, beş ayrı adımı içeren çok adımlı bir süreçtir: 1) lökosit marjinasyonu ve yakalama / bağlanma, 2) yuvarlanma, 3) sıkı tutuklama, 4) yayılma ve tarama ve 5) ekstravazasyon / göç (Şekil 1). Bu sürecin her adımı, bu dinamik fenomeni düzenlemek için lökositler ve endotel hücreleri arasında çapraz konuşma gerektirir 1,9. Nihayetinde, tutuklanan lökositler, eşzamanlı kemoattractant'a bağımlı sinyaller, yapışkan olaylar ve hemodinamik kesme kuvvetleri 1,9,10,11,12 tarafından kontrol edilen çok adımlı bir süreçle endotel boyunca iltihaplı dokulara ekstravaze olurlar.

Endotel hücre fonksiyonunun düzenlenmesinde kayma stresinin merkezi rolü ve lökosit-endotel hücre etkileşimlerinin önemi göz önüne alındığında13, lökosit migrasyon kaskadının çeşitli yönlerini daha kontrollü bir ortamda incelemek için son birkaç on yılda birkaç in vitro model geliştirilmiştir14. Lökosit-endotelyal hücre etkileşimlerini incelemek için geleneksel akışkan cihazlar iki geniş kategoriye ayrılabilir14: a) paralel plaka akış odaları gibi lökosit haddeleme, yapışma ve adezyon molekülü ekspresyonunu incelemek için cihazlar ve b) transwell odaları gibi statik koşullar altında lökosit göçünü incelemek için cihazlar. Paralel plaka akış odaları gibi sistemler, yapışma moleküllerinin ve ligandlarının kesme kuvvetleri15 altındaki yapışma kaskadındaki rollerini incelemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, önemli bir dezavantaj, bu basit, idealize edilmiş cihazların (örneğin, düz kanal), in vivo mikrovaskülatürün ölçeğini ve geometrisini (örneğin, ardışık vaskülarjikasyonlar, vasküler morfoloji) ve sonuçta ortaya çıkan akış koşullarını (örneğin, bifurkasyonlarda yakınsak veya saptırıcı akışlar) yeniden üretememesidir. Sonuç olarak, bu cihazlar yalnızca yapışmayı modelleyebilir, ancak geçişi modelleyemez. Transwell odaları, in vivo geometrik özellikleri ve akış koşullarını dikkate almadan yalnızca statik koşullar altında transmigrasyon üzerinde çalışabilir. Bu nedenle, bu geleneksel modeller canlı dokuların mikro ortamını taklit etmez veya yapışma ve göç kaskadını tek bir tahlilde çözmez6.

