יישום של הפרעת RNA בנמטודת אורן, בורסהפלנצ'וס קסילופילוס

Summary

כאן, אנו מציגים שיטת השרייה מפורטת של הפרעת RNA ב Bursaphelenchus xylophilus כדי להקל על המחקר של תפקודי גנים.

Abstract

נמטודת עצי האורן, Bursaphelenchus xylophilus, היא אחד המינים הפולשים ההרסניים ביותר בעולם, וגורמת בסופו של דבר למותם של עצי אורן. למרות ההכרה בחשיבותם הכלכלית והסביבתית, עד כה לא ניתן היה לחקור את תפקודי הגנים המפורטים של נמטודות טפיליות צמחיות (PPNs) באמצעות גנטיקה קונבנציונלית קדימה ושיטות מהונדסות. עם זאת, כטכנולוגיה של גנטיקה הפוכה, הפרעות RNA (RNAi) מקלות על חקר הגנים הפונקציונליים של נמטודות, כולל B. xylophilus.

מאמר זה מתווה פרוטוקול חדש ל-RNAi של הגן ppm-1 ב-B . xylophilus, אשר דווח כי הוא ממלא תפקידים מכריעים בהתפתחות וברבייה של נמטודות פתוגניות אחרות. עבור RNAi, מקדם T7 היה מקושר למסוף 5′ של מקטע המטרה על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR), ורנ"א דו-גדילי (dsRNA) סונתז על ידי שעתוק במבחנה . לאחר מכן, אספקת dsRNA הושגה על ידי השריית הנמטודות בתמיסת dsRNA מעורבבת עם נוירוסטימולנטים סינתטיים. צעירים מסונכרנים של B. xylophilus (כ-20,000 פרטים) נשטפו והושרו ב-dsRNA (0.8 מיקרוגרם/מ"ל) במאגר ההשריה במשך 24 שעות בחושך בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.

אותה כמות של נמטודות הוכנסה למאגר ספוג ללא dsRNA כבקרה. בינתיים, כמות זהה נוספת של נמטודות הוכנסה למאגר ספוג עם הגן dsRNA של חלבון פלואורסצנטי ירוק (gfp) כבקרה. לאחר ההשרייה, רמת הביטוי של תמלילי היעד נקבעה באמצעות PCR כמותי בזמן אמת. ההשפעות של RNAi אושרו לאחר מכן באמצעות תצפית מיקרוסקופית של הפנוטיפים והשוואה של גודל הגוף של המבוגרים בין הקבוצות. הפרוטוקול הנוכחי יכול לסייע בקידום המחקר כדי להבין טוב יותר את תפקודם של הגנים של B. xylophilus ונמטודות טפיליות אחרות לקראת פיתוח אסטרטגיות בקרה באמצעות הנדסה גנטית.

Introduction

נמטודות טפיליות-צמחיות (PPNs) מהוות איום מתמשך על ביטחון המזון ועל המערכות האקולוגיות של היערות. הם גורמים להפסדים כלכליים של כ-100 מיליארד דולר בכל שנה¹, כאשר הבעייתיים שבהם הם בעיקר נמטודות שורשים, נמטודות ציסטות ונמטודות מעץ אורן. נמטודת עץ האורן, Bursaphelenchus xylophilus, היא נמטודה נודדת, אנדופרזיטית, שהיא הפתוגן הסיבתי של מחלת אורן נבול². הוא גרם נזק רב ליערות אורנים ברחבי העולם³. אם נשתמש בטרמינולוגיה של Van Megen et ^al.4, B. xylophilus הוא חבר ב-Parasitaphelenchidae ושייך לקלייד 10, בעוד שרוב טפילי הצמחים הגדולים האחרים שייכים לקלייד 12.

