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要約

このプロトコルでは、生理学的に関連する微小血管環境を再現し、白血球接着/遊走カスケード全体を再現することができる生体模倣マイクロ流体アッセイが、炎症性疾患における白血球 - 内皮細胞相互作用を研究するために採用される。

要約

白血球-内皮細胞相互作用は、敗血症などの炎症性疾患において重要な役割を果たす。炎症の間、血管内皮を横切って重要な器官への活性化白血球の過剰な移動は、器官不全につながる可能性がある。生理学的に関連する生体模倣マイクロ流体アッセイ(bMFA)が開発され、いくつかの実験的および計算的技術を使用して検証されており、白血球のローリング/接着/遊走カスケード全体を再現して白血球-内皮細胞相互作用を研究することができます。げっ歯類 のin vivo 画像から得られた微小血管網を地理情報システム(GIS)アプローチを用いてデジタル化し、顕微鏡スライド上でポリジメチルシロキサン(PDMS)を用いて微細加工した。白血球-内皮細胞相互作用に対する剪断速度および血管トポロジーの影響を研究するために、計算流体力学(CFD)モデルが開発され、ネットワーク全体の剪断速度および速度の対応するマップが生成された。bMFAは、転動速度、異なる剪断速度に応答した接着白血球の数、遊走白血球の数、内皮細胞透過性、接着分子発現および他の重要な変数を含む白血球 - 内皮細胞相互作用の定量化を可能にする。さらに、ヒトリンパ管内皮細胞や白血球などのヒト関連サンプルを使用することにより、bMFAは、臨床翻訳可能性を高めるための潜在的な治療法の迅速なスクリーニングのためのツールを提供します。

概要

炎症は、感染および傷害に対する宿主応答であり、内皮は炎症反応において重要な役割を果たす1、2、3。炎症性調節不全は、敗血症、心血管疾患、喘息、炎症性腸疾患、癌およびCOVID-19などの多くの疾患病状の根底にある原因である。白血球 - 内皮細胞相互作用は、これらの炎症性疾患において中心的な役割を果たす。炎症中、病原体からのPAMPS(病原体関連分子パターン)または損傷組織からのDAMPS(損傷関連分子パターン)の放出は、免疫細胞を活性化してサイトカイン/ケモカインおよび内皮の活性化につながる他の炎症誘発メディエーターを放出し、血管内皮バリア機能の変化および透過性の増加をもたらす3,4.炎症中の内皮細胞の活性化の増加は、白血球−内皮細胞相互作用の増強をもたらし、血管内皮を横切って重要な器官への活性化白血球の過剰な遊走をもたらす1、5、6、7。

白血球の動員は、生理活性脂質、サイトカイン、ケモカインおよび補体成分8、9からなる化学的に多様な化学誘引物質によって開始される。白血球の募集は、1)白血球のマージニングと捕捉/付着、2)ローリング、3)確固たる逮捕、4)拡散と這い回り、5)溢血/移動(図1)の5つの個別のステップを含む多段階のプロセスです。このプロセスの各ステップは、この動的現象を調整するために白血球と内皮細胞との間のクロストークを必要とする1,9。最終的に、停止した白血球は、同時化学誘引依存性シグナル、接着事象および血行動態剪断力によって制御される多段階プロセスを介して、内皮を横切って炎症組織に溢出する1、9、10、11、12。

