Dimostrazione dell'innervazione della pelle pelosa e glabra in un modello 3D utilizzando più approcci fluorescenti di colorazione e pulizia dei tessuti

Riepilogo

Lo spessore delle sezioni tissutali limitava lo studio morfologico dell'innervazione cutanea. Il presente protocollo descrive una tecnica unica di pulizia dei tessuti per visualizzare le fibre nervose cutanee in sezioni di tessuto spesse 300 μm sotto microscopia confocale.

Abstract

L'innervazione della pelle è una parte importante del sistema nervoso periferico. Sebbene lo studio delle fibre nervose cutanee sia progredito rapidamente, la maggior parte della comprensione delle loro caratteristiche distributive e chimiche proviene dalla colorazione istochimica e immunoistochimica convenzionale su sezioni di tessuto sottile. Con lo sviluppo della tecnica di pulizia dei tessuti, è diventato possibile visualizzare le fibre nervose cutanee su sezioni di tessuto più spesse. Il presente protocollo descrive la colorazione fluorescente multipla su sezioni tissutali ad uno spessore di 300 μm dalla pelle plantare e dorsale del ratto posteriore, i due tipici siti cutanei pelosi e glabri. Qui, il peptide correlato al gene della calcitonina etichetta le fibre nervose sensoriali, mentre la falloidina e il recettore ialuronico endoteliale dei vasi linfatici 1 etichettano rispettivamente i vasi sanguigni e linfatici. Sotto un microscopio confocale, le fibre nervose sensoriali etichettate sono state seguite completamente a una distanza più lunga, correndo in fasci nello strato cutaneo profondo e freestyle nello strato superficiale. Queste fibre nervose correvano in parallelo o circondavano i vasi sanguigni e i vasi linfatici formavano una rete tridimensionale (3D) nella pelle pelosa e glabra. L'attuale protocollo fornisce un approccio più efficace allo studio dell'innervazione cutanea rispetto ai metodi convenzionali esistenti dal punto di vista metodologico.

Introduzione

La pelle, l'organo più grande del corpo, che funge da interfaccia chiave per l'ambiente, è densamente innervata da molte fibre nervose ^1,2,3. Sebbene l'innervazione cutanea sia stata ampiamente studiata in precedenza con vari metodi istologici, come la colorazione su sezioni di pelle e tessuto intero ^4,5,6, la dimostrazione efficace dettagliata delle fibre nervose cutanee è ancora una sfida ^7,8. Detto questo, il presente protocollo ha sviluppato una tecnica unica per esporre le fibre nervose cutanee più chiaramente nella sezione del tessuto spesso.

A causa del limite per lo spessore delle sezioni, l'osservazione delle fibre nervose della pelle innervata non è abbastanza precisa da rappresentare con precisione la relazione tra le fibre nervose del peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP) e i tessuti e gli organi locali dalle informazioni acquisite sull'immagine. L'emergere della tecnologia di compensazione dei tessuti 3D fornisce un metodo fattibile per risolvere questo problema ^9,10. Il rapido sviluppo di approcci di compensazione dei tessuti ha offerto molti strumenti per studiare le strutture tissutali, interi organi, proiezioni neuronali e interi animali negli ultimi tempi¹¹. Il tessuto cutaneo trasparente potrebbe essere ripreso in una sezione molto più spessa al microscopio confocale per ottenere i dati per visualizzare le fibre nervose cutanee.

Nel presente studio, la pelle plantare e dorsale di un ratto posteriore è stata selezionata come i due siti bersaglio della pelle pelosa e glabra ^3,4,7. Per tracciare le fibre nervose cutanee a una distanza maggiore, il tessuto cutaneo è stato tagliato allo spessore di 300 μm per la colorazione immunoistochimica e istochimica, seguita da un trattamento di pulizia dei tessuti. CGRP è stato utilizzato per etichettare le fibre nervose sensoriali^12,13. Inoltre, per evidenziare le fibre nervose cutanee sullo sfondo del tessuto, la falloidina e il recettore ialuronico endoteliale dei vasi linfatici 1 (LYVE1) sono stati ulteriormente utilizzati per etichettare i vasi sanguigni e i vasi linfatici, rispettivamente^14,15.

