파인우드 선충류에서의 RNA 간섭의 적용, Bursaphelenchus xylophilus

요약

여기에서는 유전자 기능 연구를 용이하게하기 위해 Bursaphelenchus xylophilus 에서 RNA 간섭에 대한 상세한 담그는 방법을 소개합니다.

초록

소나무 선충류 인 Bursaphelenchus xylophilus는 전 세계적으로 가장 파괴적인 침입 종 중 하나이며 소나무의 시들음과 결국 죽음을 초래합니다. 그들의 경제적 및 환경적 중요성에 대한 인식에도 불구하고, 지금까지 기존의 전방 유전학 및 트랜스제닉 방법을 사용하여 식물 기생 선충류 (PPNs)의 상세한 유전자 기능을 연구하는 것은 불가능했습니다. 그러나, 역 유전학 기술로서, RNA 간섭 (RNAi)은 B. xylophilus 를 포함한 선충류의 기능적 유전자에 대한 연구를 용이하게합니다.

이 논문은 B. xylophilus에서 ppm-1 유전자의 RNAi에 대한 새로운 프로토콜을 간략하게 설명하며, 이는 다른 병원성 선충류의 개발 및 재생에 중요한 역할을하는 것으로 보고되었습니다. RNAi의 경우, T7 프로모터를 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 표적 단편의 5'-말단에 연결시키고, 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 시험관내 전사에 의해 합성하였다. 이어서, dsRNA 전달은 선충류를 합성 신경자극제와 혼합된 dsRNA 용액에 담그면서 달성되었다. B. xylophilus (대략 20,000 개체)의 동기화된 청소년을 세척하고 25°C에서 어둠 속에서 24 h 동안 담금질 완충액 중의 dsRNA (0.8 μg/mL)에 담갔다.

동일한 양의 선충류를 대조군으로서 dsRNA가 없는 침지 완충액에 넣었다. 한편, 또 다른 동일한 양의 선충류를 대조군으로서 녹색 형광 단백질(gfp) 유전자 dsRNA와 함께 침지 완충액에 넣었다. 침지 후, 표적 전사체의 발현 수준은 실시간 정량적 PCR을 사용하여 결정하였다. RNAi의 효과는 표현형의 현미경 관찰과 그룹 간의 성인의 신체 크기 비교를 사용하여 확인되었습니다. 현재의 프로토콜은 B. xylophilus 및 기타 기생 선충류의 유전자 기능을 유전 공학을 통해 통제 전략을 개발하기위한 연구를 발전시키는 데 도움이 될 수 있습니다.

서문

식물 기생 선충류 (PPN)는 식량 안보 및 산림 생태계에 대한 지속적인 위협입니다. 그들은^매년 1,000 억 달러의 경제적 손실을 초래하며, 그 중 가장 문제가되는 것은 주로 뿌리 매듭 선충류, 낭종 선충류 및 소나무 선충류입니다. 파인우드 선충류인 Bursaphelenchus xylophilus는 소나무 시들음병의 원인균인 이주, 내구생 선충류입니다². 그것은 전 세계적으로 소나무 숲에 큰 해를 끼쳤습니다³. Van Megen et ^al.4의 용어를 사용하여, B. xylophilus 는 Parasitaphelenchidae의 구성원이며 clade 10에 속하는 반면, 대부분의 다른 주요 식물 기생충은 clade 12에 속합니다.

독립적이고 최근에 진화 된 식물 기생충 인 B. xylophilus 는 비교 연구를위한 매력적인 모델입니다. 현재까지 clade 12에 속하는 뿌리 매듭 선충류와 낭종 선충류에 대한 상당한 연구가 있었으며, 이는 의무적이며 앉아있는 내생 기생충이며 가장 강렬하게 연구 된 선충류 중 일부입니다. 그러나이 중요한 분야에서 추가 연구를 수행하는 것은 중요한 도전과 함께 온다 : 기생 유전자의 기능은 연구 병목 현상이다. 기능적 연구는 일반적으로 자궁외 발현 및 녹다운 / 아웃 실험을 포함하지만 선충류에 대한 효과적인 유전 적 변형 프로토콜에 의존합니다. 결과적으로, PPN의 역유전학은 거의 독점적으로 RNAi에 의한 유전자 침묵에 의존한다.