内皮細胞機能の調節における剪断応力の中心的な役割と白血球-内皮細胞相互作用の重要性13を考えると、より制御された環境における白血球遊走カスケードの様々な側面を研究するために、過去数十年間にいくつかの in vitro モデルが開発されてきた14。白血球 - 内皮細胞相互作用を研究するための従来の流体デバイスは、2つの広いカテゴリーに分類することができる:a)白血球圧延、接着および平行平板流チャンバなどの接着分子発現を研究するためのデバイス、およびb)トランスウェルチャンバなどの静的条件下での白血球遊走を研究するためのデバイス。平行平板フローチャンバのようなシステムは、剪断力15の下での接着カスケードにおける接着分子およびその配位子の役割を研究するために使用されてきた。しかしながら、重大な欠点は、これらの単純化された理想化された装置(例えば、直線チャネル)が、 インビボ 微小血管系のスケールおよび幾何学的形状(例えば、連続する血管分岐、血管形態)および結果として生じる流れ条件(例えば、分岐部における収束または発散流)を再現することができないことである。その結果、これらのデバイスは接着のみをモデル化でき、トランスマイグレーションはモデル化できません。トランスウェルチャンバーは、 in vivo の幾何学的特徴および流れ条件を考慮することなく、静的条件下でのみトランスマイグレーションを研究することができる。したがって、これらの従来のモデルは、生体組織の微小環境を模倣したり、単一のアッセイで接着および遊走カスケードを解決したりしない6。

この制限に対処するために、我々は、チップ上の生体内微小血管ネットワークを現実的に再現する新規な3D生体模倣マイクロ流体アッセイ(bMFA)(図2)を開発し、広範囲に検証した16、17、18。このデバイスの微細加工のためのプロトコルは、以前に17で公開されており、ここでは簡単に説明されています。マウスクレマスター筋の微小血管系を、修正地理情報システム(GIS)アプローチ19を用いてデジタル化した。次いで、合成微小血管網を、デジタル化された微小血管網14、17、20、21、22に基づくソフトリソグラフィープロセスを用いて、ポリジメチルシロキサン(PDMS)上に生成した。簡単に言えば、デジタル化されたネットワーク画像をマイラーフィルムに印刷し、それをマスクとして使用して、シリコンウェーハの上にSU-8ポジ型フォトレジストをパターニングし、製造用のマスターを作成しました。微細加工されたピラー(直径10μm、高さ3μm)を用いて、高さ3μm、幅100μmの細孔を作成し、白血球遊走に最適なサイズ23、24、25、血管チャネルと組織区画を接続した。PDMSはメーカーの指示に従って調製され、開発されたマスターに注がれました。さらに、PDMSを脱気し、オーブン(65°C)中で一晩硬化させて、PDMS中に相補的なマイクロチャネルを作成した。続いて、硬化したPDMSをSU-8マスターから剥離し、続いて入口/出口用のパンチングポートを取り付けた。次いで、PMDSをスライドガラスにプラズマ接合した。マイクロ流体装置の表面は、天然ガラスおよびPDMSを含む。細胞の付着、拡散および増殖を促進するためには、細胞外マトリックス(ECM)コーティングが必要である。bMFAには、微小血管網と、高さ3μm、幅100μmの細孔を介して接続された組織区画が含まれています(図2)。このマイクロ流体システムは、循環、縁取り、転がり、接着および単一系における血管外組織区画への白血球の移動を含む、相互接続された血管および分岐を有する完全な微小血管網の生理学的に関連する3D環境における白血球接着/遊走カスケード全体を再現する14,16,17,21,26。

なお、bMFAの入口の流量が固定されていても、ネットワーク内の流動条件は場所によって異なり、単純な数式では計算できない。計算流体力学(CFD)ベースのモデルが開発され、ネットワーク内のさまざまな場所でさまざまな流れパラメータ(せん断応力、せん断速度、速度など)が計算されました。このCFDモデルは、bMFAの色素灌流パターンと流れパラメータをシミュレートするために使用されました。実験結果との交差検証により、ネットワーク全体の流れ抵抗は計算モデルによって十分に予測されることが示唆されました(図3)17。次に、このCFDモデルを使用して、bMFAのすべての容器における速度およびせん断速度プロファイルを推定し(図4)、白血球の圧延、接着および移動に対するせん断流および幾何学的形状の影響の分析を可能にした16。白血球は、分岐点の近くおよび生体内の低剪断領域において優先的に接着し、白血球接着のこれらの空間パターンは、好中球を用いたbMFAにおいて首尾よく実証された(図5)16。本稿では、ヒト肺微小血管内皮細胞(HLMVEC)およびヒト好中球を用いて炎症条件下で白血球-内皮細胞相互作用を研究するためのbMFAを調製するためのプロトコールについて記載する。bMFAなどの微生理学的システムは、好中球、単球、リンパ球および腫瘍細胞などの異なるタイプの細胞との内皮細胞相互作用を研究するために使用することができる18、27、28、29、30。bMFAを、異なる器官(例えば、肺対脳)および異なる種(例えば、ヒト対マウス内皮細胞)、ならびに内皮細胞株21、27、31、32からの初代内皮細胞で播種することができる。bMFAは、複数の細胞応答、細胞間相互作用、バリア機能、薬物送達および薬物毒性を研究するために使用することができる。

