Demonstrando a inervação da pele cabeluda e glabrous em um padrão 3D usando múltiplas abordagens de coloração fluorescente e limpeza de tecidos

Resumo

A espessura das seções teciduais limitou o estudo morfológico da inervação da pele. O presente protocolo descreve uma técnica única de limpeza tecidual para visualizar fibras nervosas cutâneas em seções de tecido espessas de 300 μm sob microscopia confocal.

Resumo

A inervação da pele é uma parte importante do sistema nervoso periférico. Embora o estudo das fibras nervosas cutâneas tenha progredido rapidamente, a maior parte da compreensão de suas características distribucionais e químicas vem da coloração histoquímica e imunohistoquímica convencional em seções de tecidos finos. Com o desenvolvimento da técnica de limpeza tecidual, tornou-se possível ver as fibras nervosas cutâneas em seções de tecido mais grossas. O presente protocolo descreve múltiplas manchas fluorescentes em seções de tecido a uma espessura de 300 μm da pele plantar e dorsal do pé traseiro de rato, os dois típicos locais de pele peludo e glabrous. Aqui, o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina rotula as fibras nervosas sensoriais, enquanto a falo e o receptor endotelial do vaso endotelial 1 rotulam o sangue e os vasos linfáticos, respectivamente. Sob um microscópio confocal, as fibras nervosas sensoriais rotuladas foram seguidas completamente a uma distância mais longa, correndo em feixes na camada cutânea profunda e estilo livre na camada superficial. Essas fibras nervosas corriam paralelamente ou cercavam os vasos sanguíneos, e os vasos linfáticos formavam uma rede tridimensional (3D) na pele pelirpelenta e glabrous. O protocolo atual fornece uma abordagem mais eficaz para estudar a inervação da pele do que os métodos convencionais existentes do ponto de vista da metodologia.

Introdução

A pele, o maior órgão do corpo, servindo como uma interface chave para o ambiente, é densamente inervada por muitas fibras nervosas ^1,2,3. Embora a inervação da pele tenha sido amplamente estudada anteriormente com vários métodos histológicos, como a coloração em seções de pele e tecido de^{montagem total 4,5,6}, a demonstração detalhada e eficaz de fibras nervosas cutâneas ainda é um desafio ^7,8. Diante disso, o presente protocolo desenvolveu uma técnica única para exibir fibras nervosas cutâneas mais claramente na seção de tecido grosso.

Devido ao limite pela espessura das seções, a observação de fibras nervosas da pele inervadas não é precisa o suficiente para descrever com precisão a relação entre as fibras nervosas relacionadas ao gene da calcitonina (CGRP) e tecidos e órgãos locais a partir das informações de imagem adquiridas. O surgimento da tecnologia de limpeza de tecidos 3D fornece um método viável para resolver esse problema ^9,10. O rápido desenvolvimento de abordagens de limpeza de tecidos tem oferecido muitas ferramentas para estudar estruturas teciduais, órgãos inteiros, projeções neuronais e animais inteiros nos últimos^{tempos 11}. O tecido da pele transparente pode ser imageado em uma seção muito mais espessa por microscopia confocal para obter os dados para visualizar fibras nervosas cutâneas.

No presente estudo, a pele plantar e dorsal de um pé traseiro de rato foi selecionada como os dois locais alvo de pele^pelrosa e glabrous ^3,4,7. Para traçar as fibras nervosas cutâneas a uma distância maior, o tecido da pele foi cortado na espessura de 300 μm para coloração imunohistoquímica e histoquímica, seguido de tratamento de limpeza tecidual. O CGRP foi usado para rotular as fibras sensoriais do nervo^12,13. Além disso, para destacar as fibras nervosas cutâneas no fundo tecidual, a faloidina e o receptor de hialuronan do vaso linfático 1 (LYVE1) foram ainda utilizados para rotular os vasos sanguíneos e os vasos linfáticos, respectivamente^14,15.