כטפיל צמחי עצמאי שהתפתח לאחרונה, ב. קסילופילוס הוא מודל אטרקטיבי למחקרים השוואתיים. עד כה, היה מחקר משמעותי על נמטודות קשר שורש ונמטודות ציסטות השייכות לקלייד 12, שהן אנדופרזיטים מחייבים, בישיבה והן חלק מהנמטודות הנחקרות ביותר. עם זאת, ביצוע מחקר נוסף בתחום חשוב זה טומן בחובו אתגר גדול: תפקודם של גנים של טפילות הוא צוואר בקבוק מחקרי. מחקרים פונקציונליים כוללים בדרך כלל ביטוי חוץ רחמי וניסויי נוק-דאון/אאוט, אך מסתמכים על פרוטוקולי טרנספורמציה גנטית יעילים עבור הנמטודה. כתוצאה מכך, גנטיקה הפוכה ב-PPNs מסתמכת כמעט אך ורק על השתקת גנים על ידי RNAi.

RNAi, מנגנון הקיים באופן נרחב בתאים אאוקריוטים, משתיק ביטוי גנים על ידי החדרת RNA דו-גדילי (dsRNA)⁵. עד כה, מנגנון השתקת הגנים שלאחר ההדבקה המושרה על ידי dsRNA נמצא בכל האאוקריוטים שנחקרו, וטכנולוגיית RNAi, ככלי למחקר גנומי פונקציונלי ויישומים אחרים, התפתחה במהירות באורגניזמים רבים. מאז גילוי מכונות ה- RNAi ב- Caenorhabditis elegans בשנת 1998⁶, טכניקות RNAi הפכו לשיטות יעילות לזיהוי תפקוד הגן של נמטודות ומוצעות כדרך חדשה לשלוט ביעילות בנמטודות פתוגניות⁷.

מבחינה טכנית, ה-RNAi סופג את הצעירים ב-dsRNA; עם זאת, היעילות והשכפול של גישה זו משתנות מאוד עם מיני הנמטודות ועם גן המטרה⁸. השתקה של 20 גנים המעורבים במסלולי ה-RNAi של נמטודת קשר השורש, Meloidogyne incognita, נחקרה באמצעות dsRNAs ארוכים כטריגרים, וכתוצאה מכך תגובות מגוונות, כולל עלייה וללא שינוי בביטוי של גנים מסוימים⁹. תוצאות אלה מראות כי גני מטרה עשויים להגיב להפלת RNAi באופן שונה, מה שמחייב הערכה ממצה של התאמתם כמטרות לבקרת נמטודות באמצעות RNAi. עם זאת, יש כיום מיעוט של מחקר על הביולוגיה ההתפתחותית והרבייה של ב 'קסילופילוס.

כהמשך לעבודה קודמת^10,11,12,13, אנו מתארים כאן פרוטוקול ליישום RNAi כדי לחקור את תפקוד הגן ppm-1 של B. xylophilus, כולל סינתזה של dsRNA^, השריית נוירוסטימולנטים סינתטיים וזיהוי תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR). הידע שיתקבל מגישה ניסיונית זו צפוי לתרום רבות להבנת מערכות ביולוגיות בסיסיות ולמניעת מחלת האורנים.

Protocol

המחקר אושר על ידי המועצה לניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת ג'ג'יאנג לחקלאות וייעור. B. xylophilus מבודד NXY61 הופק במקור מפינוס מסוניאנה חולה באזור נינגבו במחוז ג'ה-ג'יאנג, סין¹¹.