プロトコル

ヘパリン処理されたヒト血液は、テンプル大学(ペンシルベニア州フィラデルフィア、米国)の治験審査委員会によって承認されたインフォームドコンセントに従って、健康な成人ドナー(21〜60歳の男性および女性)からの好中球単離のために得られる。

1.ヒトフィブロネクチンでデバイスをプライミングおよびコーティングする

メモ:bMFAには、血管コンパートメントに接続された2つの入口ポートと2つの出口ポートがあります。また、組織コンパートメントに接続された1つのポートもあります(図2)。

  1. チューブ(外径0.06インチ、内径0.02インチ)(材料表)を、細かい点鉗子を備えた1つの入口ポートを除くすべてのポートに挿入します。2つの出口ポートとティッシュコンパートメントポートをジョークランプでクランプします。各チューブの長さが約 1 インチであることを確認します。
  2. ヒトフィブロネクチンをフィブロネクチンストック溶液(1mg/mL)由来のPBSで100μg/mLに希釈する。調製したフィブロネクチン溶液で1mLシリンジを装填する。シリンジを24Gの鈍い針と約4インチの長さのチューブに接続します。
    注:架橋を防ぐために、ヒトフィブロネクチンを過剰に混合/ピペットしないでください。コラーゲンなどの他の細胞外マトリックス(ECM)は、異なる細胞型に対して使用され得る。
  3. チューブを開いている入口ポートに挿入し、ヒトフィブロネクチンが他の入口ポートから出てくるまでプランジャーを押してから、クランプします。すべてのチャネル、組織コンパートメントおよびチューブがヒトフィブロネクチン溶液で満たされるまで、残りのポートについてこのプロセスを繰り返す。針を取り外しますが、長さ4インチのチューブを挿入してクランプを外したままにしておきます。
    メモ:クランプする前に、チューブがフィブロネクチンで満たされていることを確認してください。
  4. 脱気のために、クランプされていないチューブを空気圧プライマーを介して圧縮窒素タンクに接続し、圧力を〜5psiに調整し、〜15分間実行します。
  5. 15分後、顕微鏡下で確認し、デバイスに気泡が閉じ込められていないことを確認します。流路または組織コンパートメントに気泡が閉じ込められている場合は、装置を空気圧プライマーに再接続して再び脱気する、すなわちステップ1.4を繰り返します。
    注:倒立顕微鏡は、このプロトコルの顕微鏡検査を含むすべてのステップで使用されます。
  6. 空気圧プライマーからデバイスを取り外します。デバイスを37°Cで1時間インキュベートし、次いで、ステップ1.3と同様に、予め加温したHLMVEC培養培地(材料表)ですべてのチャネルおよび組織区画をフラッシュする。これで、bMFA は細胞播種の準備が整いました。
    メモ:チューブをポートから取り外したり挿入したりする前に、まず入口ポートチューブのベースの周りにピペットで水滴を入れて、空気がデバイスに入らないようにします。

