Anwendung von RNA-Interferenz im Kiefernnematoden, Bursaphelenchus xylophilus

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine detaillierte Einweichmethode der RNA-Interferenz in Bursaphelenchus xylophilus vor, um die Untersuchung von Genfunktionen zu erleichtern.

Zusammenfassung

Der Kiefernfadenwurm, Bursaphelenchus xylophilus, ist eine der zerstörerischsten invasiven Arten weltweit, die das Welken und schließlich das Absterben von Kiefern verursacht. Trotz der Anerkennung ihrer ökonomischen und ökologischen Bedeutung war es bisher unmöglich, die detaillierten Genfunktionen von pflanzenparasitischen Nematoden (PPNs) mit konventioneller Vorwärtsgenetik und transgenen Methoden zu untersuchen. Als umgekehrte genetische Technologie erleichtert die RNA-Interferenz (RNAi) jedoch die Untersuchung der funktionellen Gene von Nematoden, einschließlich B. xylophilus.

Dieser Artikel skizziert ein neues Protokoll für RNAi des ppm-1-Gens in B. xylophilus, von dem berichtet wurde, dass es eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Reproduktion anderer pathogener Nematoden spielt. Für RNAi wurde der T7-Promotor durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit dem 5′-Terminal des Zielfragments verknüpft, und doppelsträngige RNA (dsRNA) wurde durch In-vitro-Transkription synthetisiert. Anschließend wurde die dsRNA-Abgabe erreicht, indem die Nematoden in einer dsRNA-Lösung mit synthetischen Neurostimulanzien eingeweicht wurden. Synchronisierte Jungtiere von B. xylophilus (ca. 20.000 Individuen) wurden gewaschen und im Einweichpuffer für 24 h im Dunkeln bei 25 °C in dsRNA (0,8 μg/ml) eingeweicht.

Die gleiche Menge an Nematoden wurde in einen Einweichpuffer ohne dsRNA als Kontrolle gegeben. In der Zwischenzeit wurde eine weitere identische Menge von Nematoden in einen Einweichpuffer mit dem grün fluoreszierenden Protein (gfp) -Gen dsRNA als Kontrolle gegeben. Nach dem Einweichen wurde das Expressionsniveau der Zieltranskripte mittels quantitativer real-time PCR bestimmt. Die Wirkung von RNAi wurde dann durch mikroskopische Beobachtung der Phänotypen und einen Vergleich der Körpergröße der Erwachsenen unter den Gruppen bestätigt. Das aktuelle Protokoll kann dazu beitragen, die Forschung voranzutreiben, um die Funktionen der Gene von B. xylophilus und anderen parasitären Nematoden besser zu verstehen, um Kontrollstrategien durch Gentechnik zu entwickeln.

Einleitung

Pflanzenparasitäre Nematoden (PPNs) sind eine anhaltende Bedrohung für die Ernährungssicherheit und die Waldökosysteme. Sie verursachen jedes Jahr schätzungsweise 100 Milliarden USD an wirtschaftlichen Verlusten¹, von denen die problematischsten vor allem Wurzelknotennematoden, Zystennematoden und Kiefernnematoden sind. Der Kiefernfadenwurm, Bursaphelenchus xylophilus, ist ein wandernder, endoparasitischer Fadenwurm, der der ursächliche Erreger der Kiefernwelke^{ist 2}. Es hat den Kiefernwäldern weltweit großen Schaden zugefügt³. Nach der Terminologie von Van Megen et ^al.4 ist B. xylophilus ein Mitglied der Parasitaphelenchidae und gehört zur Klade 10, während die meisten anderen wichtigen Pflanzenparasiten zur Klade 12 gehören.