1. שיבוט גנים

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על הפריימרים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. לאסוף נמטודות.
   1. תרבית את זן B. xylophilus על התפטיר של Botrytis cinerea על צלחות דקסטרוז אגר תפוחי אדמה (PDA) ב 25 מעלות צלזיוס במשך 3-5 ימים.
   2. אסוף את הנמטודות בשיטת משפך בלמן¹⁴.
      1. מניחים צינור גומי מהודק מתחת למשפך ומניחים שתי שכבות של נייר סינון בפתח המשפך. העבירו את תרביות הפטריות למשפך והוסיפו מים לטבילת מחצלת הפטריות. המתן שעתיים, ולאחר מכן לאסוף את הנמטודות.
2. חלץ את סך הרנ"א מהנמטודות באמצעות מגיב מיצוי RNA כולל (ראה טבלת החומרים)¹¹ בהתאם לשלבים הבאים.
   1. הוסף 500 μL של מגיב מיצוי ו 100 μL של חרוזים מגנטיים לצינור צנטריפוגה 2 מ"ל. שאפו 20 μL של הנמטודות והעבירו את הדגימה למטחנה לטחינה ב 9,000 × גרם במשך 30 שניות. דגירה במשך 5 דקות ולאחר מכן צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 12,000 × גרם ו 4 מעלות צלזיוס.
   2. העבירו את הסופר-נאטנט לצינור צנטריפוגה חדש. מוסיפים 100 μL של כלורופורם, מכסים את הצינור ומערבבים על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. דגירה במשך 3 דקות ולאחר מכן צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 12,000 × גרם ב 4 מעלות צלזיוס.
   3. העבירו את הסופר-נאטנט לצינור צנטריפוגה חדש. מוסיפים 250 μL של אלכוהול איזופרופיל ומערבולת במרץ. צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות.
   4. השליכו את הסופר-נטנט. הוסף 500 μL של 75% אתנול כדי לשטוף את הרנ"א ולאחר מכן מערבל את הדגימה. צנטריפוגה זה במשך 5 דקות ב 12,000 × גרם ו 4 מעלות צלזיוס.
   5. יש לייבש באוויר את גלולת ה-RNA במשך 5 דקות.
   6. יש לתלות את הכדור ב-30 μL של מים נטולי RNase.
   7. חישוב ריכוז הרנ"א באמצעות הנוסחה: A260 דילול × × 40 = מיקרוגרם RNA/mL. חשב את היחס A260/A280.
      הערה: יחס של ~2 נחשב טהור.
3. בצע שעתוק הפוך של RNA באיכות טובה כדי לקבל את תבנית cDNA.
   1. תכנן והשתמש בזוג פריימרים ספציפיים, ppm-1-F/R (ראה טבלת החומרים), כדי להגביר את רצף הקידוד החלקי של הגן Bx-ppm-1 ב- B. xylophilus (מספר ההצטרפות של GenBank QTZ96795).
   2. שכפלו את רצפי הגנים ppm-1 לווקטור pGEM-Teasy המכיל את מקדם T7 בעקבות פרוטוקול שיבוט^{סטנדרטי 11}.
      1. הגדר את תגובות ה-PCR באופן הבא: 2 μL של cDNA, 25 μL של 2x Ex Taq Polymerase Premix, 2 μL של כל פריימר (10 pmol/l), ומים מזוקקים סטריליים לנפח סופי של 50 μL.
      2. בצע את הליך ההגברה כדלקמן: 5 דקות ב 94 מעלות צלזיוס; ואחריו 35 מחזורים של 30 שניות ב-94 מעלות צלזיוס, 30 שניות ב-55 מעלות צלזיוס, ודקה אחת ב-72 מעלות צלזיוס; ושלב הארכה סופי ב-72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
      3. שכפלו את המוצרים המוגברים לווקטור pGEM-T Easy לריצוף.

