הדגמת עצבנות עור שעירה וגלברוסית בתבנית תלת-ממדית באמצעות גישות מרובות של כתמים פלואורסצנטיים וניקוי רקמות

Summary

עובי חלקי הרקמות הגביל את המחקר המורפולוגי של העצבנות של העור. הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקת ניקוי רקמות ייחודית להדמיית סיבי עצב עוריים בחתכי רקמה עבים של 300 מיקרומטר תחת מיקרוסקופיה קונפוקלית.

Abstract

עצבנות העור היא חלק חשוב ממערכת העצבים ההיקפית. למרות שהמחקר של סיבי העצב העוריים התקדם במהירות, רוב ההבנה של המאפיינים ההפצתיים והכימיים שלהם מגיעה מהכתמים היסטוכימיים ואימונוהיסטוכימיים קונבנציונליים על חלקי רקמה דקים. עם התפתחות טכניקת ניקוי הרקמה, ניתן היה לראות את סיבי העצב העוריים על חלקי רקמה עבים יותר. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כתמים פלואורסצנטיים מרובים על מקטעי רקמות בעובי של 300 מיקרומטר מהעור הכפי והגבי של כף הרגל האחורית של החולדה, שני אתרי העור השעירים והזוהרים האופייניים. כאן, הפפטיד הקשור לגן קלציטונין מסמן את סיבי העצב החושיים, בעוד שפלואידין וקולטן אנדותל היאלורונן אנדותל כלי הלימפה 1 מסמנים את הדם וכלי הלימפה, בהתאמה. תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, סיבי העצב החושיים המסומנים היו במעקב מלא במרחק ארוך יותר, רצים בצרורות בשכבה העורית העמוקה ובסגנון חופשי בשכבה השטחית. סיבי עצב אלה זרמו במקביל לכלי הדם או הקיפו אותם, וכלי הלימפה יצרו רשת תלת-ממדית (תלת-ממדית) בעור השעיר והזוהר. הפרוטוקול הנוכחי מספק גישה יעילה יותר לחקר העצבנות של העור מאשר השיטות הקונבנציונליות הקיימות מנקודת המבט המתודולוגית.

Introduction

העור, האיבר הגדול ביותר בגוף, המשמש כממשק מפתח לסביבה, מופנם בצפיפות על ידי סיבי עצב רבים ^1,2,3. למרות שעיוורון העור נחקר באופן נרחב בעבר בשיטות היסטולוגיות שונות, כגון צביעה על מקטעי עור ורקמות שלמים ^4,5,6, ההדגמה היעילה המפורטת של סיבי עצב עוריים היא עדיין אתגר ^7,8. בהתחשב בכך, הפרוטוקול הנוכחי פיתח טכניקה ייחודית להצגת סיבי עצב עוריים בצורה ברורה יותר בחלק הרקמה העבה.

בגלל הגבול של עובי החלקים, התצפית על סיבי עצב עור פנימיים אינה מדויקת מספיק כדי לתאר במדויק את הקשר בין סיבי עצב פפטידים הקשורים לגן קלציטונין (CGRP) לבין רקמות ואיברים מקומיים ממידע התמונה שנרכש. הופעתה של טכנולוגיית ניקוי רקמות תלת-ממדית מספקת שיטה אפשרית לפתרון בעיה זו ^9,10. ההתפתחות המהירה של גישות לניקוי רקמות הציעה כלים רבים לחקר מבני רקמות, איברים שלמים, הקרנות עצביות ובעלי חיים שלמים בתקופה האחרונה¹¹. ניתן היה לדמות את רקמת העור השקופה בקטע עבה הרבה יותר על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לקבל את הנתונים כדי לדמיין סיבי עצב עוריים.

במחקר הנוכחי, העור הכפי והגבי של כף רגל אחורית של חולדה נבחר כשני אתרי המטרה של עור שעיר וגלברוס ^3,4,7. כדי להתחקות אחר סיבי העצב העוריים במרחק רב יותר, רקמת העור נחתכה בעובי של 300 מיקרומטר לצורך צביעה אימונוהיסטוכימית והיסטוכימית, ולאחר מכן טיפול בפינוי רקמות. CGRP שימש לסימון סיבי העצב החושיים^12,13. בנוסף, כדי להדגיש את סיבי העצב העוריים על רקע הרקמה, נעשה שימוש נוסף בפלואידין ובקולטן היאלורונן אנדותל לימפתי 1 (LYVE1) כדי לתייג את כלי הדם וכלי הלימפה, בהתאמה^14,15.