Als eigenständiger und neu entwickelter Pflanzenparasit ist B. xylophilus ein attraktives Modell für vergleichende Studien. Bis heute gibt es umfangreiche Forschungen über Wurzelknotennematoden und Zystennematoden der Klade 12, die obligate, sitzende Endoparasiten sind und zu den am intensivsten untersuchten Nematoden gehören. Die weitere Forschung auf diesem wichtigen Gebiet ist jedoch mit einer großen Herausforderung verbunden: Die Funktion von Parasitengenen ist ein Forschungsengpass. Funktionelle Studien umfassen im Allgemeinen ektopische Expressions- und Knockdown- / Out-Experimente, stützen sich jedoch auf effektive genetische Transformationsprotokolle für den Nematoden. Infolgedessen beruht die umgekehrte Genetik in PPNs fast ausschließlich auf Gen-Silencing durch RNAi.

RNAi, ein Mechanismus, der in eukaryotischen Zellen weit verbreitet ist, bringt die Genexpression zum Schweigen, indem er doppelsträngige RNA (dsRNA) ^einführt5. Bis heute wurde der durch dsRNA induzierte posttranskriptionelle Gen-Silencing-Mechanismus in allen untersuchten Eukaryoten gefunden, und die RNAi-Technologie als Werkzeug der funktionellen Genomforschung und anderer Anwendungen hat sich in vielen Organismen schnell entwickelt. Seit der Entdeckung der RNAi-Maschinerie in Caenorhabditis elegans im Jahr 1998⁶ haben sich RNAi-Techniken zu wirksamen Methoden zur Identifizierung der Genfunktion von Nematoden entwickelt und werden als neuer Weg zur wirksamen Kontrolle pathogener Nematoden vorgeschlagen⁷.

RNAi ist technisch das Einweichen der Jungtiere in dsRNA kann ausreichen; Die Wirksamkeit und Reproduzierbarkeit dieses Ansatzes variiert jedoch stark mit der Nematodenspezies und dem Zielgen⁸. Die Stummschaltung von 20 Genen, die an den RNAi-Signalwegen des Wurzelknotennematoden, Meloidogyne incognita, beteiligt sind, wurde unter Verwendung langer dsRNAs als Auslöser untersucht, was zu verschiedenen Reaktionen führte, einschließlich einer Zunahme und keiner Veränderung der Expression einiger Gene⁹. Diese Ergebnisse zeigen, dass Zielgene unterschiedlich auf RNAi-Knockdown reagieren können, was eine umfassende Bewertung ihrer Eignung als Ziele für die Nematodenkontrolle über RNAi erfordert. Derzeit gibt es jedoch einen Mangel an Forschung zur Entwicklungs- und Fortpflanzungsbiologie von B. xylophilus.

Als Fortsetzung der früheren Arbeit^10,11,12,13 beschreiben wir hier ein Protokoll zur Anwendung von RNAi zur Untersuchung der Funktion des ppm-1-Gens von B. xylophilus^, einschließlich der Synthese von dsRNA, des Einweichens synthetischer Neurostimulanzien und des quantitativen Polymerase-Kettenreaktionsnachweises (qPCR). Die Erkenntnisse aus diesem experimentellen Ansatz werden wahrscheinlich deutlich zum Verständnis grundlegender biologischer Systeme und zur Vorbeugung von Kiefernwelke beitragen.

Protokoll

Die Studie wurde vom Rat für Tierversuche der Zhejiang Agricultural & Forestry University genehmigt. Das B. xylophilus-Isolat NXY61 wurde ursprünglich aus einem erkrankten Pinus massoniana in der Region Ningbo in der Provinz Zhejiang, China^{extrahiert 11}.

1. Klonen von Genen

HINWEIS: Weitere Informationen zu den in diesem Protokoll verwendeten Grundierungen finden Sie in der Materialtabelle .