Bu sınırlamayı ele almak için,16,17,18 çip üzerinde in vivo mikrovasküler ağları gerçekçi bir şekilde yeniden üreten yeni bir 3D biyomimetik mikroakışkan testi (bMFA) geliştirdik ve kapsamlı bir şekilde doğruladık. Bu cihazın mikrofabrikasyonu için protokol daha önce17 yayınlanmıştır ve burada sadece kısaca açıklanmıştır. Fare cremaster kasının mikrovaskülatürü, modifiye edilmiş bir Coğrafi Bilgi Sistemi (CBS) yaklaşımı19 kullanılarak sayısallaştırılmıştır. Daha sonra, sentetik mikrovasküler ağ, sayısallaştırılmış mikrovasküler ağ 14,17,20,21,22'ye dayanan yumuşak litografi işlemleri kullanılarak polidimetilsiloksan (PDMS) üzerinde üretildi. Kısaca, sayısallaştırılmış ağ görüntüleri Mylar filmine basıldı ve daha sonra imalat için ustalar oluşturmak için bir silikon gofret üzerine SU-8 pozitif fotodirenci modellemek için bir maske olarak kullanıldı. Mikrofabrikasyon sütunlar (10 μm çap, 3 μm boyunda), vasküler kanalları ve doku bölmelerini birbirine bağlayan lökosit migrasyonu23,24,25 için optimum boyut olan 3 μm yüksekliğinde ve 100 μm genişliğinde gözenekler oluşturmak için kullanılmıştır. PDMS, üreticinin talimatlarına göre hazırlandı ve geliştirilen ustaların üzerine döküldü. Ayrıca, PDMS gazdan arındırıldı ve PDMS'de tamamlayıcı mikro kanallar oluşturmak için bir fırında (65 ° C) gece boyunca kürlenmesine izin verildi. Daha sonra, kürlenmiş PDMS SU-8 master'dan soyuldu, ardından girişler / çıkışlar için delme portları izlendi. Daha sonra, PMDS plazma bir cam slayta bağlandı. Mikroakışkan cihazın yüzeyi doğal cam ve PDMS'den oluşur. Hücre bağlanmasını, yayılmasını ve çoğalmasını teşvik etmek için, hücre dışı matris (ECM) kaplaması gereklidir. bMFA, mikrovasküler bir ağ ve 3 μm yüksekliğinde ve 100 μm genişliğinde gözeneklerle bağlanmış bir doku bölmesi içerir (Şekil 2). Bu mikroakışkan sistem, lökositlerin dolaşımı, marjinasyonu, yuvarlanması, yapışması ve ekstravasküler doku bölmesine göçü dahil olmak üzere birbirine bağlı damarlar ve çatallanmalar ile tam bir mikrovasküler ağın fizyolojik olarak ilgili 3D ortamında tüm lökosit yapışması / migrasyon kaskadını tek bir sistemde yeniden üretir 14,16,17,21,26.

bMFA girişindeki akış hızı sabit olsa bile, ağdaki akış koşullarının farklı yerlerde değiştiği ve basit bir matematiksel formülle hesaplanamayacağı belirtilmelidir. Ağdaki farklı konumlarda farklı akış parametrelerini (örneğin, kesme gerilimi, kesme hızı, hız) hesaplamak için hesaplamalı akışkanlar dinamiği (CFD) tabanlı bir model geliştirilmiştir. Bu CFD modeli, bMFA'daki boya perfüzyon modellerini ve akış parametrelerini simüle etmek için kullanılmıştır. Deneysel sonuçlarla çapraz doğrulama, ağ üzerindeki akış dirençlerinin hesaplama modeli tarafından iyi tahmin edildiğini göstermiştir (Şekil 3)17. Bu CFD modeli daha sonra bMFA'nın her bir kabındaki hız ve kesme hızı profilini tahmin etmek için kullanıldı (Şekil 4), kesme akışının ve geometrinin lökosit haddeleme, yapışma ve migrasyon üzerindeki etkilerinin analizine izin verdi16. Lökositler tercihen bifurkasyonların yakınında ve düşük kesme bölgelerinde in vivo olarak yapışırlar ve lökosit yapışmasının bu uzamsal kalıpları nötrofiller kullanılarak bMFA'da başarıyla gösterilmiştir (Şekil 5)16. Bu yazıda, insan akciğer mikrovasküler endotel hücreleri (HLMVEC) ve insan nötrofilleri kullanılarak enflamatuar koşullar altında lökosit-endotelyal hücre etkileşimini incelemek için bMFA'nın hazırlanması protokolü açıklanmaktadır. bMFA gibi mikrofizyolojik sistemler, nötrofiller, monositler, lenfositler ve tümör hücreleri 18,27,28,29,30 gibi farklı hücre tipleriyle endotel hücre etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir. bMFA, farklı organlardan (örneğin, akciğere karşı beyin) ve farklı türlerden (örneğin, insan ve murin endotel hücreleri) birincil endotel hücreleri ve endotel hücre hatları21,27,31,32 ile tohumlanabilir. bMFA, çoklu hücresel yanıtları, hücre-hücre etkileşimlerini, bariyer fonksiyonunu, ilaç dağıtımını ve ilaç toksisitesini incelemek için kullanılabilir.