גישות אלה סיפקו שיטה פשוטה שניתן ליישם כדי להדגים תצוגה ברזולוציה גבוהה של סיבי העצב העוריים וגם כדי לדמיין את המתאם המרחבי בין סיבי העצב, כלי הדם וכלי הלימפה בעור, אשר עשוי לספק הרבה יותר מידע כדי להבין את ההומאוסטזיס של העור הרגיל ואת השינוי העורי בתנאים הפתולוגיים.

Protocol

המחקר הנוכחי אושר על ידי ועדת האתיקה של המכון לדיקור סיני ו- Moxibustion, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה הסינית (מספר סימוכין D2018-04-13-1). כל ההליכים נערכו בעקבות מדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול בחיות מעבדה ולשימוש בהן (הוצאת האקדמיה הלאומית, וושינגטון הבירה, 1996). במחקר זה נעשה שימוש בשלוש חולדות זכר בוגרות (ספראג-דאולי, משקל 230 ± 15 גרם). כל בעלי החיים שוכנו במחזור אור/חושך של 12 שעות עם טמפרטורה ולחות מבוקרות ואפשרו גישה חופשית למזון ולמים.

1. פרפוזיה והכנת דגימה

1. הזריקו 250 מ"ג/ק"ג של תמיסת טריברומואתנול (ראו טבלת חומרים) באופן תוך-צפקי לתוך החולדה כדי לגרום להמתת חסד.
2. לאחר הפסקת הנשימה, השתמשו במספריים כירורגיים מפלדת אל-חלד כדי לפתוח את חלל בית החזה של החולדה. השתמשו במחטים של 20 גרם כדי לחדור דרך חדר הלב השמאלי¹³ בקצב של 3 מ"ל לדקה עם 100 מ"ל של 0.9% ממס תמיסה רגילה ואחריה 250-300 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד ב-0.1 M מאגר פוספט (PB, pH 7.4) (איור 1A,B).
3. לאחר זלוף, יש להשתמש באזמל כדי להסיר את עור הגב והסוליה מהכף האחורית.
   1. עבור הדגימות הדורשות חתך קפוא, לאחר לתקן את הרקמות ב 4% paraformaldehyde ב 0.1 M PB במשך 2 שעות; ולאחר מכן להגן על הרקמות ב 25% סוכרוז ב 0.1 M PB במשך יותר מ 24 שעות ב 4 °C (76 °F)
   2. עבור הדגימות עם החלק העבה הדורש ניקוי רקמות, לאחר לתקן את הרקמות ב 4% paraformaldehyde ב 1x מלוחים בופר פוספט (1x PBS) במשך 2 שעות; לאחר מכן הגן על הרקמות ב-1x PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (איור 1C–E).

2. צביעה פלואורסצנטית משולשת עם CGRP, פאלואידין ו-LYVE1 ולאחר מכן טיפול בפינוי רקמות

הערה: צביעה פלואורסצנטית משולשת עם CGRP, פאלואידין ו- LYVE1 הוחלה כדי לחשוף את סיבי העצב, כלי הדם וכלי הלימפה בעור שעיר וגלברוס על חלקי רקמה בעובי של 300 מיקרומטר לאחר טיפול בפינוי רקמות.