1. Sammle Nematoden.
   1. Kultur des B. xylophilus-Stammes auf den Myzelien von Botrytis cinerea auf Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA)-Platten bei 25 °C für 3-5 Tage.
   2. Sammeln Sie die Nematoden mit der Bellman-Trichtermethode¹⁴.
      1. Legen Sie einen eingespannten Gummischlauch unter einen Trichter und legen Sie zwei Schichten Filterpapier in den Mund des Trichters. Die Pilzkulturen in den Trichter geben und Wasser hinzufügen, um die Pilzmatte einzutauchen. Warten Sie 2 Stunden und sammeln Sie dann die Nematoden.
2. Extrahieren Sie die gesamte RNA aus den Nematoden mit einem Gesamt-RNA-Extraktionsreagenz (siehe Materialtabelle)¹¹ gemäß den folgenden Schritten.
   1. Geben Sie 500 μL Extraktionsreagenz und 100 μL Magnetperlen in ein 2 ml Zentrifugenröhrchen. 20 μL der Nematoden aspirieren und die Probe zum Mahlen bei 9.000 × g für 30 s in ein Mahlwerk geben. 5 min inkubieren und dann 10 min bei 12.000 × g und 4 °C zentrifugieren.
   2. Den Überstand in ein neues Zentrifugenröhrchen überführen. Fügen Sie 100 μL Chloroform hinzu, verschließen Sie das Röhrchen und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen. 3 min inkubieren und dann 10 min bei 12.000 × g bei 4 °C zentrifugieren.
   3. Den Überstand in ein neues Zentrifugenröhrchen überführen. Fügen Sie 250 μL Isopropylalkohol hinzu und wirbeln Sie kräftig. Zentrifugieren bei 12.000 × g für 10 min.
   4. Verwerfen Sie den Überstand. Fügen Sie 500 μL 75% Ethanol hinzu, um die RNA zu waschen und dann die Probe zu wirbeln. Zentrifugieren Sie es für 5 min bei 12.000 × g und 4 °C.
   5. Trocknen Sie das RNA-Pellet 5 min an der Luft.
   6. Resuspendieren Sie das Pellet in 30 μL RNase-freiem Wasser.
   7. Berechnen Sie die RNA-Konzentration mit der Formel: A260 × Verdünnung × 40 = μg RNA/ml. Berechnen Sie das A260/A280-Verhältnis.
      HINWEIS: Ein Verhältnis von ~2 gilt als rein.
3. Führen Sie eine umgekehrte Transkription von RNA guter Qualität durch, um die cDNA-Vorlage zu erhalten.
   1. Entwerfen und verwenden Sie ein Paar spezifischer Primer, ppm-1-F/R (siehe Materialtabelle), um die teilweise kodierende Sequenz des Bx-ppm-1-Gens in B. xylophilus (GenBank-Zugangsnummer QTZ96795) zu amplifizieren.
   2. Klonen Sie die ppm-1-Gensequenzen in den pGEM-Teasy-Vektor, der den T7-Promotor enthält, nach einem Standard-Klonierungsprotokoll¹¹.
      1. Stellen Sie die PCR-Reaktionen wie folgt ein: 2 μL cDNA, 25 μL 2x Ex Taq Polymerase Premix, 2 μL jedes Primers (10 pmol/l) und steriles destilliertes Wasser auf ein Endvolumen von 50 μL.
      2. Führen Sie den Verstärkungsvorgang wie folgt durch: 5 min bei 94 °C; gefolgt von 35 Zyklen von 30 s bei 94 °C, 30 s bei 55 °C und 1 min bei 72 °C; und eine letzte Verlängerungsstufe bei 72 °C für 5 min.
      3. Klonen Sie die amplifizierten Produkte in einen pGEM-T Easy Vektor für die Sequenzierung.