Questi approcci hanno fornito un metodo semplice che può essere applicato per dimostrare una visione ad alta risoluzione delle fibre nervose cutanee e anche per visualizzare la correlazione spaziale tra le fibre nervose, i vasi sanguigni e i vasi linfatici della pelle, che può fornire molte più informazioni per comprendere l'omeostasi della pelle normale e l'alterazione cutanea nelle condizioni patologiche.

Protocollo

Il presente studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Istituto di Agopuntura e Moxibustione, China Academy of Chinese Medical Sciences (numero di riferimento D2018-04-13-1). Tutte le procedure sono state condotte seguendo la National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). In questo studio sono stati utilizzati tre ratti maschi adulti (Sprague-Dawley, peso 230 ± 15 g). Tutti gli animali sono stati ospitati in un ciclo luce/buio di 12 ore con temperatura e umidità controllate e hanno consentito l'accesso gratuito a cibo e acqua.

1. Perfusione e preparazione del campione

1. Iniettare 250 mg/kg di soluzione di tribromoetanolo (vedere Tabella dei materiali) per via intraperitoneale nel ratto per indurre l'eutanasia.
2. Una volta che la respirazione si ferma, utilizzare forbici chirurgiche in acciaio inossidabile per aprire la cavità toracica del ratto. Utilizzare aghi da 20 G per perfusare attraverso il ventricolo cardiaco sinistro¹³ ad una velocità di 3 ml/min con 100 mL di soluzione salina normale allo 0,9% seguita da 250-300 mL di paraformaldeide al 4% in tampone fosfato da 0,1 M (PB, pH 7,4) (Figura 1A,B).
3. Dopo la perfusione, utilizzare un bisturi per rimuovere la pelle del dorso e la suola dalla zampa posteriore.
   1. Per i campioni che richiedono una sezione congelata, post-fissare i tessuti in paraformaldeide al 4% in 0,1 M PB per 2 ore; quindi crioproteggere i tessuti in saccarosio al 25% in 0,1 M PB per più di 24 ore a 4 °C
   2. Per i campioni con la sezione spessa che richiede la pulizia dei tessuti, post-fissare i tessuti in paraformaldeide al 4% in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS) per 2 ore; quindi crioproteggere i tessuti in 1x PBS a 4 °C (Figura 1C-E).

2. Tripla colorazione fluorescente con CGRP, falloidina e LYVE1 seguita da trattamento di pulizia dei tessuti

NOTA: Tripla colorazione fluorescente con CGRP, falloidina e LYVE1 è stata applicata per rivelare le fibre nervose, i vasi sanguigni e i vasi linfatici nella pelle pelosa e glabra su sezioni di tessuto con uno spessore di 300 μm dopo il trattamento di pulizia dei tessuti.