Essas abordagens forneceram um método simples que pode ser aplicado para demonstrar uma visão de alta resolução das fibras nervosas cutâneas e também para visualizar a correlação espacial entre as fibras nervosas, vasos sanguíneos e vasos linfáticos na pele, o que pode fornecer muito mais informações para entender a homeostase da pele normal e a alteração cutânea sob as condições patológicas.

Protocolo

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto de Acupuntura e Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (número de referência D2018-04-13-1). Todos os procedimentos foram realizados seguindo o Guia Nacional de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Neste estudo foram utilizados três ratos adultos (Sprague-Dawley, peso 230 ± 15 g). Todos os animais foram alojados em um ciclo claro/escuro de 12h com temperatura e umidade controladas e permitiram acesso livre a alimentos e água.

1. Perfusão e preparação da amostra

1. Injete 250 mg/kg de solução de tribromoetanol (ver Tabela de Materiais) intraperitonealmente no rato para induzir eutanásia.
2. Uma vez que a respiração pare, use tesoura cirúrgica de aço inoxidável para abrir a cavidade torácica do rato. Use agulhas de 20 G para perfuse através do ventrículo cardíaco esquerdo¹³ a uma taxa de 3 mL/min com 100 mL de soro fisiológico normal de 0,9%, seguido por 250-300 mL de 4% paraformaldeído em 0,1 M tampão fosfato (PB, pH 7.4) (Figura 1A,B).
3. Após a perfusão, use um bisturi para remover a pele do dorso e sola da pata traseira.
   1. Para as amostras que requerem seção congelada, pós-fixar os tecidos em 4% de paraformaldeído em 0,1 M PB por 2h; em seguida, crioprotetor os tecidos em 25% de sacarose em 0,1 M PB por mais de 24 h a 4 °C
   2. Para as amostras com a seção grossa que requer limpeza tecidual, pós-fixar os tecidos em 4% de paraformaldeído em 1x salina tamponada com fosfato (1x PBS) por 2 h; em seguida, crioproteta os tecidos em 1x PBS a 4 °C (Figura 1C-E).

2. Coloração fluorescente tripla com CGRP, faloidina e LYVE1 seguida de tratamento de limpeza tecidual

NOTA: A coloração fluorescente tripla com CGRP, faloidina e LYVE1 foi aplicada para revelar as fibras nervosas, vasos sanguíneos e vasos linfáticos na pele pelireira e glabrous em seções de tecido com espessura de 300 μm após o tratamento de limpeza tecidual.