Protokol

Heparinize insan kanı, Temple Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (Philadelphia, PA, ABD) tarafından onaylanan bilgilendirilmiş onam sonrasında, sağlıklı yetişkin donörlerden (21 ila 60 yaşları arasındaki erkek ve kadınlar) nötrofil izolasyonu için elde edilir.

1. Cihazın insan fibronektini ile astarlanması ve kaplanması

NOT: bMFA'nın vasküler bölmeye bağlı iki giriş bağlantı noktası ve iki çıkış bağlantı noktası vardır. Ayrıca doku bölmesine bağlı bir portu vardır (Şekil 2).

  1. İnce noktalı forsepsli bir giriş portu hariç tüm portlara boru (0.06" O.D. ve 0.02") ID'si (Malzeme Tablosu) yerleştirin. İki çıkış portunu ve doku bölmesi portunu çene kelepçeleri ile kelepçeleyin. Her borunun ~ 1 inç uzunluğunda olduğundan emin olun.
  2. İnsan fibronektinini fibronektin stok çözeltisinden (1mg / mL) PBS ile 100 μg / mL'ye seyreltin. Hazırlanmış fibronektin çözeltisi ile 1 mL'lik bir şırınga yükleyin. Şırıngayı 24 G künt iğneye ve ~ 4 inç uzunluğunda bir boruya bağlayın.
    NOT: Çapraz bağlanmayı önlemek için, insan fibronektinini karıştırmayın / pipet kullanmayın. Kollajen gibi diğer hücre dışı matrisler (ECM) farklı hücre tipleri için kullanılabilir.
  3. Boruyu açık giriş portuna yerleştirin, insan fibronektininin diğer giriş portundan çıkana kadar pistonu itin, ardından kelepçeleyin. Tüm kanallar, doku bölmesi ve boru insan fibronektin çözeltisi ile doldurulana kadar portların geri kalanı için bu işlemi tekrarlayın. İğneyi çıkarın, ancak 4 inç uzunluğundaki boruyu takılı ve açılmamış halde tutun.
    NOT: Kelepçelenmeden önce borunun fibronektin ile doldurulduğundan emin olun.
  4. Gazdan arındırma için, kapaksız boruyu Pnömatik Astar üzerinden sıkıştırılmış bir azot tankına bağlayın, basıncı ~5 psi'ye ayarlayın ve ~ 15 dakika boyunca çalıştırın.
  5. 15 dakika sonra, cihazda sıkışmış hava kabarcığı olmadığından emin olmak için mikroskop altında kontrol edin. Kanalda veya doku bölmesinde sıkışmış hava kabarcıkları varsa, tekrar gaz gidermek için cihazı Pnömatik Astar'a yeniden bağlayın, yani adım 1.4'ü tekrarlayın.
    NOT: Ters mikroskop, bu protokolde mikroskopi içeren tüm adımlarda kullanılır.
  6. Cihazı Pnömatik Astardan çıkarın. Cihazı 1 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin, ardından tüm kanalları ve doku bölmesini adım 1.3'e benzer şekilde önceden ısıtılmış HLMVEC kültür ortamı (Malzeme Tablosu) ile yıkayın. bMFA artık hücre tohumlaması için hazırdır.
    NOT: Bir boruyu porttan çıkarmadan/yerleştirmeden önce, havanın cihaza girmesini önlemek için giriş portu borusunun tabanının etrafına pipetli bir damla su yerleştirin.