1. Preparare il 2% di agarosio in 1x PBS riscaldando in un microfornio per 2 minuti fino a quando l'agarosio si dissolve (vedi Tabella dei materiali).
2. Dopo il lavaggio, incorporare i tessuti cutanei in agarosio al 2% a 37 °C e posizionarli all'interno della ghiacciaia per il raffreddamento (Figura 1F,G).
3. Fissare il tessuto montato sul microtomo vibrante con l'acqua ghiacciata e affettarlo ad uno spessore di 500 μm in direzione trasversale. Utilizzare i seguenti parametri per impostare l'affettatrice a vibrazione e terminare l'affettamento: velocità, 0,50 mm/s e ampiezza, 1,5 mm (Figura 1H-K).
4. Dopo l'affettamento, rimuovere l'agarosio dalle sezioni e conservarle in una piastra a sei pozzetti con 1x PBS (pH 7,4) (Figura 1L).
5. Incubare le sezioni di tessuto in una soluzione di Triton X-100 al 2% in 1x PBS (TriX-PB) durante la notte a 4 °C. Vedere la Figura 2 per la procedura seguente.
6. Posizionare le sezioni di tessuto nel tampone di blocco e ruotare a 72 giri/min sullo shaker durante la notte a 4 °C.
   NOTA: La composizione del tampone di blocco è il 10% di siero d'asino normale, l'1% di Triton-X 100 e lo 0,2% di azide di sodio in 1x PBS (vedere Tabella dei materiali).
7. Trasferire le sezioni di tessuto nella soluzione contenente gli anticorpi primari dell'anticorpo monoclonale di topo anti-CGRP (1:500) e dell'anticorpo policlonale anti-LYVE1 di pecora (1:500) nel tampone di diluizione nel tubo del microcentrifuga (vedere Tabella dei materiali) e ruotare sullo shaker per 2 giorni a 4 °C.
   NOTA: La composizione del tampone di diluizione è 1% di siero d'asino normale, 0,2% Triton-X 100 e 0,2% di azide di sodio in 1x PBS.
8. Lavare le sezioni di tessuto due volte con tampone di lavaggio a temperatura ambiente, quindi tenerle sullo shaker per una notte a 4 °C nel tampone di lavaggio.
   NOTA: La composizione del tampone di lavaggio è 0,2% Triton-X 100 in 0,1 M PB (pH 7,4).
9. Il giorno successivo, trasferire le sezioni di tessuto nella soluzione mista contenente gli anticorpi secondari di asino anti-topo IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) e asino anti-pecora IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), così come Alexa-Flour594 falloidina (1:1000) (vedi Tabella dei materiali) in un tubo microcentrifuga e ruotare a 72 giri / min sullo shaker per 5 ore a 4 ° C.
10. Lavare le sezioni di tessuto in una piastra a sei pozzetti con tampone di lavaggio per 1 ora, due volte, a temperatura ambiente. Tenere le sezioni di tessuto nel tampone di lavaggio sullo shaker per una notte a 4 °C.
11. Trasferire le sezioni di tessuto nel reagente di compensazione dei tessuti (vedere Tabella dei materiali, il suo volume era cinque volte superiore al volume del campione) e ruotare delicatamente a 60 giri / min sullo shaker per 1 ora a temperatura ambiente.
    NOTA: Dopo questo trattamento, le sezioni tissutali diventano chiare (Figura 2B).
12. Montare i tessuti eliminati sul vetrino, circondare i tessuti con un distanziatore e incollare lo spazio con il reagente di pulizia dei tessuti freschi e il coverslip.

3. Tripla colorazione fluorescente con CGRP, falloidina e LYVE1 seguendo l'approccio convenzionale

NOTA: A titolo di confronto, la stessa colorazione è stata eseguita su sezioni di tessuto ad uno spessore di 30 μm seguendo tecniche convenzionali.

1. Affettare le sezioni di tessuto a 30 μm su un microtomo in direzione trasversale e montarle sul vetrino.
2. Aggiungere la soluzione bloccante con siero d'asino normale al 3% e Triton X-100 allo 0,3% in 0,1 M PB e incubare le sezioni per 30 minuti a temperatura ambiente.
3. Rimuovere la soluzione bloccante e incubare le sezioni con la soluzione contenente gli anticorpi primari del monoclonale di topo anti-CGRP (1:500) e dell'anticorpo policlonale anti-LYVE1 di pecora (1:500) in tampone di diluizione durante la notte a 4 °C.
4. Il giorno successivo, lavare le sezioni di tessuto con 0,1 M PB (pH 7,4) tre volte, aggiungere la soluzione mista contenente gli anticorpi secondari di asino anti-topo IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) e asino anti-pecora IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), così come Alexa-Flour594 falloidina (1:1000) sulle sezioni e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
5. Prima dell'osservazione microscopica, lavare le sezioni in 0,1 M PB (pH 7,4) tre volte, quindi coprirle con coperture in glicerina al 50%.