1. Prepare 2% de agarose em 1x PBS aquecendo em um micro forno por 2 min até que a agarose se dissolva (ver Tabela de Materiais).
2. Após a lavagem, incorpore os tecidos da pele em 2% agarose a 37 °C, e coloque-os dentro da geladeira para resfriamento (Figura 1F,G).
3. Fixar o tecido montado no microtome vibratório com a água gelada e cortá-los a uma espessura de 500 μm na direção transversal. Use os seguintes parâmetros para definir o cortador de vibração e o corte de acabamento: velocidade, 0,50 mm/s e amplitude, 1,5 mm (Figura 1H-K).
4. Após o corte, retire a agarose das seções e armazene-as em uma placa de seis poços com 1x PBS (pH 7.4) (Figura 1L).
5. Incubar as seções teciduais em uma solução de 2% Triton X-100 em 1x PBS (TriX-PB) durante a noite a 4 °C. Consulte a Figura 2 para o seguinte procedimento.
6. Coloque as seções teciduais no tampão de bloqueio e gire a 72 rpm no agitador durante a noite a 4 °C.
   NOTA: A composição do tampão de bloqueio é 10% de soro de burro normal, 1% Triton-X 100 e 0,2% de azida de sódio em 1x PBS (ver Tabela de Materiais).
7. Transfira as seções teciduais para a solução contendo os anticorpos primários do anti-CGRP monoclonal do rato (1:500) e do anticorpo anti-LYVE1 de ovelhas (1:500) em tampão de diluição no tubo de microcentrifusagem (ver Tabela de Materiais), e gire no agitador por 2 dias a 4 °C.
   NOTA: A composição do tampão de diluição é 1% de soro de burro normal, 0,2% Triton-X 100 e 0,2% de azida de sódio em 1x PBS.
8. Lave as seções de tecido duas vezes com tampão de lavagem à temperatura ambiente e, em seguida, mantenha-as no shaker durante a noite a 4 °C no tampão de lavagem.
   NOTA: A composição do tampão de lavagem é de 0,2% Triton-X 100 em 0,1 M PB (pH 7.4).
9. No dia seguinte, transfira as seções de tecido para a solução mista contendo os anticorpos secundários do anti-rato de burro IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) e anti-ovelhas de burro IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), assim como a faloidina Alexa-Flour594 (1:1000) (ver Tabela de Materiais) em um tubo de microcentrifusagem e gire a 72 rpm no shaker por 5h a 4 °C.
10. Lave as seções de tecido em uma placa de seis poços com tampão de lavagem por 1h, duas vezes, à temperatura ambiente. Mantenha as seções teciduais na lavagem do tampão durante a noite a 4 °C.
11. Transfira as seções teciduais para o reagente de limpeza tecidual (ver Tabela de Materiais, seu volume foi cinco vezes maior que o volume da amostra) e gire a 60 rpm no shaker suavemente por 1h à temperatura ambiente.
    NOTA: Após este tratamento, as seções teciduais ficam claras (Figura 2B).
12. Monte os tecidos limpos na lâmina, circule os tecidos com um espaçador, e coloque a lacuna com reagente de limpeza de tecido fresco e deslizamento de cobertura.

3. Coloração fluorescente tripla com CGRP, faloidina e LYVE1 seguindo a abordagem convencional

NOTA: Como comparação, a mesma coloração foi realizada em seções de tecido a uma espessura de 30 μm seguindo técnicas convencionais.

1. Corte as seções teciduais a 30 μm em um microtome na direção transversal e monte-as no slide.
2. Adicione a solução de bloqueio com soro de burro 3% normal e 0,3% Triton X-100 em 0,1 M PB e incubar as seções por 30 minutos à temperatura ambiente.
3. Remova a solução de bloqueio e incuba as seções com a solução contendo os anticorpos primários do anti-CGRP monoclonal do rato (1:500) e do anticorpo anti-LYVE1 policlonal de ovelhas (1:500) no tampão de diluição durante a noite a 4 °C.
4. No dia seguinte, lave as seções teciduais com 0,1 M PB (pH 7.4) três vezes, adicione a solução mista contendo os anticorpos secundários do anti-rato de burro IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) e do anti-ovelha de burro IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), bem como a faloidina Alexa-Flour594 (1:1000) nas seções e incubar por 1 h em temperatura ambiente.
5. Antes da observação microscópica, lave as seções em 0,1 M PB (pH 7.4) três vezes e cubra-as com deslizamentos em 50% de glicerina.