진핵 세포에 널리 존재하는 메카니즘인 RNAi는 이중 가닥 RNA(dsRNA)5를 도입하여 유전자 발현을 침묵^시킨다. 현재까지 dsRNA에 의해 유도되는 전사 후 유전자-침묵 메카니즘은 모든 연구된 진핵생물에서 발견되었으며, 기능적 유전체학 연구 및 기타 응용의 도구로서 RNAi 기술은 많은 유기체에서 급속히 발전해 왔다. 1998년⁶년 예쁜꼬마선충에서 RNAi 기계가 발견된 이래로, RNAi 기술은 선충류의 유전자 기능을 확인하는 효과적인 방법이 되었으며, 병원성 선충류⁷를 효과적으로 조절하는 새로운 방법으로 제안되고 있다.

RNAi는 기술적으로 facile-dsRNA에 청소년을 담그면 충분할 수 있다; 그러나, 이러한 접근법의 효능 및 재현성은 선충류 종 및 표적 유전자⁸에 따라 광범위하게 다양하다. 뿌리 매듭 선충류, 멜로이도인 인코그니타의 RNAi 경로에 관여하는 20개의 유전자의 침묵은 긴 dsRNAs를 트리거로 사용하여 조사되었으며, 그 결과 일부 유전자의 발현의 증가 및 변화 없음⁹를 포함한 다양한 반응을 초래하였다. 이러한 결과는 표적 유전자가 RNAi 녹다운에 다르게 반응할 수 있음을 보여주며, RNAi를 통한 선충류 조절을 위한 표적으로서의 적합성에 대한 철저한 평가가 필요하다. 그러나 현재 B. xylophilus의 발달 및 생식 생물학에 대한 연구가 부족합니다.

이전 연구^10,11,12,13의 연속으로, 우리는 dsRNA의 합성^, 합성 신경 자극제 담금질 및 정량적 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR) 검출을 포함하여 B. xylophilus의 ppm-1 유전자의 기능을 연구하기 위해 RNAi를 적용하기위한 프로토콜을 여기에서 설명합니다. 이 실험적 접근 방식에서 얻은 지식은 기본적인 생물학적 시스템을 이해하고 소나무 시들음 질병을 예방하는 데 크게 기여할 것입니다.

프로토콜

이 연구는 절강 농업 및 임업 대학의 동물 실험위원회에서 승인했습니다. B. xylophilus 분리 NXY61은 원래 중국 절강 성 닝보 (Zhejiang)¹¹의 닝보 (Ningbo) 지역의 병든 Pinus massoniana에서 추출되었습니다.

1. 유전자 클로닝

참고: 이 프로토콜에 사용된 프라이머에 대한 자세한 내용은 자료표를 참조하십시오.

1. 선충류를 수집하십시오.
   1. Botrytis cinerea의 균사체 상의 B. xylophilus 균주를 감자 덱스트로스 한천 (PDA) 플레이트 상에서 3-5일 동안 25°C에서 배양하였다.
   2. Bellman 깔때기 방법¹⁴를 사용하여 선충류를 수집하십시오.
      1. 클램핑된 고무 튜브를 깔때기 아래에 놓고 깔때기 입에 여과지 두 겹을 놓습니다. 곰팡이 배양물을 깔때기로 옮기고 물을 추가하여 곰팡이 매트를 담그십시오. 2 시간 동안 기다린 다음 선충류를 수집하십시오.
2. 다음 단계에 따라 총 RNA 추출 시약( 표 참조)¹¹ 을 사용하여 선충류로부터 전체 RNA를 추출한다.
   1. 500 μL의 추출 시약과 100 μL의 자기 비드를 2 mL 원심분리 튜브에 첨가한다. 선충류 20 μL를 흡인하고, 샘플을 분쇄기로 옮겨 9,000 × g 에서 30 s 동안 분쇄한다. 5분 동안 인큐베이션한 다음, 12,000 × g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리한다.
   2. 상청액을 새로운 원심분리 튜브로 옮깁니다. 100 μL의 클로로포름을 첨가하고, 튜브를 캡핑하고, 튜브를 여러 번 뒤집어 혼합한다. 3분 동안 인큐베이션한 다음, 4°C에서 12,000 × g 에서 10분 동안 원심분리한다.
   3. 상청액을 새로운 원심분리 튜브로 옮깁니다. 250 μL의 이소프로필 알코올을 첨가하고 격렬하게 와류하십시오. 12,000 × g 에서 10분 동안 원심분리한다.
   4. 상층액을 버리십시오. 500 μL의 75% 에탄올을 첨가하여 RNA를 세척한 다음, 샘플을 와류시킨다. 이를 12,000 × g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리한다.
   5. RNA 펠릿을 5분 동안 공기-건조시켰다.
   6. 펠렛을 RNase가 없는 물 30 μL에 재현탁시킨다.
   7. 공식을 사용하여 RNA 농도를 계산하십시오 : A260 × 희석 × 40 = μg RNA / mL. A260/A280 비율을 계산합니다.
      참고 : ~ 2의 비율은 순수한 것으로 간주됩니다.
3. 좋은 품질의 RNA의 역전사를 수행하여 cDNA 주형을 얻는다.
   1. 한 쌍의 특정 프라이머인 ppm-1-F/R(물질표 참조)을 설계하고 사용하여 B. xylophilus에서 Bx-ppm-1 유전자의 부분 코딩 서열을 증폭시킨다(GenBank 수탁번호 QTZ96795).
   2. ppm-1 유전자 서열을 표준 클로닝 프로토콜¹¹에 따라 T7 프로모터를 포함하는 pGEM-Teasy 벡터로 복제한다.
      1. PCR 반응을 다음과 같이 설정한다: cDNA 2 μL, 2x Ex Taq 중합효소 프리믹스 25 μL, 각 프라이머 2 μL(10 pmol/l), 멸균 증류수를 최종 부피 50 μL로 설정한다.
      2. 다음과 같이 증폭 절차를 수행한다: 94°C에서 5분; 이어서 94°C에서 30초, 55°C에서 30초, 및 72°C에서 1분의 35사이클; 및 최종 연장 단계를 72°C에서 5분 동안 포함한다.
      3. 증폭된 제품을 pGEM-T Easy 벡터로 복제하여 시퀀싱합니다.