2. HLMVECによるbMFAのシーディング

  1. HLMVECをT−25フラスコ中でベンダーのプロトコールに従って60%〜80%コンフルエンシーに培養する。
  2. HLMVEC培養培地を細胞培養フラスコから吸引する。PBSで2回洗う。
  3. 2mLの予め加温したトリプシン-EDTA溶液(37°C)をT-25フラスコに加える。ほとんどの細胞がフラスコから剥離するまで、インキュベーター(37°C、5%CO2)中で3〜5分間インキュベートする。
    注:インキュベーション時間は、細胞タイプおよびトリプシン-EDTA濃度によって異なる場合があります。
  4. 2mLのトリプシン中和溶液(TNS、37°C)をフラスコに加え、トリプシン-EDTAを中和した。
  5. フラスコを静かにタップすると、細胞が解離します。次いで、細胞懸濁液を15mL円錐管に移す。
  6. 150 x g で5分間遠心分離し、内皮細胞をペレット化する。上清を除去し、細胞を3mLの細胞培養培地に再懸濁する。血球計数器で細胞数をカウントする。
  7. 細胞をペレット化するために、150 x g で再び5分間遠心分離する。上清を除去し、細胞を20 x 106/mLの所望の播種密度に再懸濁する。
    注:細胞タイプおよびコンフルエンシーに応じて、2つのT-25フラスコから約2 x 106の内皮細胞を採取することができ、20 x 106 / mLの播種密度で、100μLの細胞懸濁液(2 x106内皮細胞)を5つの装置に播種するのに十分である。
  8. プログラム可能なシリンジポンプに1mLシリンジを取り付け、チューブを鈍い針に取り付けます。
  9. 約20 μLの細胞懸濁液をチューブに引き込み、細胞懸濁液がシリンジバレルではなくチューブ内のみにあることを確認します。
  10. クランプをデバイスのコンセントポートから外します。チューブをデバイスの 1 つの入口に接続します。チャネルに気泡が導入されていないことを確認します。
  11. 4-8 μL/minの流量でポンプを起動します。顕微鏡下で装置を観察する。
  12. チャネルがセルで満たされたら、ポンプを停止し、出口をクランプし、入口チューブを切断します。
    メモ: デバイスに気泡を巻き込まないように注意してください。
  13. 装置をインキュベーターに入れ、5%CO2 および37°Cで4時間。
  14. 4時間インキュベーション後、新鮮な細胞培養培地で満たされた別のシリンジを準備する。シリンジをシリンジポンプに取り付け、シリンジを入口ポートに接続し、出口ポートからクランプを取り外します。
  15. 新鮮な培地をデバイスを通して4~8 μL/minで約5分間実行し、浮遊/未接続の細胞を洗い流します。

3. 48時間のフロー下での細胞培養

  1. 新鮮な細胞培養培地を充填したシリンジを準備する。シリンジをシリンジポンプに取り付け、シリンジを1つの入口ポートに接続し、出口を開いたままにします。デバイスをインキュベーター(5%CO2、37°C)に入れます。
  2. 内皮細胞をフロー下で培養するためのシリンジポンプを 、表1に記載した以下の説明書を用いてプログラムする。
  3. フロー下での培養の48時間後に顕微鏡下でbMFAを確認してください。HLMVECは、完全な内腔を形成する血管チャネルをカバーするべきである(図6)。
    注: 異なる細胞タイプには、他のフローレジームが必要な場合があります。

4. サイトカインおよび/または治療的治療

注:例として、このセクションでは、bMFAを使用して、腫瘍壊死因子アルファ(TNF−α)および新規抗炎症阻害剤(プロテインキナーゼCデルタ−TATペプチド阻害剤、PKCδ−i)18、27、32、33、34、35、36で細胞を治療することの影響を研究する。

  1. 上記のプロトコルを使用して、3つの異なるbMFAデバイスを準備します(セクション1-3)。
  2. 3 つの 1 mL シリンジに細胞培養培地 (TNF-α) (10 ng/mL)、TNF-α (10 ng/mL) + PKCδ-i (5 μM) をそれぞれロードします。
    注:サイトカインは細胞培養培地中で再構成される。
  3. 3 つのシリンジを 3 つの bMFA デバイスに接続します。HLMVECをバッファーTNF-αまたはTNF-α +阻害剤で0.1 μL/minで4時間治療する。
    注:特定の研究要件に基づいて、他のサイトカインまたはサイトカインカクテル(例えば、TNF−α+インターロイキン1β(IL1−β)+インターフェロン−γ(IFN−γ))を、内皮細胞を治療するために使用してもよい。