2. סינתזה של dsRNA

1. הכן את תבנית הדנ"א לסינתזת dsRNA באמצעות PCR עם פריימרים שנועדו להוסיף אתרי מקדם T7 בשני הקצוות. הוסף את רצף מקדם T7 לסוף 5' של הפריימרים.
2. השתמש בפלסמיד המכיל את מקטע הגן ppm-1 (894 bp) כתבנית עבור PCR ושחזר את השבר המכיל את מקדם T7¹¹. השתמש בהליך PCR ובמערכת שתוארו לעיל.
3. השתמש בערכת שעתוק במבחנה כדי לסנתז dsRNA¹¹.
   1. הפשירו את הריאגנטים הקפואים על הקרח.
   2. הוסף 2 μL של 10x מאגר תגובה, 2 μL של תערובת אנזימים, ו 1 מיקרוגרם של DNA לצינור צנטריפוגה. הוסיפו מים נטולי נוקלאז כדי לייצר תגובה סטנדרטית של 4 μL. לאחר מכן, ערבבו נפחים שווים של ארבעת תמיסות הריבונוקלאוטידים (ATP, CTP, GTP ו-UTP) יחד והוסיפו 8 μL של התערובת לצינור. מערבבים היטב ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
   3. הוסיפו 1 μL של DNase, ערבבו היטב ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
   4. עצרו את התגובה והוסיפו 30 μL של מים נטולי נוקלאז ו-30 μL של תמיסת משקעים LiCl כדי לזרז את ה-RNA. מערבבים היטב. דגירה ב-20°C- למשך הלילה.
   5. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 12,000 × גרם ו 4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופר-נטנט.
   6. הוסף 1 מ"ל של 75% אתנול כדי לשטוף את ה- RNA. מערבלים את הדגימה וצנטריפוגה במשך 10 דקות ב 12,000 × גרם ו 4 מעלות צלזיוס.
   7. יש לייבש באוויר את גלולת ה-RNA למשך 3 דקות.
   8. יש לתלות את הכדור ב-30 μL של מים נטולי RNase.
   9. נתח את איכות ה- dsRNA באמצעות ספקטרופוטומטר. Pipette 1 μL של דגימת dsRNA על מעמד המדידה ולהגדיר את אורך הגל ל 340 ננומטר. דמיינו את המוצרים על ג'ל אגרוז 1.0%.

3. RNAi על ידי השרייה

1. יש לערבב 4 μL של מאגר השרייה 5x (0.05% ג'לטין, 5.5 mM KH 2 PO 4, 2.1 mM NaCl, 4.7 mM NH₄ Cl, 3 mM זרעונידין) עם dsRNA ו-ddH₂O כדי לייצר נפח כולל של 20 μLוריכוז RNA סופי של 0.8 מיקרוגרם למ"ל.
2. לרכוש זחלי J2.
   1. אוספים את הנמטודות מתרביות הפטריות ומעבירים אותן לצלחת פטרי זכוכית בקוטר 6 ס"מ. הוסיפו 10 מ"ל מים למנה כדי להבטיח שהנמטודות יוכלו לשחות בחופשיות. שומרים את הנמטודות בצלחת במשך 30 דקות ומחכים שהביצים יידבקו לתחתית.
   2. הסר את המים והנמטודות בזהירות, תוך הקפדה לא להפריע לביצים. חזור על השלבים עד שכל הזחלים והבוגרים יוסרו, וישאירו רק את הביצים בצלחת.
   3. בקעו את הביצים שנאספו במשך 24 שעות בחושך בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס כדי להשיג זחלי J2. אספו את זחלי J2, הניחו אותם בצינור ושטפו אותם שלוש פעמים עם ddH₂O לניסוי RNAi¹⁵.
   4. מעבירים את זחלי J2 לצינור 2 מ"ל המכיל את תמיסת ה-dsRNA ומוסיפים תמיסת רסורצינול (עטופה בפח ומומסת במים) כדי לייצר ריכוז סופי של 1.0%. דגרו את הזחלים עם צנטריפוגה ב-15 × גרם על שולחן רועד במשך 24 שעות ב-25 מעלות צלזיוס כדי להבטיח שהזחלים יספגו ביעילות את ה-dsRNA.
   5. השרו את אותה כמות של נמטודות במאגר ההשריה ללא בדיקת dsRNA או עם בדיקת GFP dsRNA כבקרה. השתמש בגן GFP (gfp, M62653.1) כבקרה לא אנדוגנית וסנתז את ה- dsRNA של gfp באמצעות פריימרים ספציפיים לגן T7-GFP-F/R.