2. dsRNA의 합성

1. 양쪽 말단에 T7 프로모터 부위를 첨가하도록 설계된 프라이머로 PCR을 사용하여 dsRNA 합성을 위한 DNA 주형을 준비한다. T7 프로모터 서열을 프라이머의 5' 말단에 첨가한다.
2. ppm-1 유전자 단편(894 bp)을 포함하는 플라스미드를 PCR용 주형으로 사용하여 T7 프로모터¹¹을 포함하는 단편을 회수하였다. 위에서 설명한 PCR 절차 및 시스템을 사용하십시오.
3. 시험관내 전사 키트를 사용하여 dsRNA¹¹을 합성한다.
   1. 냉동 시약을 얼음 위에 녹입니다.
   2. 2 μL의 10x 반응 완충액, 2 μL의 효소 믹스, 및 1 μg의 DNA를 원심분리 튜브에 첨가한다. 뉴클레아제가 없는 물을 첨가하여 표준 4 μL 반응을 생성한다. 이어서, 동량의 네 개의 리보뉴클레오티드 용액 (ATP, CTP, GTP 및 UTP)을 함께 혼합하고, 혼합물 8 μL를 튜브에 첨가한다. 완전히 혼합하고 37°C에서 4시간 동안 인큐베이션한다.
   3. 1 μL의 DNase를 첨가하고, 잘 혼합하고, 37°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.
   4. 반응을 중지하고 뉴클레아제가없는 물 30 μL와 LiCl 침전 용액 30 μL를 첨가하여 RNA를 침전시켰다. 철저히 섞으십시오. -20°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.
   5. 12,000 × g 및 4°C에서 15분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.
   6. 75% 에탄올 1 mL를 첨가하여 RNA를 세척한다. 샘플을 볼텍스하고, 이를 12,000 × g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리한다.
   7. RNA 펠릿을 3분 동안 공기-건조시켰다.
   8. 펠렛을 RNase가 없는 물 30 μL에 재현탁시킨다.
   9. 분광광도계를 이용하여 dsRNA의 품질을 분석한다. dsRNA 샘플 1 μL를 측정 받침대 상에 피펫팅하고 파장을 340 nm로 설정하였다. 1.0 % 아가로스 젤로 제품을 시각화하십시오.