2. HLMVEC ile bMFA tohumlama

  1. Kültür HLMVEC, bir T-25 şişesinde satıcının protokolüne göre% 60 -% 80 akıcılığa sahiptir.
  2. Hücre kültürü şişesinden HLMVEC kültür ortamını aspire edin. PBS ile iki kez yıkayın.
  3. T-25 şişesine 2 mL önceden ısıtılmış tripsin-EDTA çözeltisi (37 ° C) ekleyin. Çoğu hücre şişeden ayrılana kadar bir inkübatörde (37 ° C,% 5 CO2) 3-5 dakika boyunca inkübe edin.
    NOT: Kuluçka süresi farklı hücre tipleri ve tripsin-EDTA konsantrasyonu için değişebilir.
  4. Tripsin-EDTA'yı nötralize etmek için şişeye 2 mL Tripsin Nötralizasyon Çözeltisi (TNS, 37 °C) ekleyin.
  5. Hücrelerin ayrışmasına yardımcı olmak için şişeye hafifçe dokunun. Ardından, hücre süspansiyon çözeltisini 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
  6. Endotel hücrelerini peletlemek için 150 x g'de 5 dakika santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve 3 mL hücre kültürü ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın. Bir hemositometre ile hücre sayısını sayın.
  7. Hücreleri peletlemek için 150 x g'de 5 dakika boyunca tekrar santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve hücreleri istenen 20 x 106 / mL tohumlama yoğunluğuna yeniden askıya alın.
    NOT: Hücre tiplerine ve akıcılığına bağlı olarak, iki T-25 şişesinden yaklaşık 2 x 10 6 endotel hücresi toplanabilir ve 20 x 10 6 / mL'lik tohumlama yoğunluğu ile hücre süspansiyonunun 100 μL'si (2 x 106 endotel hücresi), 5 cihazı tohumlamak için yeterlidir.
  8. Programlanabilir şırınga pompasına 1 mL'lik bir şırınga takın, künt iğneye boru takın.
  9. Hücre süspansiyonunun ~ 20 μL'sini boruya çekin, hücre süspansiyonunun şırınga namlusunda değil, yalnızca boruda olduğundan emin olun.
  10. Kelepçeyi cihazın çıkış portundan çıkarın. Boruyu cihazın bir girişine bağlayın. Kanala hava kabarcığı girmediğinden emin olun.
  11. Pompayı 4-8 μL/dak debi ile çalıştırın. Cihazı mikroskop altında gözlemleyin.
  12. Kanallar hücrelerle doldurulduğunda, pompayı durdurun, çıkışı kelepçeleyin ve giriş borusunu kesin.
    NOT: Cihaza hava kabarcıkları sokmamaya dikkat edin.
  13. Cihazı% 5 CO2 ve 37 ° C'de 4 saat boyunca inkübatöre koyun.
  14. 4 saatlik inkübasyondan sonra, taze hücre kültürü ortamı ile doldurulmuş başka bir şırınga hazırlayın. Şırıngayı bir şırınga pompasına monte edin, şırıngayı giriş portuna bağlayın ve kelepçeyi bir çıkış portundan çıkarın.
  15. Yüzen/bağlanmamış hücreleri yıkamak için taze medyayı cihazdan 4-8 μL/dk'da yaklaşık 5 dakika boyunca çalıştırın.

3. 48 saat boyunca akış altında hücre kültürü

  1. Taze hücre kültürü ortamı ile doldurulmuş bir şırınga hazırlayın. Şırıngayı bir şırınga pompasına monte edin, şırıngayı bir giriş portuna bağlayın ve bir çıkışı açık tutun. Cihazı inkübatöre koyun (% 5 CO2, 37 ° C).
  2. Şırınga pompasını, Tablo 1'de belirtilen aşağıdaki talimatları kullanarak akış altındaki endotel hücrelerini kültürlemek için programlayın.
  3. Akış altında 48 saatlik kültürden sonra bMFA'yı mikroskop altında kontrol edin. HLMVEC tam lümen oluşturan vasküler kanalları kapsamalıdır (Şekil 6).
    NOT: Farklı hücre tipleri için başka akış rejimleri gerekebilir.

4. Sitokin ve/veya terapötik tedavi

NOT: Örnek olarak, bu bölümde, hücrelerin Tümör Nekroz Faktörü-alfa (TNF-α) ve yeni bir anti-enflamatuar inhibitör (Protein Kinaz C delta-TAT peptid inhibitörü, PKCδ-i) 18,27,32,33,34,35,36 ile tedavi edilmesinin etkisini incelemek için bMFA'nın kullanılması açıklanmaktadır.