2. Synthese von dsRNA

1. Bereiten Sie die DNA-Vorlage für die dsRNA-Synthese unter Verwendung der PCR mit Primern vor, die entwickelt wurden, um T7-Promotorstellen an beiden Enden hinzuzufügen. Fügen Sie die T7-Promotorsequenz zum 5'-Ende der Primer hinzu.
2. Verwenden Sie das Plasmid, das das ppm-1-Genfragment (894 bp) enthält, als Vorlage für die PCR und gewinnen Sie das Fragment, das den T7-Promotor¹¹ enthält. Verwenden Sie das oben beschriebene PCR-Verfahren und -System.
3. Verwenden Sie ein In-vitro-Transkriptionskit , um dsRNA¹¹ zu synthetisieren.
   1. Die gefrorenen Reagenzien auf Eis auftauen.
   2. Geben Sie 2 μL 10x Reaktionspuffer, 2 μL Enzymmischung und 1 μg DNA in ein Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie nukleasefreies Wasser hinzu, um eine Standardreaktion von 4 μL zu erzeugen. Dann mischen Sie gleiche Volumina der vier Ribonukleotidlösungen (ATP, CTP, GTP und UTP) zusammen und geben 8 μL der Mischung in das Röhrchen. Gründlich mischen und 4 h bei 37 °C inkubieren.
   3. 1 μL DNase zugeben, gut mischen und 15 min bei 37 °C inkubieren.
   4. Stoppen Sie die Reaktion und fügen Sie 30 μL nukleasefreies Wasser und 30 μL LiCl-Fällungslösung hinzu, um die RNA auszufällen. Gründlich mischen. Über Nacht bei -20 °C inkubieren.
   5. 15 min bei 12.000 × g und 4 °C zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand.
   6. Fügen Sie 1 ml 75% Ethanol hinzu, um die RNA zu waschen. Wirbeln Sie die Probe und zentrifugieren Sie sie für 10 min bei 12.000 × g und 4 °C.
   7. Trocknen Sie das RNA-Pellet 3 min an der Luft.
   8. Resuspendieren Sie das Pellet in 30 μL RNase-freiem Wasser.
   9. Analysieren Sie die Qualität der dsRNA mit einem Spektralphotometer. Pipettieren Sie 1 μL der dsRNA-Probe auf den Messsockel und stellen Sie die Wellenlänge auf 340 nm ein. Visualisieren Sie die Produkte auf einem 1,0% igen Agarose-Gel.

3. RNAi durch Einweichen

1. Mischen Sie 4 μL 5x Einweichpuffer (0,05% Gelatine, 5,5 mM KH 2 PO 4, 2,1 mM NaCl, 4,7 mM NH₄ Cl, 3 mM Spermidin) mit der dsRNA und ddH₂O, um ein Gesamtvolumen von 20 μL undeine endgültige RNA-Konzentration von 0,8 μg / ml zu erhalten.
2. Erwerben Sie J2-Larven.
   1. Sammeln Sie die Nematoden aus den Pilzkulturen und geben Sie sie in eine Glas-Petrischale von 6 cm Durchmesser. Fügen Sie der Schale 10 ml Wasser hinzu, damit die Nematoden frei schwimmen können. Halten Sie die Nematoden 30 Minuten in der Schale und warten Sie, bis die Eier am Boden haften.
   2. Entfernen Sie das Wasser und die Nematoden vorsichtig und achten Sie darauf, die Eier nicht zu stören. Wiederholen Sie die Schritte, bis alle Larven und Erwachsenen entfernt sind und nur die Eier in der Schale bleiben.
   3. Die gesammelten Eier 24 h im Dunkeln bei 25 °C ausbrüten, um J2-Larven zu erhalten. Sammeln Sie die J2-Larven, legen Sie sie in ein Röhrchen und waschen Sie sie dreimal mit_ddH2Ofür das RNAi-Experiment¹⁵.
   4. Die J2-Larven werden in das 2-ml-Röhrchen mit der dsRNA-Lösung überführt und Resorcinlösung (in Alufolie eingewickelt und in Wasser gelöst) hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 1,0% zu erhalten. Die Larven mit Zentrifugation bei 15 × g auf einem Schütteltisch für 24 h bei 25 °C inkubieren, um sicherzustellen, dass die Larven die dsRNA effektiv aufnehmen.
   5. Weichen Sie die gleiche Menge Nematoden im Einweichpuffer ohne die dsRNA-Sonde oder mit einer GFP-dsRNA-Sonde als Kontrolle ein. Verwenden Sie das GFP-Gen (gfp, M62653.1) als nicht-endogene Kontrolle und synthetisieren Sie die dsRNA von gfp mit genspezifischen Primern T7-GFP-F/R.