3. 담그기에 의한 RNAi

1. 4 μL의 5x 담금 완충액 (0.05% 젤라틴, 5.5 mM KH2PO4, 2.1 mM NaCl, 4.7 mM_NH4Cl, 3 mM 스페르미딘)을 dsRNA 및_ddH2O와 혼합하여 총 부피 20 μL의 최종 RNA 농도 및 0.8 μg/mL의 최종 RNA 농도를 생성한다.
2. J2 애벌레를 습득하십시오.
   1. 곰팡이 배양물에서 선충류를 수집하여 직경 6cm의 유리 페트리 접시로 옮깁니다. 선충류가 자유롭게 수영 할 수 있도록 접시에 물 10mL를 넣으십시오. 선충류를 접시에 30 분 동안 보관하고 계란이 바닥에 달라 붙을 때까지 기다리십시오.
   2. 물과 선충류를 조심스럽게 제거하고 알을 방해하지 않도록하십시오. 모든 애벌레와 성인이 제거 될 때까지 단계를 반복하여 접시에 계란 만 남겨 둡니다.
   3. 수집된 알을 25°C의 어둠 속에서 24시간 동안 부화시켜 J2 유충을 얻었다. J2 유충을 수집하여 튜브에 넣은 다음 RNAi 실험¹⁵를 위해_ddH2O로 3회 세척한다.
   4. J2 유충을 dsRNA 용액이 들어있는 2 mL 튜브로 옮기고 레조르시놀 용액 (틴포일에 싸서 물에 용해)을 추가하여 최종 농도 1.0 %를 생성합니다. 유충이 dsRNA를 효과적으로 흡수하는지 확인하기 위해 25°C에서 24시간 동안 진탕 테이블 상에서 15 × g 에서 원심분리로 유충을 인큐베이션한다.
   5. 동일한 양의 선충류를 dsRNA 프로브 없이 또는 대조군으로서 GFP dsRNA 프로브와 함께 담그기 완충액에 담그십시오. GFP 유전자 (gfp, M62653.1)를 비내인성 대조군으로 사용하고 유전자 특이적 프라이머 T7-GFP-F/R을 사용하여 gfp 의 dsRNA를 합성한다.

4. qPCR 검출

1. 표적 유전자 간섭, GFP 유전자 간섭 및 방해받지 않은 대조군을 포함하여_{ddH2O로 J2}유충을 청소하십시오. 상기 기재된 방법을 이용하여 각 그룹으로부터 총 RNAs를 추출한다.
2. qPCR을 시작하십시오.
   1. 원하는 소프트웨어를 사용하여 q-ppm-1-F/R 프라이머를 설계 하십시오(재료 표 참조).
   2. qPCR 반응을 cDNA 1 μL, 형광 프리믹스 6 μL, 각 프라이머 0.4 μL(10 pmol/l) 및 멸균 증류수를 포함하는 12 μL로 설정한다.
   3. qPCR을 다음과 같이 수행한다: 95°C에서 2분; 이어서 95°C에서 10초, 55°C에서 30초, 72°C에서 1분의 40 사이클을 따랐다.
   4. actb 유전자(GenBank 기탁번호 EU100952) 및 tbb-2 유전자(GenBank 기탁번호 MT769316) 또는 다른 유전자를 내부 참조 유전자로 사용하여 RNAi¹⁵ 이후의 유전자 발현 수준의 변화를 평가하였다.
3. 사이클 역치(Ct) 값 및 용해 곡선에 따라, ^2-ΔΔCt 방법을 사용하여 표적 유전자의 상대적 발현 수준을 추정하고 간섭 효율을 검증한다.
   1. 표적 유전자의 Ct 값으로부터 각 샘플의 내부 참조 유전자의 Ct 값을 뺀 다음 ΔCt 값을 구한다. 그런 다음, 대조군의 ΔCt 값으로부터 간섭기의 ΔCt 값을 뺀 후 ΔΔCt 값을 구한다.
      참고: ΔΔCt 값이 0보다 크면 간섭이 효과적임을 나타냅니다.

5. RNAi를 따르는 선충류 성인의 몸 길이 평가

1. RNAi 후, J2 유충을 25°C에서 60시간 동안 PDA 플레이트 내의 B. 시네레아 잔디밭 상에서 성인이 될 때까지¹⁵시간 동안 배양하였다.
2. Bellman 깔때기 방법을 사용하여 성인을 수집하십시오 (단계 1.1.2.1 참조)¹⁴.
3. 현미경으로 성인 선충류의 이미지를 획득하고 ImageJ 소프트웨어 (또는 기타 측정 소프트웨어)를 사용하여 신체 길이를 측정하십시오.
   1. | 분석을 선택하여 ImageJ를 사용하여 길이 측정 배율을 설정합니다. 거리를 알고 있으면 그려진 직선의 길이 값을 입력합니다. 길이 단위를 입력합니다.
   2. 전역(모든 사진에 이 표준 사용) 확인란을 선택하고 확인을 클릭하여 측정할 이미지에서 직선으로 측정할 길이를 선택합니다.
   3. Ctrl+M(측정) 명령을 사용하여 결과를 표시하고 결과 창에 기록합니다.
4. 통계 분석을 위해 50 마리의 남성과 50 마리의 여성 선충류를 측정하십시오¹².
5. 각 표본에 대한 평균 및 표준 편차를 계산하여 데이터를 분석합니다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 여러 그룹의 표본 평균을 비교합니다.