  1. Yukarıdaki protokolü kullanarak üç farklı bMFA cihazı hazırlayın (bölüm 1-3).
  2. Hücre kültürü ortamı, (TNF-α) (10 ng / mL), TNF-α (10 ng / mL) + PKCδ-i (5 μM) ile üç adet 1 mL şırınga yükleyin.
    NOT: Sitokinler hücre kültürü ortamında yeniden oluşturulur.
  3. Üç şırıngayı üç bMFA cihazına bağlayın. HLMVEC'i tampon TNF-α veya TNF-α + inhibitörü ile 0.1 μL / dak'da 4 saat boyunca tedavi edin.
    NOT: Özel çalışma gereksinimlerine dayanarak, endotel hücrelerini tedavi etmek için diğer sitokinler veya sitokin kokteylleri (örneğin, TNF-α + Interlökin 1 beta (IL1-β) + İnterferon-gama (IFN-γ)) kullanılabilir.

5. İnsan nötrofil izolasyonu

  1. Tüm reaktifleri oda sıcaklığında (RT) kullanın. Reaktifler arasında lökosit izolasyon ortamı, Ca 2+/Mg2+ ile 1x HEPES tamponu (Tablo 2), normal salinde %6 Dextran (%0.9 NaCl), %3.6 NaCl çözeltisi ve deiyonize su (DI) suyu bulunur.
  2. Pipet, 20 mL lökosit izolasyon ortamını 50 mL'lik bir konik tüpe dönüştürür ve lökosit izolasyon ortamı üzerine dikkatlice 25 mL kan tabakası oluşturur. RT'de 427 x g'de 40 dakika santrifüj .
    NOT: Kan ve lökosit izolasyon ortamının karışmasını önlemek için bu adımı yavaş ve dikkatli bir şekilde uygulayın.
  3. Kırmızı kan hücreleri (RBC) tabakasının ~ 5 mL'ye kadar aspire edin. RBC'nin üstündeki beyaz kabarık tabaka ağırlıklı olarak nötrofillerdir.
  4. Geçerli birimi iki katına çıkarmak için HEPES arabelleği ekleyin (varolan birim: HEPES arabelleği = 1:1).
  5. Son hacmin% 20'si olacak olan% 6'lık bir Dextran miktarı ekleyin. (mevcut hacim/4 = %6 Dextran eklenmiş hacim).
  6. İyice karıştırmak için tüpü birkaç kez hafifçe ters çevirin ve RBC tortusunu (~ 25 dakika) bırakın.
  7. Üst tabakayı (nötrofil bakımından zengin tabaka) dikkatlice pipetleyin ve yeni bir 50 mL tüpe aktarın, tortul RBC ile kirlenmemeye dikkat edin.
  8. RT'de 315 x g'de 10 dakika santrifüj. Süpernatantı çıkarın ve peleti 8 mL HEPES tamponunda yeniden askıya alın.
  9. Artık RBC'yi lize etmek için, 24 mL DI suyu ekleyin ve 50 saniye boyunca hafifçe karıştırın. Hemen, 8 mL% 3.6 NaCl çözeltisi ekleyin, RT'de 315 x g'de 10 dakika boyunca karıştırın ve santrifüj yapın.
  10. Süpernatanı çıkarın, hücre peletini 15 mL HEPES tamponu ile yıkayın ve 315 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.