4. qPCR-Nachweis

1. Reinigen Sie die J2-Larven mit_ddH2O, einschließlich derjenigen mit Zielgeninterferenz, GFP-Geninterferenz und der ungestörten Kontrollgruppe. Extrahieren Sie die gesamten RNAs aus jeder Gruppe mit der oben beschriebenen Methode.
2. Starten Sie die qPCR.
   1. Entwerfen Sie die q-ppm-1-F/R-Primer mit der gewünschten Software (siehe Materialtabelle).
   2. Die qPCR-Reaktion wird in 12 μL mit 1 μL cDNA, 6 μL fluoreszierender Vormischung, 0,4 μL jedes Primers (10 pmol/l) und sterilem destilliertem Wasser eingerichtet.
   3. Führen Sie die qPCR wie folgt durch: 2 min bei 95 °C; gefolgt von 40 Zyklen von 10 s bei 95 °C, 30 s bei 55 °C und 1 min bei 72 °C.
   4. Verwenden Sie das actb-Gen (GenBank-Zugangsnummer EU100952) und das tbb-2-Gen (GenBank-Zugangsnummer MT769316) oder andere Gene als interne Referenzgene, um die Veränderungen des Genexpressionsniveaus nach RNAi¹⁵ zu bewerten.
3. Verwenden Sie entsprechend dem Zyklusschwellenwert (Ct) und der Auflösungskurve die ^{2-ΔΔCt-Methode} , um das relative Expressionsniveau des Zielgens abzuschätzen und die Interferenzeffizienz zu überprüfen.
   1. Subtrahieren Sie den Ct-Wert des internen Referenzgens jeder Probe vom Ct-Wert des Zielgens, um den ΔCt-Wert zu erhalten. Subtrahieren Sie dann den ΔCt-Wert der Interferenzgruppe vom ΔCt-Wert der Kontrollgruppe, um den ΔΔCt-Wert zu erhalten.
      HINWEIS: Ein ΔΔCt-Wert größer als 0 zeigt an, dass die Störung wirksam ist.

5. Bewerten Sie die Körperlänge von Nematoden, die RNAi folgen

1. Nach RNAi kultivieren Sie die J2-Larven bis ins Erwachsenenalter auf B. cinerea-Rasenflächen in PDA-Platten für 60 h bei 25 °C¹⁵.
2. Sammeln Sie die Erwachsenen mit der Bellman-Trichtermethode (siehe Schritt 1.1.2.1)¹⁴.
3. Nehmen Sie Bilder der erwachsenen Nematoden unter einem Mikroskop auf und verwenden Sie die ImageJ-Software (oder eine andere Messsoftware), um die Körperlängen zu messen.
   1. Messen Sie die Länge mit ImageJ, indem Sie Analyze | Legen Sie die Skalierung fest. Wenn der Abstand bekannt ist, geben Sie den Längenwert der gezeichneten geraden Linie ein. Geben Sie die Längeneinheit ein.
   2. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Global (verwenden Sie diesen Standard für alle Bilder), und klicken Sie auf OK , um die zu messende Länge mit einer geraden Linie auf dem zu messenden Bild auszuwählen.
   3. Verwenden Sie den Befehl Strg+M (Messung), um die Ergebnisse anzuzeigen und im Ergebnisfenster festzuhalten.
4. Nehmen Sie Messungen von 50 männlichen und 50 weiblichen Nematoden für statistische Analysen^{vor 12}.
5. Analysieren Sie die Daten, indem Sie den Mittelwert und die Standardabweichung für jede Stichprobe berechnen. Vergleichen Sie die Mittelwerte der Stichproben aus den verschiedenen Gruppen mit dem t-Test des Schülers.