4. זיהוי qPCR

1. נקו את זחלי J2 עם ddH₂O, כולל אלה עם הפרעה לגני המטרה, הפרעות גנטיות GFP וקבוצת הביקורת ללא הפרעה. חלץ את סך הרנ"א מכל קבוצה בשיטה שתוארה לעיל.
2. הפעל את ה- qPCR.
   1. תכנן את פריימרים q-ppm-1-F/R באמצעות התוכנה הרצויה (ראה טבלת חומרים).
   2. הגדר את תגובת qPCR ב-12 μL המכילה 1 μL של cDNA, 6 μL של פרמיקס פלואורסצנטי, 0.4 μL של כל פריימר (10 pmol/l), ומים מזוקקים סטריליים.
   3. בצע qPCR באופן הבא: 2 דקות ב 95 °C; ואחריו 40 מחזורים של 10 שניות ב-95 מעלות צלזיוס, 30 שניות ב-55 מעלות צלזיוס ודקה אחת ב-72 מעלות צלזיוס.
   4. השתמש בגן actb (מספר ההצטרפות של GenBank EU100952) ובגן tbb-2 (מספר ההצטרפות של GenBank MT769316), או בגנים אחרים, כגני ייחוס פנימיים כדי להעריך את השינויים ברמת ביטוי הגנים לאחר RNAi¹⁵.
3. על פי ערך סף המחזור (Ct) ועקומת הפירוק, השתמש בשיטת ^2-ΔΔCt כדי להעריך את רמת הביטוי היחסית של גן המטרה ולאמת את יעילות ההפרעה.
   1. הפחת את ערך ה- Ct של גן הייחוס הפנימי של כל דגימה מערך ה- Ct של גן המטרה כדי לקבל את ערך ה- ΔCt. לאחר מכן, הפחת את ערך ΔCt של קבוצת ההפרעות מערך ΔCt של קבוצת הביקורת כדי לקבל את הערך ΔΔCt.
      הערה: ערך ΔΔCt הגדול מ- 0 מציין שההפרעה יעילה.

5. להעריך את אורך הגוף של מבוגרים נמטודה בעקבות RNAi

1. לאחר RNAi, תרבו את זחלי J2 עד לבגרותם על מדשאות B. cinerea בצלחות PDA במשך 60 שעות ב 25 מעלות צלזיוס¹⁵.
2. אסוף את המבוגרים בשיטת משפך בלמן (ראה שלב 1.1.2.1)¹⁴.
3. רכשו תמונות של הנמטודות הבוגרות תחת מיקרוסקופ והשתמשו בתוכנת ImageJ (או תוכנת מדידה אחרת) כדי למדוד את אורכי הגוף.
   1. מדוד את האורך באמצעות ImageJ על-ידי בחירה באפשרות נתח | הגדר קנה מידה. אם המרחק ידוע, הזן את ערך האורך של הקו הישר המצויר. הזן את יחידת האורך.
   2. סמן את תיבת הסימון כללי (השתמש בתקן זה עבור כל התמונות) ולחץ על אישור כדי לבחור את האורך שיש למדוד באמצעות קו ישר בתמונה שיש למדוד.
   3. השתמש בפקודה Ctrl+M (מדידה) כדי להציג את התוצאות ולהקליט אותן בחלון התוצאות .
4. קח מדידות של 50 נמטודות זכריות ו -50 נקבות לניתוח סטטיסטי¹².
5. נתח את הנתונים על-ידי חישוב הממוצע וסטיית התקן עבור כל מדגם. השווה את האמצעים של הדגימות מהקבוצות השונות באמצעות מבחן t של סטודנט.