6. bMFA ile nötrofil yapışması ve migrasyon deneyi

  1. İzole edilmiş insan nötrofillerini (15 milyon) 999 μL HEPES tamponunda yeniden askıya alın.
  2. 10 μM CFDA-SE çalışma konsantrasyonu elde etmek için nötrofil süspansiyonuna 1 μL CFDA-SE (karboksifloresein diasetat süksinimidil ester) boya stok çözeltisi (10 mM) ekleyin ve RT'de 10 dakika boyunca inkübe edin. hücreleri 315 x g'de 5 dakika santrifüj ederek HEPES tamponu ile iki kez yıkayın.
  3. Bir hemositometre kullanarak nötrofilleri sayın ve sırasıyla hücre kültürü ortamı, TNF-α (10 ng / mL) ve TNF-α (10 ng / mL) + PKCδ-i (5 μM) ile 2 milyon nötrofil / mL'de yeniden askıya alın; Deneyin başlamasından önce RT'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
  4. Hücre kültürü ortamında, çalışma için kemoattractant olan 1 μM N-formil-met-leu-phe (fMLP) ile doldurulmuş bir şırınga hazırlayın. bMFA'yı alın ve bir giriş bağlantı noktası ve bir çıkış bağlantı noktası açın.
    NOT: Bu deneysel koşullar, yüksek düzeyde dolaşımdaki sitokin / kemokinlere sahip sistemik bir enflamatuar yanıt içeren sepsis koşullarını taklit etmek için kullanılır. Ayrıca, Gram-negatif bakteri kaynaklı bir peptit olan fMLP, akciğerdeki bakterilerin varlığını (yani doku bölmesi) modellemek için kullanılır.
  5. Doku bölmesi port borusunu çıkarın ve fMLP borusunu takın. Sadece hücre kültürü ortamı ile tedavi edilenler hariç, tüm bMFA'lar için doku bölmesine ~ 20 μL fMLP enjekte edin. Sonra boruyu kesin ve kelepçeleyin.
  6. Şırıngayı ~ 200 μL nötrofil süspansiyonu ile doldurun ve şırıngayı şırınga pompasına monte edin.
  7. Cihazı ters çevrilmiş mikroskop aşamasına yerleştirin (Malzeme Tablosu).
  8. Pompayı 1 μL/dak debisinde çalıştırın ve nötrofil süspansiyonunun küçük bir damlası borudan çıkana kadar bekleyin. Boruyu giriş portuna yerleştirin. Kurulum için Şekil 7'ye bakın.

7. Görüntüleri elde edin

  1. Deneye başladıktan 10 dakika sonra bMFA'da (Şekil 8) yapışma haritasını elde etmek için mikroskop görüntü analiz yazılımındaki (Malzeme Tablosu) Büyük Görüntüyü Tara işlevini kullanın. Nötrofillerin çoğu ilk 10 dakika boyunca bMFA'ya girer.
    NOT: Fotobeyazlatmayı azaltmak için görüntü çekmezken floresan ışığını kapalı tutun.
  2. Sonraki bir saat boyunca, göç haritasını elde etmek üzere migrasyon analizi için doku bölmesinin zaman atlamalı görüntülerini (her 5 dakikada bir 1 görüntü) alın (Şekil 8B, C).

8. Dijital Görüntü analizi

  1. Yapışma haritası için, her bir kaptaki yapışmış nötrofillerin sayısını sayın. Her çatallanma için, damar çapının iki katına eşit bir çapa sahip dairesel bir ilgi alanı (ROI) oluşturun ve yapışmış nötrofillerin sayısını sayın.
  2. Her bir kap ve çatallanma bölgesindeki yapışan nötrofillerin sayısını ölçmek için manuel sayım veya otomatik Nesne Sayımı işlevini kullanın.
  3. Her gemideki kesme hızını belirlemek için CFD simülasyonu17 kullanılarak oluşturulan ağın kesme hızı haritasını kullanın. Ardından, Şekil 9A'da gösterildiği gibi bMFA'da bir kesme hızı haritası oluşturmak için belirli bir kaptaki yapışmış nötrofillerin sayısını o kaptaki kesme hızına göre çizin.
  4. Nötrofiller, endotelden doku bölmesine geçtikleri takdirde göç etmiş sayılırlar. Göç edilen nötrofil sayısını 10 dakika, 15 dakika, 30 dakika ve 60 dakika olarak sayın. Göç edilen nötrofillerin sayısını zamana karşı Şekil 9B'de gösterildiği gibi çizin.

Sonuçlar

bMFA'da kesme akımı altında 48 saatlik kültürden sonra, endotel hücreleri bMFA'daki vasküler kanalların yüzeyini kapladı ve akış yönünde hizalandı (Şekil 6). Konfokal mikroskopi, vasküler kanalların tüm yüzeylerinin endotel hücreleri tarafından kaplandığını ve bMFA18'de tam bir 3D lümen oluşturduğunu gösterdi.