Ergebnisse

Analyse der ppm-1-Expression von B. xylophilus nach RNAi
Das relative Expressionsniveau des ppm-1-Gens von B. xylophilus, das mit GFP dsRNA getränkt und mit Zielgen dsRNA getränkt war, betrug 0,92 bzw. 0,52 (das ppm-1-Genexpressionsniveau der ddH₂ O-behandelten Kontrollgruppe wurde auf 1 festgelegt) (Abbildung 1). Daher hat exogene dsRNA keinen Ein...

Diskussion

Obwohl sich die Lebensgeschichte und die parasitäre Umgebung von B. xylophilus von denen anderer Nematoden unterscheiden, gibt es nur begrenzte Forschung über die molekulare Pathogenese dieses Pflanzenpathogens. Trotz großer Fortschritte bei der Anwendung der CRISPR/Cas9-Genom-Editing-Technologie bei C. elegans und anderen Nematoden wurde bisher nur die RNAi-Technologie veröffentlicht, die auf B. xylophilus angewendet wurde¹⁷. RNAi ist eines der leistungsfähigsten v...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Baermann funnel	n/a	n/a	to isolate nematodes
Beacon Designer 7.9	Shanghai kangyusheng information technology co.	n/a	to design qPCR primers
Botrytis cinerea	n/a	n/a	as food for nematodes
Bursaphelenchus xylophilus	n/a	n/a	its number was NXY61 and was it was originally extracted from diseased Pinus massoniana in Ningbo, Zhejiang province, China.
constant temperature incubator	Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.	H1703544	to cultur nematodes
Electrophoresis apparatus	Bio-Rad Laboratories	1704466	to achieve electrophoretic analysis
Ethanol, 75%	Sinopharm Chemical Reagent Co.	80176961	to extract RNA
Ex Taq Polymerase Premix	Takara Bio Inc.	RR030A	for PCR
Ex Taq Polymerase Premix	Takara Bio Inc.	RR390A	for PCR
Gel imager	LongGene Scientific Instruments Co.	LG2020	to make nucleic acid bands visible
GraphPad Prism 8	GraphPad Prism	n/a	to analyze the data and make figurs
High Speed Centrifuge	Hangzhou Allsheng Instruments Co.	AS0813000	centrifug
High-flux tissue grinder	Bertin		to extract RNA
ImageJ software	National Institutes of Health	n/a	to measure the body lengths
isopropyl alcohol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.	L1909022	to extract RNA
Leica DM4B microscope	Leica Microsystems Inc.		to observe nematodes
magnetic beads	Aoran science technology co.	150010C	to extract RNA
MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific Inc.	AM1333	to synthesize dsRNA in vitro
NanoDrop ND-2000 spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific Inc.	NanoDrop 2000/2000C	to analyze the quality of the dsRNA
PCR Amplifier	Bio-Rad Life Medical Products Co.	1851148	to amplify nucleic acid sequence
Petri dishes	n/a	n/a	to cultur nematodes
pGEM-T Easy vector	Promega Corporation	A1360	for cloning
Potato Dextrose Agar (Medium)	n/a	n/a	to cultur Botrytis cinerea
Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser	Takara Bio Inc.	RR047B	to synthetic cDNA
Primer Premier 5.0	PREMIER Biosoft	n/a	to design PCR primers
primers:ppm-1-F/R	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3
q-ppm-1-F/R	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3'
Real-time thermal cycler qTOWER 2.2	Analytique Jena Instruments (Beijing) Co.		for qPCR
shaking table	Shanghai Zhicheng analytical instrument manufacturing co.		to soak nematodes
stereoscopic microscope	Chongqing Optec Instrument Co.	1814120	to observe nematodes
T7-GFP-F/R	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3'
T7 promoter	Tsingke Biotechnology Co.	n/a	TAATACGACTCACTATAGGG
Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit	Takara Bio Inc.	9762	to recover DNA
TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)	Takara Bio Inc.	RR820A	for qPCR
trichloroethane	Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co.		to extract RNA
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific Inc.	15596026	total RNA extraction reagent,to extract RNA