1. מכינים 2% אגרוז ב-1x PBS על ידי חימום במיקרו-תנור למשך 2 דקות עד שהאגרוז מתמוסס (ראו טבלת חומרים).
2. לאחר הכביסה, הטמיעו את רקמות העור ב-2% אגרוז בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, והניחו אותן בתוך קופסת הקרח לקירור (איור 1F,G).
3. קבעו את הרקמה המותקנת על המיקרוטום הרוטט עם מי הקרח וחתכו אותם בעובי של 500 מיקרומטר בכיוון הרוחבי. השתמש בפרמטרים הבאים כדי להגדיר את חיתוך הרטט ולסיים חיתוך: מהירות, 0.50 מ"מ לשנייה, משרעת, 1.5 מ"מ (איור 1H-K).
4. לאחר החיתוך, הסירו את האגרוז מהמקטעים ואחסנו אותם בצלחת בעלת שש בארות עם 1x PBS (pH 7.4) (איור 1L).
5. דגירה של חלקי הרקמה בתמיסה של 2% טריטון X-100 ב-1x PBS (TriX-PB) למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. ראו איור 2 להליך הבא.
6. מכניסים את חלקי הרקמה למאגר החוסם ומסובבים ב-72 סל"ד על השייקר למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
   הערה: הרכב המאגר החוסם הוא 10% סרום חמור רגיל, 1% טריטון-X 100 ו-0.2% נתרן אזיד ב-1x PBS (ראו טבלת חומרים).
7. מעבירים את חלקי הרקמה לתמיסה המכילה את הנוגדנים העיקריים של אנטי-CGRP חד-שבטי של עכברים (1:500) ונוגדן אנטי-LYVE1 רב-שבטי של כבשים (1:500) במאגר דילול בצינור המיקרו-צנטריפוג' (ראו טבלת חומרים), ומסובבים על השייקר במשך יומיים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: הרכב מאגר הדילול הוא 1% סרום חמורים רגיל, 0.2% Triton-X 100, ו-0.2% נתרן אזיד ב-1x PBS.
8. שטפו את חלקי הרקמות פעמיים עם חיץ כביסה בטמפרטורת החדר, ואז השאירו אותם על השייקר למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במאגר הכביסה.
   הערה: הרכב מאגר הכביסה הוא 0.2% Triton-X 100 ב-0.1 M PB (pH 7.4).
9. למחרת, העבירו את חלקי הרקמה לתמיסה המעורבת המכילה את הנוגדנים המשניים של חמור נגד עכבר IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) וחמור נגד כבשים IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), כמו גם אלקסה-קמח594 פאלואידין (1:1000) (ראו טבלת חומרים) בצינור מיקרוצנטריפוגה וסובבו ב-72 סל"ד בשייקר במשך 5 שעות ב-4 מעלות צלזיוס.
10. יש לשטוף את חלקי הרקמות בצלחת בת שש בארות עם חיץ כביסה למשך שעה, פעמיים, בטמפרטורת החדר. שמור את חלקי הרקמות במאגר שטיפה על השייקר למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
11. מעבירים את חלקי הרקמה לריאגנט ניקוי הרקמה (ראו טבלת חומרים, נפחו היה גדול פי חמישה מנפח הדגימה) ומסובבים ב-60 סל"ד על השייקר בעדינות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    הערה: לאחר טיפול זה, חלקי הרקמה מתבהרים (איור 2B).
12. הרכיבו את הרקמות המנוקות על המגלשה, הקיפו את הרקמות עם ספייסר, והדביקו את הפער עם ריאגנט לניקוי רקמות טריות וכיסויים.

3. צביעה פלואורסצנטית משולשת עם CGRP, פאלואידין ו-LYVE1 בעקבות הגישה המקובלת

הערה: לשם השוואה, אותה צביעה בוצעה על חתכי רקמה בעובי של 30 מיקרומטר בעקבות טכניקות קונבנציונליות.

1. פורסים את חלקי הרקמה ב-30 מיקרומטר על מיקרוטום בכיוון הרוחבי ומרכיבים אותם על המגלשה.
2. הוסיפו תמיסת חסימה עם סרום חמורים תקין של 3% ו-0.3% Triton X-100 ב-0.1 M PB ודגמו את החלקים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
3. הסר את תמיסת החסימה ודגדג את החלקים עם התמיסה המכילה את הנוגדנים העיקריים של אנטי-CGRP חד-שבטי של עכבר (1:500) ונוגדן פוליקלונלי נגד LYVE1 של כבשים (1:500) במאגר דילול לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
4. למחרת, שטפו את חלקי הרקמות עם 0.1 M PB (pH 7.4) שלוש פעמים, הוסיפו את התמיסה המעורבת המכילה את הנוגדנים המשניים של חמור נגד עכבר IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) וחמור נגד כבשים IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), כמו גם Alexa-Flour594 phalloidin (1:1000) על החלקים ודגירה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
5. לפני תצפית מיקרוסקופית, שטפו את החלקים ב-0.1 M PB (pH 7.4) שלוש פעמים, ואז כסו אותם בכיסויים ב-50% גליצרין.