Bu protokol kullanılarak, bMFA'da nötrofillerin endotel hücresine önemli ölçüde yapıştığın...

Tartışmalar

bMFA, in vivo mikrovasküler ağların topografyasını ve akış koşullarını yeniden üretir ve fizyolojik olarak gerçekçi koşullar altında lökosit-endotelyal hücre etkileşimini ve endotel fonksiyonunu in vitro olarak incelemek için kullanılabilir. Fare veya insanın mikrovaskülatüründe, mikrovasküler ağların geometrisi kendine benzer ve fraktaldır ve Reynolds sayısı 1'<<, vasküler geometrinin akış modellerini önemli ölçüde etkilemediğini gösterir. Bu nedenle, bFMA, insanl...

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, Hibe Numarası: GM114359 ve GM134701 (M.F.K. ve L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.) ve Savunma Tehdidi Azaltma Ajansı, Hibe Numarası: HDTRA11910012 (M.F.K. ve L.E.K.) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringeFisher Scientific14-823-30
Biomimetic microfluidic assay (bMFA)SynVivoSMN1-C001Exclusive at SynVivo
Blunt needleJensen GlobalJG24-0.5
Calcium ChlorideFisher ScientificC70-500
CFDA, SEThermoFisherC1157
Dextran, 250,000, PowderSpectrum Chemical Mfg. CorpDE-130
Ficoll-Paque PremiumGE Health Care17-5442-02Leukocyte isolation media
fMLPSigma-AldrichF3506
HepesFisher ScientificAAJ1692630
Human fibronectinFisher Scientific33-016-015use vendor recommended ECM for different cell lines
Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitLonzacc-3202Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC).
Human lung microvascular endothelial cellsLonzacc-2527use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS
Magnesium ChlorideFisher ScientificBP214-500
Nikon Eclipse Ti2Nikon Instruments Inc.Microscope
NIS-elements, 5.20.01Nikon Instruments Inc.Imaging software
PBSFisher ScientificMT21040CV
PhD Ultra Syringe PumpHarvard Apparatus70-3007Syringe Pump
Potassium HydroxideFisher Scientific02-003-763
Recombinant Human TNF-alphaR&D Systems210-TA
Slide clampSynVivo
Sodium ChlorideFisher ScientificS640-500
Synvivo Pneumatic PrimerSynVivo
Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS)Lonzacc-5034
Tygon tubingFisher Scientific50-206-8921Tubing