4. Imaging e analisi

1. Osservare i campioni macchiati al microscopio fluorescente e quindi scattare le immagini utilizzando un microscopio confocale.
2. Cattura 30 immagini (Z-stack), ciascuna in fotogrammi da 10 μm, da ogni sezione di 300 μm di spessore e integra una singola immagine a fuoco utilizzando un processore di immagini del sistema di microscopia confocale (vedi Tabella dei materiali).
   1. Eseguire i seguenti passaggi nel software di elaborazione delle immagini della configurazione confocale per l'analisi tridimensionale (3D): Impostare il piano focale iniziale | Impostare il piano focale finale | Impostare la dimensione del passo | Selezionate la | della serie di profondità | di acquisizione immagini Serie Z.
      NOTA: Le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione dei segnali di fluorescenza blu erano rispettivamente di 401 nm e 421 nm. Le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione dei segnali di fluorescenza verde erano rispettivamente di 499 nm e 519 nm. Le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione dei segnali di fluorescenza rossa erano rispettivamente di 591 nm e 618 nm. 152 μm è il diametro del foro stenopeico confocale (lente obiettivo 10x, NA: 0,4). La risoluzione di acquisizione dell'immagine era di 1024 × 1024 pixel.
3. Per i campioni convenzionali (fase 3), acquisire 30 immagini (Z-stacks) in fotogrammi da 1 μm da ogni sezione spessa 30 μm e trattare ulteriormente queste immagini come menzionato sopra (passaggi 4.1-4.2).
4. Dimostrare le immagini nel modello di ricostruzione 3D con il sistema di elaborazione delle immagini.
5. Eseguire ricostruzioni 3D importando immagini confocali Z-stack in Imaris 9.0 (software di imaging cellulare, vedere Tabella dei materiali) e creare rendering di superfici in base alle intensità delle macchie: Aggiungere nuove superfici | Scegli canale sorgente | Determinate i parametri nell'opzione Liscia (Smooth) di Dettaglio superfici (Surfaces Detail) | Determinare i parametri nell'opzione di soglia di Intensità assoluta | Classificazione delle superfici | Fine.
6. Acquisisci dati nella superficie delle fibre nervose positive con il software di imaging cellulare. Selezionare l'immagine sottoposta a rendering | Statistiche | | dettagliato Valori specifici | Volume.

Risultati

Dopo una tripla colorazione fluorescente, le fibre nervose, i vasi sanguigni e i vasi linfatici sono stati chiaramente etichettati con CGRP, falloidina e LYVE1, rispettivamente, nella pelle pelosa e glabra (Figura 3,4). Con il trattamento di compensazione, le fibre nervose CGRP-positive, i vasi sanguigni phalloidin-positivi e i vasi linfatici LYVE1-positivi possono essere ripresi a una profondità maggiore per acquisire le informazioni strutturali complete della pelle (

Discussione

Il presente studio fornisce una dimostrazione dettagliata delle fibre nervose cutanee nella pelle pelosa e glabra utilizzando l'immunofluorescenza su sezioni di tessuto più spesse con trattamento di compensazione e una vista 3D per comprendere meglio l'innervazione della pelle. Il tempo di incubazione degli anticorpi fino a 1-2 giorni e un processo di pulizia notturno sono importanti. Questi due passaggi chiave influenzano direttamente l'effetto di colorazione dell'immunofluorescenza delle sezioni spesse. Un ulteriore p...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x phosphate-buffered saline	Solarbio Life Sciences	P1020	pH 7.2-7.4, 0.01 Mol
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma Life Science	T48402-5G
Confocal fluorescence microscopy	Olympus Corporation	Fluoview FV1200
Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488	Abcam plc.	ab150105
Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405	Abcam plc.	ab175676
EP tube	Wuxi NEST Biotechnology Co.	615001	1.5 mL
Freezing stage sliding microtome system	Leica Biosystems	CM1860
Imaris Software	Oxford Instruments	v.9.0.1
IRIS standard scissor	WPI (World Precision Instruments Inc.)	503242
iSpacer	SunJin Lab co.	IS005
Micro forceps-Str	RWD	F11020-11
Mouse monoclonal anti-CGRP antibody	Santa cruz biotechnology, Inc.	sc-57053
Neutral buffered Formalin	Solarbio Life Sciences	G2161	10%
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-12	10 mL
Peristaltic pump	Longer Precision Pump Co., Ltd	BT300-2J
Phalloidin Alexa-Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A12381
RapiClear 1.52 solution	SunJin Lab co.	RC152001	10 mL
Regular agarose	Gene Company Limited	G-10
SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str	RWD	F13038-12
Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody	R&D Systems, Inc.	AF7939
Six-well plate	Corning Incorporated	3335
Sodium azide	Sigma Life Science	S2002	25 g
Sucrose	Sigma Life Science	V900116	500 g
Super Glue	Henkel AG & Co.	Pattex 502
Surgical Handles	RWD	S32003-12
Triton X-100	Solarbio Life Sciences	9002-93-1	100 mL
Urethane	Sigma Life Science	U2500	500 g
VANNAS spring scissors	RWD	S1014-12
Vibratory microtome	Leica Biosystems	VT1200S