5. ヒト好中球単離

  1. すべての試薬を室温(RT)で使用してください。試薬には、白血球単離培地、Ca2+/Mg2+を含む1x HEPES緩衝液(表2)、通常の生理食塩水中の6%デキストラン(0.9%NaCl)、3.6%NaCl溶液および脱イオン水(DI)水が含まれる。
  2. 20 mLの白血球単離培地を50 mLの円錐管にピペットし、白血球単離培地の上に25 mLの血液を注意深く層状にした。RTで427 x g で40分間遠心分離します。
    メモ: 血液と白血球分離媒体が混ざらないように、この手順をゆっくりと慎重に実行してください。
  3. 赤血球(RBC)層の上から〜5mLまで吸引する。RBCの上にある白いバフィー層は、主に好中球である。
  4. HEPESバッファを追加して現在のボリュームを2倍にします(既存のボリューム:HEPESバッファ= 1:1)。
  5. 6%のデキストランの量を加えると、これは最終ボリュームの20%になります。(現在の体積/4 = 6%デキストラン添加量)。
  6. チューブを数回静かに反転させてよく混ぜ、RBC沈殿物(〜25分)を放置します。
  7. 上層(好中球リッチ層)を慎重にピペットで拭き取り、新しい50mLチューブに移し、沈降したRBCで汚染しないように注意してください。
  8. RTで315 x g で10分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを8 mLのHEPESバッファーに再懸濁します。
  9. 残留RBCを溶解するには、24mLのDI水を加え、50秒間穏やかに混合する。直ちに、8 mLの3.6%NaCl溶液を加え、RTで315 x g で10分間混合および遠心分離する。
  10. 上清を除去し、細胞ペレットを15 mLのHEPES緩衝液で洗浄し、315 x g で5分間遠心分離する。

6. bMFAによる好中球接着・移行実験

  1. 単離したヒト好中球(1,500万個)を999 μLのHEPESバッファーに再懸濁する。
  2. 好中球懸濁液に1 μL CFDA-SE(カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル)色素ストック溶液(10 mM)を加え、10 μM CFDA-SEの作業濃度を得、RTで10分間インキュベート する。
  3. 血球計数器を用いて好中球を計数し、細胞培養培地、TNF-α(10ng/mL)およびTNF-α(10ng/mL)+PKCδ-i(5μM)で200万個の好中球/mLで再懸濁する。実験開始前にRTで15分間インキュベートする。
  4. 研究用の化学誘引剤である1μM N-ホルミル-メット-ロイ-フェ(fMLP)を細胞培養培地に充填したシリンジを準備する。bMFAを取り、1つの入口ポートと1つの出口ポートを開きます。
    注:これらの実験条件は、高レベルの循環サイトカイン/ケモカインを伴う全身性炎症反応を含む敗血症の状態を模倣するために使用される。さらに、グラム陰性菌由来ペプチドであるfMLPは、肺(すなわち、組織区画)における細菌の存在をモデル化するために使用される。
  5. ティッシュコンパートメントポートチューブを取り外し、fMLPチューブを挿入します。細胞培養培地単独で処理したものを除くすべてのbMFAについて、約20μLのfMLPを組織区画に注入する。次に、チューブを切断してクランプします。
  6. シリンジに約200μLの好中球懸濁液を充填し、シリンジをシリンジポンプに取り付けます。
  7. 装置を倒立顕微鏡ステージ(材料表)に置きます。
  8. 流量が1 μL/minでポンプを起動し、好中球懸濁液がチューブから少量出てくるまで待ちます。チューブを入口ポートに挿入します。セットアップについては、 図 7 を参照してください。