4. Imagens e análises

1. Observe as amostras manchadas sob um microscópio fluorescente e, em seguida, pegue as imagens usando um microscópio confocal.
2. Capture 30 imagens (Z-stacks), cada uma em quadros de 10 μm, de cada seção de 300 μm de espessura e integre uma única imagem em foco usando um processador de imagem do sistema de microscopia confocal (ver Tabela de Materiais).
   1. Execute as seguintes etapas no software de processamento de imagem da configuração confocal para análise tridimensional (3D): Defina o Plano Focal iniciar | Set End focal plane | Definir o tamanho do passo | Escolha | padrão de profundidade | de captura de imagens Série Z.
      NOTA: Os comprimentos de onda de excitação e emissão dos sinais de fluorescência azul foram de 401 nm e 421 nm, respectivamente. Os comprimentos de onda de excitação e emissão de sinais de fluorescência verde foram de 499 nm e 519 nm, respectivamente. Os comprimentos de onda de excitação e emissão de sinais de fluorescência vermelha foram de 591 nm e 618 nm, respectivamente. 152 μm é o diâmetro do pinhole confocal (lente objetiva de 10x, NA: 0,4). A resolução de captura de imagem foi de 1024 × 1024 pixels.
3. Para as amostras convencionais (etapa 3), capture 30 imagens (Z-stacks) em quadros de 1 μm de cada seção de 30 μm de espessura e trate ainda mais essas imagens como mencionado acima (etapas 4.1-4.2).
4. Demonstre as imagens no padrão de reconstrução 3D com o sistema de processamento de imagens.
5. Realize reconstruções 3D importando imagens confocal de pilha Z em Imaris 9.0 (software de imagem celular, ver Tabela de Materiais) e crie renderizações de superfície baseadas em intensidades de manchas: Adicione novas superfícies | Escolha | do Canal fonte Determine os parâmetros na opção suave de superfícies detalham | Determinar os parâmetros na opção limiar de intensidade absoluta | Classificar superfícies | Termine.
6. Adquira dados na superfície de fibras nervosas positivas com o software de imagem celular. Selecione a | de imagem renderizada | de estatísticas | detalhado Valores específicos | Volume.

Resultados

Após a coloração fluorescente tripla, as fibras nervosas, vasos sanguíneos e vasos linfáticos foram claramente rotulados com CGRP, phalloidin e LYVE1, respectivamente, na pele pelrosa e glabrou (Figura 3,4). Com o tratamento de compensação, as fibras nervosas CGRP positivas, os vasos sanguíneos fábula positivo e os vasos linfáticos LYVE1 positivos podem ser imagens em maior profundidade para adquirir as informações estruturais completas da pele (

Discussão

O presente estudo fornece uma demonstração detalhada das fibras nervosas cutâneas na pele pelrosa e glabrous usando imunofluorescência em seções de tecido mais grosso com tratamento de limpeza e uma visão 3D para entender melhor a inervação da pele. O tempo de incubação de anticorpos de até 1-2 dias e um processo de limpeza noturno são importantes. Estas duas etapas-chave afetam diretamente o efeito de coloração da imunofluorescência de seções grossas. Outro problema foi levantado a partir da escolha de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x phosphate-buffered saline	Solarbio Life Sciences	P1020	pH 7.2-7.4, 0.01 Mol
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma Life Science	T48402-5G
Confocal fluorescence microscopy	Olympus Corporation	Fluoview FV1200
Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488	Abcam plc.	ab150105
Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405	Abcam plc.	ab175676
EP tube	Wuxi NEST Biotechnology Co.	615001	1.5 mL
Freezing stage sliding microtome system	Leica Biosystems	CM1860
Imaris Software	Oxford Instruments	v.9.0.1
IRIS standard scissor	WPI (World Precision Instruments Inc.)	503242
iSpacer	SunJin Lab co.	IS005
Micro forceps-Str	RWD	F11020-11
Mouse monoclonal anti-CGRP antibody	Santa cruz biotechnology, Inc.	sc-57053
Neutral buffered Formalin	Solarbio Life Sciences	G2161	10%
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-12	10 mL
Peristaltic pump	Longer Precision Pump Co., Ltd	BT300-2J
Phalloidin Alexa-Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A12381
RapiClear 1.52 solution	SunJin Lab co.	RC152001	10 mL
Regular agarose	Gene Company Limited	G-10
SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str	RWD	F13038-12
Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody	R&D Systems, Inc.	AF7939
Six-well plate	Corning Incorporated	3335
Sodium azide	Sigma Life Science	S2002	25 g
Sucrose	Sigma Life Science	V900116	500 g
Super Glue	Henkel AG & Co.	Pattex 502
Surgical Handles	RWD	S32003-12
Triton X-100	Solarbio Life Sciences	9002-93-1	100 mL
Urethane	Sigma Life Science	U2500	500 g
VANNAS spring scissors	RWD	S1014-12
Vibratory microtome	Leica Biosystems	VT1200S