결과

RNAi 후 B. xylophilus 의 ppm-1 발현 분석
GFP dsRNA와 표적 유전자 dsRNA로 침지시킨 B. xylophilus의 ppm-1 유전자의 상대적 발현량은 각각 0.92 및 0.52이었다(ddH2O 처리 대조군의 ppm-1 유전자 발현량은 1로 설정하였다)(도 1). 따라서, 외인성 dsRNA는 B. 크실로필루스의 ppm-1

토론

B. xylophilus의 삶의 역사와 기생 환경은 다른 선충류의 삶과 다르지만,이 식물 병원균의 분자 병인에 대한 연구는 제한적이었습니다. C. elegans 및 기타 선충류에 CRISPR / Cas9 게놈 편집 기술을 적용하는 데 큰 진전이 있었음에도 불구하고 B. xylophilus에 적용된 RNAi 기술 만^{현재까지 17} 일까지 발표되었습니다. RNAi는 선충류의 유전자 기능을 연구하는 데 사용할 수있?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Baermann funnel	n/a	n/a	to isolate nematodes
Beacon Designer 7.9	Shanghai kangyusheng information technology co.	n/a	to design qPCR primers
Botrytis cinerea	n/a	n/a	as food for nematodes
Bursaphelenchus xylophilus	n/a	n/a	its number was NXY61 and was it was originally extracted from diseased Pinus massoniana in Ningbo, Zhejiang province, China.
constant temperature incubator	Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.	H1703544	to cultur nematodes
Electrophoresis apparatus	Bio-Rad Laboratories	1704466	to achieve electrophoretic analysis
Ethanol, 75%	Sinopharm Chemical Reagent Co.	80176961	to extract RNA
Ex Taq Polymerase Premix	Takara Bio Inc.	RR030A	for PCR
Ex Taq Polymerase Premix	Takara Bio Inc.	RR390A	for PCR
Gel imager	LongGene Scientific Instruments Co.	LG2020	to make nucleic acid bands visible
GraphPad Prism 8	GraphPad Prism	n/a	to analyze the data and make figurs
High Speed Centrifuge	Hangzhou Allsheng Instruments Co.	AS0813000	centrifug
High-flux tissue grinder	Bertin		to extract RNA
ImageJ software	National Institutes of Health	n/a	to measure the body lengths
isopropyl alcohol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.	L1909022	to extract RNA
Leica DM4B microscope	Leica Microsystems Inc.		to observe nematodes
magnetic beads	Aoran science technology co.	150010C	to extract RNA
MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific Inc.	AM1333	to synthesize dsRNA in vitro
NanoDrop ND-2000 spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific Inc.	NanoDrop 2000/2000C	to analyze the quality of the dsRNA
PCR Amplifier	Bio-Rad Life Medical Products Co.	1851148	to amplify nucleic acid sequence
Petri dishes	n/a	n/a	to cultur nematodes
pGEM-T Easy vector	Promega Corporation	A1360	for cloning
Potato Dextrose Agar (Medium)	n/a	n/a	to cultur Botrytis cinerea
Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser	Takara Bio Inc.	RR047B	to synthetic cDNA
Primer Premier 5.0	PREMIER Biosoft	n/a	to design PCR primers
primers:ppm-1-F/R	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3
q-ppm-1-F/R	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3'
Real-time thermal cycler qTOWER 2.2	Analytique Jena Instruments (Beijing) Co.		for qPCR
shaking table	Shanghai Zhicheng analytical instrument manufacturing co.		to soak nematodes
stereoscopic microscope	Chongqing Optec Instrument Co.	1814120	to observe nematodes
T7-GFP-F/R	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3'
T7 promoter	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	TAATACGACTCACTATAGGG
Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit	Takara Bio Inc.	9762	to recover DNA
TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)	Takara Bio Inc.	RR820A	for qPCR
trichloroethane	Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co.		to extract RNA
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific Inc.	15596026	total RNA extraction reagent,to extract RNA