תוצאות

ניתוח של ביטוי ppm-1 של B. xylophilus לאחר RNAi
רמת הביטוי היחסית של הגן ppm-1 של B. xylophilus ספוג ב-GFP dsRNA וספוג ב-dsRNA של גן המטרה הייתה 0.92 ו-0.52, בהתאמה (רמת הביטוי של הגן ppm-1 בקבוצת הביקורת שטופלה ב-ddH₂O נקבעה ל-1) (איור 1)....

Discussion

למרות שהיסטוריית החיים והסביבה הטפילית של B. xylophilus שונים מאלו של נמטודות אחרות, היה מחקר מוגבל על הפתוגנזה המולקולרית של פתוגן צמח זה. למרות ההתקדמות הרבה שהושגה ביישום טכנולוגיית עריכת הגנום CRISPR/Cas9 ב-C. elegans ובנמטודות אחרות, רק טכנולוגיית RNAi המיושמת על B. xylophilus פורסמה עד כה

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Baermann funnel	n/a	n/a	to isolate nematodes
Beacon Designer 7.9	Shanghai kangyusheng information technology co.	n/a	to design qPCR primers
Botrytis cinerea	n/a	n/a	as food for nematodes
Bursaphelenchus xylophilus	n/a	n/a	its number was NXY61 and was it was originally extracted from diseased Pinus massoniana in Ningbo, Zhejiang province, China.
constant temperature incubator	Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.	H1703544	to cultur nematodes
Electrophoresis apparatus	Bio-Rad Laboratories	1704466	to achieve electrophoretic analysis
Ethanol, 75%	Sinopharm Chemical Reagent Co.	80176961	to extract RNA
Ex Taq Polymerase Premix	Takara Bio Inc.	RR030A	for PCR
Ex Taq Polymerase Premix	Takara Bio Inc.	RR390A	for PCR
Gel imager	LongGene Scientific Instruments Co.	LG2020	to make nucleic acid bands visible
GraphPad Prism 8	GraphPad Prism	n/a	to analyze the data and make figurs
High Speed Centrifuge	Hangzhou Allsheng Instruments Co.	AS0813000	centrifug
High-flux tissue grinder	Bertin		to extract RNA
ImageJ software	National Institutes of Health	n/a	to measure the body lengths
isopropyl alcohol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.	L1909022	to extract RNA
Leica DM4B microscope	Leica Microsystems Inc.		to observe nematodes
magnetic beads	Aoran science technology co.	150010C	to extract RNA
MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific Inc.	AM1333	to synthesize dsRNA in vitro
NanoDrop ND-2000 spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific Inc.	NanoDrop 2000/2000C	to analyze the quality of the dsRNA
PCR Amplifier	Bio-Rad Life Medical Products Co.	1851148	to amplify nucleic acid sequence
Petri dishes	n/a	n/a	to cultur nematodes
pGEM-T Easy vector	Promega Corporation	A1360	for cloning
Potato Dextrose Agar (Medium)	n/a	n/a	to cultur Botrytis cinerea
Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser	Takara Bio Inc.	RR047B	to synthetic cDNA
Primer Premier 5.0	PREMIER Biosoft	n/a	to design PCR primers
primers:ppm-1-F/R	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3
q-ppm-1-F/R	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3'
Real-time thermal cycler qTOWER 2.2	Analytique Jena Instruments (Beijing) Co.		for qPCR
shaking table	Shanghai Zhicheng analytical instrument manufacturing co.		to soak nematodes
stereoscopic microscope	Chongqing Optec Instrument Co.	1814120	to observe nematodes
T7-GFP-F/R	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3'
T7 promoter	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	TAATACGACTCACTATAGGG
Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit	Takara Bio Inc.	9762	to recover DNA
TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)	Takara Bio Inc.	RR820A	for qPCR
trichloroethane	Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co.		to extract RNA
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific Inc.	15596026	total RNA extraction reagent,to extract RNA