7. 画像を取得する

  1. 顕微鏡画像解析ソフト(材料表)の「大画像スキャン」機能を使用して、実験開始から10分後にbMFA(図8)で接着マップを取得しました。好中球のほとんどは、最初の10分間にbMFAに入ります。
    注:写真を撮っていないときは、フォトブリーチングを減らすために蛍光灯を消灯させてください。
  2. 次の1時間の間に、遊走解析のために組織区画のタイムラプス画像(5分ごとに1画像)を撮影し(図8B、C)、遊走マップを得た。

8. デジタル画像解析

  1. 接着マップについて、各血管に付着した好中球の数をカウントする。分岐ごとに、血管直径の2倍に等しい直径を有する円形関心領域(ROI)を作成し、付着した好中球の数を数える。
  2. 手動カウントまたは自動 オブジェクトカウント 機能を使用して、各容器および分岐領域に付着している好中球の数を定量化します。
  3. CFDシミュレーション17 を用いて生成されたネットワークのせん断速度マップを使用して、各容器におけるせん断速度を決定する。次に、所与の容器内に付着した好中球の数をその容器内の剪断速度に対してプロットし、 図9Aに示すようにbMFAで剪断速度マップを作成する。
  4. 好中球は、内皮を通って組織区画に侵入した場合、遊走したものとしてカウントされる。10分、15分、30分および60分で移行された好中球の数を数える。 図9Bに示すように、時間に対する移行好中球の数をプロットする。

結果

bMFAの剪断流下での48時間の培養後、内皮細胞は血管チャネルの表面をbMFAで覆い、流れの方向に整列した(図6)。共焦点顕微鏡検査は、血管チャネルのすべての表面が内皮細胞によって覆われ、bMFA18において完全な3D内腔を形成することを示した。

このプロトコールを用いて、好中球接着マップを取得することができ、bMFAにおいて内?...

ディスカッション

bMFAは 、in vivo微小 血管ネットワークのトポグラフィーおよび流れ条件を再現し、生理学的に現実的な条件下での白血球 - 内皮細胞相互作用および内皮機能を in vitroで 研究するために使用することができる。マウスまたはヒトのいずれかの微小血管系において、微小血管網の幾何学的形状は自己類似性およびフラクタル的であり、レイノルズ数<<1であり、血管幾何学的形状が流?...

開示事項

著者らは利益相反がないと宣言しています。

謝辞

この研究は、米国国立衛生研究所(NIH)の助成金番号:GM114359およびGM134701(M.F.K.およびL.E.K.)、1F31AI164870-01(J..C.L.)、および国防脅威低減局(Grant Number:HDTRA11910012(M.F.K.およびL.E.K.)によって支援されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringeFisher Scientific14-823-30
Biomimetic microfluidic assay (bMFA)SynVivoSMN1-C001Exclusive at SynVivo
Blunt needleJensen GlobalJG24-0.5
Calcium ChlorideFisher ScientificC70-500
CFDA, SEThermoFisherC1157
Dextran, 250,000, PowderSpectrum Chemical Mfg. CorpDE-130
Ficoll-Paque PremiumGE Health Care17-5442-02Leukocyte isolation media
fMLPSigma-AldrichF3506
HepesFisher ScientificAAJ1692630
Human fibronectinFisher Scientific33-016-015use vendor recommended ECM for different cell lines
Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitLonzacc-3202Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC).
Human lung microvascular endothelial cellsLonzacc-2527use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS
Magnesium ChlorideFisher ScientificBP214-500
Nikon Eclipse Ti2Nikon Instruments Inc.Microscope
NIS-elements, 5.20.01Nikon Instruments Inc.Imaging software
PBSFisher ScientificMT21040CV
PhD Ultra Syringe PumpHarvard Apparatus70-3007Syringe Pump
Potassium HydroxideFisher Scientific02-003-763
Recombinant Human TNF-alphaR&D Systems210-TA
Slide clampSynVivo
Sodium ChlorideFisher ScientificS640-500
Synvivo Pneumatic PrimerSynVivo
Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS)Lonzacc-5034
Tygon tubingFisher Scientific50-206-8921Tubing

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