4. הדמיה וניתוחים

1. שימו לב לדגימות המוכתמות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ולאחר מכן צלמו את התמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.
2. צלם 30 תמונות (Z-stacks), כל אחת במסגרות של 10 מיקרומטר, מכל מקטע בעובי 300 מיקרומטר ושלב תמונה אחת ממוקדת באמצעות מעבד תמונה של מערכת המיקרוסקופיה הקונפוקלית (ראו טבלת חומרים).
   1. בצע את השלבים הבאים בתוכנת עיבוד התמונה של ההגדרה הקונפוקלית לניתוח תלת-ממדי (תלת-ממדי): הגדר מישור מוקד התחלה | הגדרת מישור מוקד קצה | הגדרת גודל שלב | בחר תבנית עומק | לכידת תמונה | סדרת Z.
      הערה: אורכי הגל של העירור והפליטה של אותות פלואורסצנטיים כחולים היו 401 ננומטר ו-421 ננומטר, בהתאמה. אורכי הגל של עירור ופליטה של אותות פלואורסצנטיים ירוקים היו 499 ננומטר ו-519 ננומטר, בהתאמה. אורכי גל עירור ופליטה של אותות פלואורסצנטיים אדומים היו 591 ננומטר ו-618 ננומטר, בהתאמה. 152 μm הוא קוטר חור הסיכה הקונפוקלי (עדשה אובייקטיבית פי 10, NA: 0.4). רזולוציית לכידת התמונה הייתה 1024 × 1024 פיקסלים.
3. עבור הדגימות הקונבנציונליות (שלב 3), צלם 30 תמונות (Z-stacks) במסגרות של 1 מיקרומטר מכל מקטע בעובי 30 מיקרומטר והתייחס עוד יותר לתמונות אלה כאמור לעיל (שלבים 4.1-4.2).
4. הדגימו את התמונות בתבנית של שחזור תלת-ממדי באמצעות מערכת עיבוד התמונה.
5. בצע שחזורים תלת-ממדיים על-ידי ייבוא תמונות קונפוקליות של Z-stack לתוך Imaris 9.0 (תוכנת הדמיית תאים, ראה טבלת חומרים) וצור עיבודי משטח המבוססים על עוצמות כתמים: הוסף משטחים חדשים | בחר את ערוץ המקור | קביעת הפרמטרים באפשרות החלקה של Surfaces Detail | קביעת הפרמטרים באפשרות הסף של עוצמה מוחלטת | סיווג משטחים | סיום.
6. קבל נתונים בשטח הפנים של סיבי עצב חיוביים באמצעות תוכנת הדמיית התאים. בחר את התמונה המעובדת | סטטיסטיקה | | מפורט ערכים ספציפיים | נפח.

תוצאות

לאחר צביעה פלואורסצנטית משולשת, סיבי העצב, כלי הדם וכלי הלימפה סומנו בבירור עם CGRP, פאלואידין ו-LYVE1, בהתאמה, בעור השעיר והזוהר (איור 3,4). עם הטיפול המנקה, סיבי העצב החיוביים ל-CGRP, כלי הדם החיוביים לפאלואידין וכלי הלימפה החיוביים ל-LYVE1 ניתנים לדמיון בעומק רב יותר כדי לקב...

Discussion

המחקר הנוכחי מספק הדגמה מפורטת של סיבי העצב העוריים בעור השעיר והזוהר על ידי שימוש באימונופלואורסצנציה על חלקי רקמות עבים יותר עם טיפול ניקוי ותצוגה תלת-ממדית כדי להבין טוב יותר את העצבנות של העור. זמן הדגירה של הנוגדנים של עד 1-2 ימים ותהליך ניקוי לילה חשובים. שני שלבים מרכזיים אלה משפיעים...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x phosphate-buffered saline	Solarbio Life Sciences	P1020	pH 7.2-7.4, 0.01 Mol
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma Life Science	T48402-5G
Confocal fluorescence microscopy	Olympus Corporation	Fluoview FV1200
Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488	Abcam plc.	ab150105
Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405	Abcam plc.	ab175676
EP tube	Wuxi NEST Biotechnology Co.	615001	1.5 mL
Freezing stage sliding microtome system	Leica Biosystems	CM1860
Imaris Software	Oxford Instruments	v.9.0.1
IRIS standard scissor	WPI (World Precision Instruments Inc.)	503242
iSpacer	SunJin Lab co.	IS005
Micro forceps-Str	RWD	F11020-11
Mouse monoclonal anti-CGRP antibody	Santa cruz biotechnology, Inc.	sc-57053
Neutral buffered Formalin	Solarbio Life Sciences	G2161	10%
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-12	10 mL
Peristaltic pump	Longer Precision Pump Co., Ltd	BT300-2J
Phalloidin Alexa-Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A12381
RapiClear 1.52 solution	SunJin Lab co.	RC152001	10 mL
Regular agarose	Gene Company Limited	G-10
SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str	RWD	F13038-12
Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody	R&D Systems, Inc.	AF7939
Six-well plate	Corning Incorporated	3335
Sodium azide	Sigma Life Science	S2002	25 g
Sucrose	Sigma Life Science	V900116	500 g
Super Glue	Henkel AG & Co.	Pattex 502
Surgical Handles	RWD	S32003-12
Triton X-100	Solarbio Life Sciences	9002-93-1	100 mL
Urethane	Sigma Life Science	U2500	500 g
VANNAS spring scissors	RWD	S1014-12
Vibratory microtome	Leica Biosystems	VT1200S