Referanslar

  1. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
  2. Yang, Q., Wijerathne, H., Langston, J. C., Kiani, M. F., Kilpatrick, L. E. Emerging approaches to understanding microvascular endothelial heterogeneity: A roadmap for developing anti-inflammatory therapeutics. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7770 (2021).
  3. Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H. Endothelial responses in sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202, 361-370 (2020).
  4. Ince, C., et al. The endothelium in sepsis. Shock. 45, 259-270 (2016).
  5. Ruparelia, N., Chai, J. T., Fisher, E. A., Choudhury, R. P. Inflammatory processes in cardiovascular disease: a route to targeted therapies. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 133-144 (2017).
  6. Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. Experimental approaches to evaluate leukocyte-endothelial cell interactions in sepsis and inflammation. Shock. 53, 585-595 (2020).
  7. Langer, H. F., Chavakis, T. Leukocyte-endothelial interactions in inflammation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (7), 1211-1220 (2009).
  8. Sadik, C. D., Luster, A. D. Lipid-cytokine-chemokine cascades orchestrate leukocyte recruitment in inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 91 (2), 207-215 (2012).
  9. Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature Medicine. 17, 1381-1390 (2011).
  10. Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Current Opinion in Critical Care. 14, 22-30 (2008).
  11. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).
  12. Molteni, R., Fabbri, M., Bender, J. R., Pardi, R. Pathophysiology of leukocyte-tissue interactions. Current Opinion in Cell Biology. 18, 491-498 (2006).
  13. Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
  14. Prabhakarpandian, B., Shen, M. -. C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
  15. Zou, X., et al. PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 289, 415-424 (2005).
  16. Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Analytical Chemistry (Journal). 86, 8344-8351 (2014).
  17. Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion. Biomedical Microdevices. 10 (4), 585-595 (2008).
  18. Soroush, F., et al. A novel microfluidic assay reveals a key role for protein kinase C delta in regulating human neutrophil-endothelium interaction. Journal of Leukocyte Biology. 100, 1027-1035 (2016).
  19. Roth, N. M., Kiani, M. F. A "geographic information systems" based technique for the study of microvascular networks. Annals of Biomedical Engineering. 27, 42-47 (1999).
  20. Prabhakarpandian, B., Wang, Y. I., Rea-Ramsey, A., Sundaram, S., Kiani, M. F., Pant, K. Bifurcations: Focal points of particle adhesion in microvascular networks. Microcirculation. 18, 380-389 (2011).
  21. Rosano, J., et al. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
  22. Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent. Microvascular Research. 80, 384-388 (2010).
  23. Yona, S., Hayhoe, R., Avraham-Davidi, I. Monocyte and neutrophil isolation and migration assays. Current Protocols in Immunology. 88 (1), 11-14 (2010).
  24. Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Experimental Cell Research. 307 (2), 418-426 (2005).
  25. Chen, H. -. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , (2005).
  26. Deosarkar, S. P., Prabhakarpandian, B., Wang, B., Sheffield, J. B., Krynska, B., Kiani, M. F. A novel dynamic neonatal blood-brain barrier on a chip. PloS one. 10, 142725 (2015).
  27. Soroush, F., et al. Neutrophil-endothelial interactions of murine cells is not a good predictor of their interactions in human cells. The FASEB Journal. 34, 2691-2702 (2020).
  28. Soroush, F., et al. Protein Kinase C-Delta (PKCδ) tyrosine phosphorylation is a critical regulator of neutrophil-endothelial cell interaction in inflammation. Shock. 51 (5), 538-547 (2019).
  29. Soroush, F., Tang, Y., Zaidi, H. M., Sheffield, J. B., Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. PKCδ inhibition as a novel medical countermeasure for radiation-induced vascular damage. The FASEB Journal. 32, 6436-6444 (2018).
  30. Pradhan, S., et al. A microvascularized tumor-mimetic platform for assessing anti-cancer drug efficacy. Scientific Reports. 8 (1), 3171 (2018).
  31. Tang, Y., et al. A biomimetic microfluidic tumor microenvironment platform mimicking the EPR effect for rapid screening of drug delivery systems. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
  32. Tang, Y., et al. Protein kinase C-delta inhibition protects blood-brain barrier from sepsis-induced vascular damage. Journal of Neuroinflammation. 15, 309 (2018).
  33. Mondrinos, M. J., et al. Pulmonary endothelial protein kinase C-delta (PKCd) regulates neutrophil migration in acute lung inflammation. The American Journal of Pathology. 184, 200-213 (2014).
  34. Kilpatrick, L. E., et al. Protection against sepsis-induced lung injury by selective inhibition of protein kinase C-d (d-PKC). Journal of Leukocyte Biology. 89, 3-10 (2011).
  35. Mondrinos, M. J., et al. Biodistribution and efficacy of targeted pulmonary delivery of a protein kinase C-d inhibitory peptide: Impact on Indirect lung Injury. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355, 86-98 (2015).
  36. Liverani, E., Mondrinos, M. J., Sun, S., Kunapuli, S. P., Kilpatrick, L. E. Role of protein kinase C-delta in regulating platelet activation and platelet-leukocyte interaction during sepsis. PloS one. 13, 0195379 (2018).
  37. Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of shear adhesion map using SynVivo synthetic microvascular networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51025 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 178mikrofizyolojik sisteml kosit endotel h cre etkile imiinflamasyonadezyonmigrasyonbiyomimetik mikroak kanlar testi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır