הדמיית PET/MR לא פולשנית במודל עכבר אורתוטופי של קרצינומה הפטוצלולרית

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת קסנושתרים אורתוטופיים של קרצינומה הפטוצלולרית עם ובלי קשירת עורק הכבד ומבצעים הדמיית טומוגרפיה לא פולשנית של פליטת פוזיטרונים (PET) של היפוקסיה גידולית באמצעות [18 F]Fluoromisonidazole ([18 F]FMISO) ו- [18 F]Fluorodeoxyglucose ([¹⁸F]FDG).

Abstract

מודלים ניסיוניים פרה-קליניים של קרצינומה הפטוצלולרית (HCC) המחזירים מחלות אנושיות מייצגים כלי חשוב לחקר גידולים ולהערכת גישות טיפוליות חדשניות. הדמיה לא פולשנית של כל הגוף באמצעות טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) מספקת תובנות קריטיות לגבי מאפייני in vivo של רקמות ברמה המולקולרית בזמן אמת. אנו מציגים כאן פרוטוקול ליצירת קסנוגרפט HCC אורתוטופי עם וללא קשירת עורק כבד (HAL) כדי לגרום להיפוקסיה של הגידול והערכת חילוף החומרים של הגידול שלהם in vivo באמצעות [18 F]Fluoromisonidazole ([18 F]FMISO) ו- [18 F]Fluorodeoxyglucose ([¹⁸F]FDG) PET/הדמיית תהודה מגנטית (MR). ניתן היה לדמיין היפוקסיה של הגידול בקלות באמצעות סמן ההיפוקסיה [18 F]FMISO, ונמצא כי ספיגת [18 F]FMISO הייתה גבוהה יותר בעכברי HCC שעברו HAL מאשר בקבוצה שאינה HAL, בעוד [¹⁸F]FDG לא יכול היה להבחין בהיפוקסיה גידולית בין שתי הקבוצות. גידולי HAL הראו גם רמה גבוהה יותר של ביטוי גורם היפוקסיה (HIF)-1α בתגובה להיפוקסיה. כימות גידולי HAL הראה עלייה של פי 2.3 בספיגת [¹⁸F]FMISO בהתבסס על גישת ספיגת הערך המתוקנן (SUV).

Introduction

קרצינומה הפטוצלולרית (HCC) היא הסרטן השישי המאובחן ביותר וגורם המוות השלישי בשכיחותו מסרטן ברחבי העולם, עם יותר מ -900,000 מקרים חדשים ו -800,000 מקרי מוות בשנת 2020¹. גורם הסיכון העיקרי הוא שחמת הכבד, המתרחשת כתוצאה מזיהומים ויראליים (נגיפי הפטיטיס B ו- C), שימוש לרעה באלכוהול, סוכרת וסטאטוהפטיטיס² שאינו אלכוהולי. הניהול של HCC הוא מורכב למדי, ומספר אפשרויות טיפול זמינות, כולל כריתה כירורגית, אבלציה תרמית או כימית, השתלה, כימואמבוליזציה transarterial, הקרנות, וכימותרפיה, בהתאם למחלה היערכות ^2,3. HCC הוא גידול עמיד לכימותרפיה עם הישנות המחלה בעד 70% מהחולים לאחר טיפול בכוונת ריפוי².

למרות הרמה הגבוהה של הטרוגניות הגידול, HCC קשור לשתי תוצאות נפוצות: (i) HCC הוא היפוקסי מאוד, ו (ii) היפוקסיה הגידול קשורה לאגרסיביות גדולה יותר של הגידול וכישלון הטיפול. התרבות בלתי מבוקרת של תאי HCC גורמת לקצב צריכת חמצן גבוה שקודם לכלי הדם, ובכך יוצרת מיקרו-סביבה היפוקסית. רמות חמצן תוך-גידוליות נמוכות מעוררות מגוון תגובות ביולוגיות המשפיעות על תוקפנות הגידול ועל תגובת הטיפול. גורמים המושרים להיפוקסיה (HIFs) מוכרים לעתים קרובות כווסתי התמלול החיוניים בתגובה להיפוקסיה ^2,3. לפיכך, היכולת לזהות היפוקסיה היא חיונית כדי לדמיין רקמות ניאופלסטיות ולזהות את האתרים הבלתי נגישים, אשר דורשים הליכים פולשניים. זה גם עוזר להבין טוב יותר את השינויים המולקולריים שמובילים לאגרסיביות הגידול ולשפר את תוצאות הטיפול בחולה.

הדמיה מולקולרית באמצעות טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) משמשת בדרך כלל באבחון ובימוי של סוגי סרטן רבים, כולל HCC. בפרט, השימוש המשולב של הדמיית PET נותב כפול המערב [18 F]Fluorodeoxyglucose ([¹⁸F]FDG) ו [¹¹C]אצטט יכול להגדיל באופן משמעותי את הרגישות הכוללת באבחון HCC ^4,5. הדמיה של היפוקסיה, לעומת זאת, יכולה להיות מושגת באמצעות סמן היפוקסי נפוץ [18 F]Fluoromisonidazole ([¹⁸F]FMISO). בפרקטיקה הקלינית, הערכה לא פולשנית של היפוקסיה חשובה כדי להבדיל בין סוגים שונים של גידולים ואזורים לתכנון טיפול קרינתי⁶.

הדמיה פרה-קלינית הפכה לכלי חיוני להערכה לא פולשנית ואורכית של מודלים עכבריים למחלות שונות. מודל HCC חזק וניתן לשחזור מייצג פלטפורמה חשובה למחקר פרה-קליני ותרגומי לפתופיזיולוגיה של HCC אנושי ולהערכת טיפולים חדשניים. יחד עם הדמיית PET, ניתן להבהיר התנהגויות in vivo כדי לספק תובנות חשובות ברמה המולקולרית עבור כל נקודת זמן נתונה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת קסנוגרפטים אורתוטופיים של HCC קשירת עורק כבד (HAL) וניתוח חילוף החומרים של גידולי in vivo שלהם באמצעות [18 F]FMISO ו- [¹⁸F]FDG PET/MR. השילוב של HAL יוצר מודל מתאים של עכברי HCC טרנסגניים או כימיים כדי לחקור היפוקסיה גידולית in vivo, שכן HAL יכול לחסום ביעילות את אספקת הדם העורקית כדי לגרום להיפוקסיה תוך גידולית ^7,8. בנוסף, שלא כמו צביעה אימונוהיסטוכימית ex vivo באמצעות pimonidazole, שינויים בחילוף החומרים של הגידול כתוצאה מהיפוקסיה ניתנים להדמיה קלה ולכימות מדויק באופן לא פולשני באמצעות הדמיית PET, המאפשרת הערכה אורכית של תגובת הטיפול או מדידת הופעת עמידות ^3,7,8 . השיטה שלנו המוצגת כאן מאפשרת יצירת מודל HCC היפוקסי חזק יחד עם ניטור לא פולשני של היפוקסיה גידולית באמצעות הדמיית PET/MR לחקר ביולוגיה של HCC in vivo.

Protocol

כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לוועדה לשימוש בבעלי חיים בהוראה ובמחקר (CULATR) במרכז לחקר רפואה השוואתית (CCMR) באוניברסיטת הונג קונג, תוכנית המוכרת על ידי האגודה להערכה והסמכה של טיפול בחיות מעבדה בינלאומיות (AAALAC). החיות ששימשו במחקר היו נקבות עכברים BALB/cAnN-nu (עירום) בגיל 6-8 שבועות, במשקל של 20 גרם ± 2 גרם. מזון ומים סופקו עד לליביטום.

1. הזרקה תת עורית של קווי תאי קרצינומה הפטוצלולרית האנושית

הערה: MHCC97 הוא קו תאי HCC אנושי המשמש ליצירת מודל HCC xenograft תת עורי. תאי MHCC97L מתקבלים מהמכון לסרטן הכבד, בית החולים Zhongshan של אוניברסיטת פודאן, שנחאי, הרפובליקה העממית של סין⁹ ומאומתים על ידי פרופיל חוזר טנדם קצר (STR).

1. תרבית תאי MHCC97L ושמירה בתרבית בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין וסטרפטומיצין בבקבוק תרבית תאי T-75 בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח המסופק עם 5%_CO2 (ראה טבלת חומרים). החליפו את מצע התרבית כל יומיים וקצרו את התאים במפגש של 80%-90%.
   הערה: מספר התא ההתחלתי הוא 1.5 x 10 6 תאים, והתאים נמצאים בשימוש בתוך^6-8 מעברים.
2. אחסנו את תרבית המצע ואת החומצה טריפסין-אתילאנדיאמין-טטראצטית (טריפסין-EDTA) בטמפרטורה של 4°C בחושך עד לשימוש. חממו מראש את מצע התרבית ל-37°C ואת הטריפסין-EDTA לטמפרטורת החדר לפני השימוש. עיין בטבלת החומרים עבור כל הריאגנטים והחומרים המתכלים המשמשים בסעיף זה.
3. הסר את תקשורת התרבות. יש לשטוף את שכבת התא במי מלח סטריליים חוצצים פוספט ב-10 מ"ל (DPBS, ראו טבלת חומרים).
4. הוסף 5 מ"ל של טריפסין-EDTA לבקבוק התרבית ודגר על התאים ב 37 ° C. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ הפוך בהגדלה של פי 20 (ראה טבלת חומרים) עד ששכבת התא מפוזרת ומנותקת לחלוטין מהבקבוק. ודא כי התאים אינם נשארים טריפסין-EDTA במשך יותר מ -15 דקות.
5. הוסף 5 מ"ל של מדיה תרבותית לבקבוק התרבות. שאפו את התאים על ידי פיפטינג עדין. העבירו את מתלה התא לצינור צנטריפוגה וסובבו במהירות של 1,107 x גרם למשך 5 דקות (ראו טבלת חומרים).
6. הסר את supernatant בעדינות resuspend את גלולת התא עם 1 מ"ל של PBS. פיפטה ביסודיות כדי להשיג השעיה תא אחד. קבע את מספר התא באמצעות מונה התאים האוטומטי (ראה טבלת חומרים) והכן את תרחיף התא לריכוז של 5 x 10⁶ תאים/מ"ל ב- PBS.
7. צייר 200 μL של השעיית תאים עם מחט 25 G מזרק 1 מ"ל. כל מזרק מכיל 1 x 10⁶ MHCC97L תאים (ב 200 μL). שמור את המזרק על קרח רטוב.
8. להרדים את העכבר עם הזרקה intraperitoneal (i.p.) של תערובת של קטמין (87.5 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (12.5 מ"ג / ק"ג). הקפידו על הרדמה נאותה באמצעות רפלקס צביטת הבוהן. הקפד למרוח חומר סיכה לעיניים על העכבר כדי למנוע התייבשות והיווצרות פוטנציאלית של כיבים בקרנית. הניחו את העכבר במצב שכיבה על פד סטרילי (ראו טבלת חומרים).
9. לעקר את האזור הגבי ליד האגף התחתון (צד שמאל או ימין) של העכבר עם 70% אתנול (ראה טבלה של חומרים). הרימו את העור בעזרת מלקחיים והכניסו בעדינות את המשקע של המחט מתחת לעור.
10. מקדמים את המחט 4-5 מ"מ לאורך המישור התת עורי מאתר הניקוב כדי למנוע דליפה מקרית של תרחיף התא מאתר ההזרקה עם משיכת המחט. ודא כי החדרת המחט אינה עמוקה מדי מתחת לעור, אשר עלול לגרום נזק איברים בשוגג.
11. שחררו את המלקחיים ופרקו בזהירות ובאיטיות את תכולת המזרק, תוך הקפדה שלא לחדור לצד הנגדי. משוך את המחט כדי לבדוק אם יש נפיחות בזריקה. החזירו את העכבר לכלוב כשהוא יושב על משטח חימום שחומם מראש כדי לסייע בהתאוששות מההרדמה ולהחזיר את הניידות. המשך לעקוב אחר העכבר עד שהעכבר ער לחלוטין ושומר על שכיבת עצם החזה.
12. עקוב אחר צמיחת הגידול ורווחתו של העכבר על בסיס שבועי. מדוד את נפח הגידול (V) באמצעות קליפר (ראה טבלת חומרים). חשב ורשום את נפח הגידול באמצעות הנוסחה^{הבאה 10}:
    V = (W 2× L)/²
    כאשר W הוא הרוחב ו-L הוא אורך הגידול.
13. בין 4-6 שבועות לאחר ההזרקה יש לבדוק כי מתקבל גודל משמעותי של גידול תת עורי, בין 800-1000 מ"מ³. יש לוודא כי עומס הגידול הכולל אינו עולה על 10% ממשקל הגוף.

2. השתלת כבד אורתוטופית וקשירת עורק כבד

1. הכינו את הריאגנטים והכלים הכירורגיים הבאים בארון בטיחות ביולוגי שעבר חיטוי: 10 מ"ל של תרבית בצלחת, 10% תמיסת פובידון-יוד, 70% אתנול, כלי ניתוח אוטוקלאביים, כלומר מספריים חדים, מספריים קפיציים, מלקחיים (מעוקלים דקים וקהים ישרים), מחזיק מחט, להב אזמל, תפר ניילון 6-0 ו-5-0, כרית חימום.
2. אוטוקלבו את כל כלי הניתוח וטפלו בהם רק על ספסל סטרילי. לספק את הטיפול ההולם והנחוץ לפני, תוך ואחרי הניתוח לעכברים במהלך ההליכים הכירורגיים (ראה שלבים להלן).
   1. להקלה על כאבים לפני הניתוח, יש להזריק לעכבר זריקה תת-עורית של בופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג) לפחות 30 דקות לפני תחילת ההליך הכירורגי. לטיפול וניהול לאחר הניתוח, יש להזריק לעכבר זריקה תת עורית של בופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג) למשך 3 ימים ברציפות, אחת ל-8-12 שעות. עיין בטבלת החומרים עבור כל הריאגנטים והחומרים המתכלים המשמשים בסעיף זה.
3. הרדימו את העכבר הנושא גידול תת עורי עם הזרקת I.P. של pentobarbital (330 מ"ג / ק"ג). בצע חתך על העור של אתר הגידול באמצעות להב אזמל. מוציאים את גוש הגידול התת עורי ומעבירים אותו מיד לאמצעי התרבות. בצע שלב זה במהירות האפשרית.
4. חותכים את גוש הגידול ל-1 מ"מ³ קוביות גידול קטנות בעזרת מספריים כירורגיים חדים. שמור את כל קוביות הגידול בתקשורת התרבית. הימנע משימוש באזור הליבה של גוש הגידול התת עורי.
5. מרדימים את העכבר שיעבור את ניתוח השתלת הגידול האורתוטופי הבא עם הזרקת I.P. של תערובת קטמין (87.5 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (12.5 מ"ג/ק"ג). ודא כי לפחות 30 דקות חלפו לאחר מתן buprenorphine לפני הרדמת העכבר. הקפד למרוח חומר סיכה לעיניים על העכבר כדי למנוע התייבשות והיווצרות פוטנציאלית של כיבים בקרנית.
6. הניחו את העכבר במצב שכיבה על פד סטרילי שנמצא על גבי כרית חימום שחוממה מראש. עקוב ורשום את המצב הפיזיולוגי של העכבר כל 15 דקות עד סוף ההליך הכירורגי.
7. הרחב את הגפיים של העכבר. אבטחו אותם בעזרת נייר דבק כדי למקסם את החשיפה של הבטן הגחונית ובית החזה. לעקר את כל עור הבטן של העכבר עם תמיסת 10% פובידון-יוד, ואחריו 70% אתנול. הערך את עומק ההרדמה של העכבר על ידי בדיקה שאין תגובה לצביטת הבוהן - רפלקס המשיכה של הדוושה.
8. בצע laparotomy על ידי ביצוע חתך קו אמצע כ 10 מ"מ כדי לגשת הצפק באמצעות מספריים חדים. מהדקים ומושכים את תהליך הקסיפואיד לכיוון הראש עם מלקחיים ומיישמים את החוזרים התת-קוסטליים כדי לפתוח את שדה הניתוח. יש לוודא כי בוצע חתך מתאים כדי לאפשר ראייה טובה של אתר הניתוח.
9. משכו את האונות החציוניות והשמאליות כלפי מעלה בעזרת מקלון גזה רטוב. העבר את המעיים מחוץ לבטן לצד שמאל של העכבר וכסה אותם במקלון גזה רטוב. בצע קשירת עורק כבד (HAL) על עורק הכבד המשותף (CHA), שמקורו מראש הלבלב ועד לשורשו בפדיקור הכבד, תחת מנורה מגדלת להדמיה אופטימלית.
10. משכו את האונות החציוניות והשמאליות לאחור/מטה בעזרת מקלון גזה רטוב כדי לחשוף את האונה השמאלית. בצע חתך באורך ובעומק של כ -2 מ"מ על פני האונה השמאלית עם להב אזמל סטרילי.
    הערה: ניתן גם להשתמש באונה החציונית של הכבד להשתלת גידול כדי למזער קרעים מקריים או חתכים כתוצאה מטראומה לאיברי בטן שכנים.
11. מיד להכניס קטע גידול לתוך חתך הכבד עם מלקחיים סטריליים. קברו את הגידול כך שישב היטב בכבד. יש למרוח תפר דמוי שמונה עם תפר ניילון 6-0 מעל אתר החתך כדי להבטיח השתלה תקינה של מקטע הגידול בכבד ובהמוסטאזיס. בצע פעולה זו מהר ככל האפשר כדי למנוע דימום מוגזם. בסיום, לסגור את החתך בבטן עם תפרים קטועים 5-0.
12. החזירו את העכבר לכלוב כשהוא יושב על גבי כרית חימום שחוממה מראש כדי לסייע בהתאוששות מההרדמה ולהחזיר את רפלקס הימין. המשך לעקוב ולתעד את המצב הפיזיולוגי של העכבר כל 15 דקות עד שהעכבר ער לחלוטין ושומר על שכיבת עצם החזה.
13. חזור על ההליך עד שכל העכברים עברו השתלת גידול אורתוטופית. לספק טיפול לאחר הניתוח לכל העכברים על ידי ניטור רציף של מצבם הפיזיולוגי מדי יום במשך 3 הימים הבאים לאחר הניתוח. תן buprenorphine (0.1 מ"ג / ק"ג) כל 8-12 שעות.

3. הגדרת כיולים ותהליכי עבודה של PET/MR

הערה: ההדמיה מתבצעת באמצעות מערכת PET/MR 3T פרה-קלינית (ראה טבלת חומרים).

1. השתמש 5% isoflurane (1 L / min רפואי O₂) כדי להרדים את העכבר בתא אינדוקציה. עבור כל סריקה, בזהירות להניח את העכבר מורדם על מיטת הדמיה עם חימום מתמשך; ראשית, סרוק עם MR (Scout View) כהפניה אנטומית לסריקות סטטיות [18 F]FMISO או [¹⁸F]FDG PET, ולאחר מכן הדמיית MR ייחוס אנטומי.
2. צור זרימת עבודה רציפה של דימות PET/MR בתוכנה (ראה טבלת חומרים) כדי לכלול סריקת PET סטטית, הדמיית MR משוקללת T1 (תיקון הנחתה) ומשוקללת T2 (התייחסות אנטומית), ושחזור PET יום אחד לפני הפעלת ההדמיה המתוכננת.
3. כדי לרכוש PET, בחר אפליה ברמת 400-600 keV, איזוטופ מחקר F-18, מצב צירוף מקרים 1-5 וסריקות של 20 דקות.
4. כדי לרכוש MR משוקלל T1 לכל הגוף, השתמש בהד-תלת-ממד הדרגתי עם TE = 4.3 אלפיות השנייה, TR = 16 אלפיות השנייה, שדה ראייה (FOV) = 90 מ"מ x 60 מ"מ, מספר עירורים (NEX) = 3, 28 פרוסות בעובי 0.9 מ"מ וגודל ווקסל = 0.375 מ"מ 3 x 0.375 מ"מ 3 x 0.9 מ"מ³.
5. כדי לרכוש MR משוקלל T2 לכל הגוף, השתמש בהד מהיר דו-ממדי עם TE = 71.8 אלפיות השנייה, TR = 3000 אלפיות השנייה, FOV = 90 מ"מ x 60 מ"מ, NEX = 5, 28 פרוסות בעובי 0.9 מ"מ, גודל ווקסל = 0.265 מ"מ 3 x 0.268 מ"מ 3 x 0.9 מ"מ³.
6. כדי לשחזר את PET, בחר באלגוריתם Tera-Tomo (TT3D), איטראציות = 8, תת-קבוצות = 6, מצב צירוף מקרים 1-3, ועם תיקוני דעיכה, זמן מת, אקראי, הנחתה ופיזור כדי ליצור תמונות בגודל ווקסל כולל של 0.3 מ"מ³.
7. בצעו בדיקת פעילות PET לפני תחילת הניסוי כדי לבדוק את דיוק כימות ה-PET¹¹.
   1. מלא מזרק 5 מ"ל עם 5-8 MBq [¹⁸F]FMISO מדולל במים או מלוחים לפי המלצת היצרן. השתמש בכיול מינון כדי להקליט את פעילות המזרק (ראה טבלת חומרים). שימו לב לזמן המדידה.
   2. צייר נפח של עניין (VOI) על התמונה המשוחזרת כדי לכסות את כל המזרק. השווה את הפעילות המשוחזרת מהתמונה לערך המתקבל מכייל המינון. המשך עם מחקרי הדמיה כאשר הפעילות המשוחזרת מדויקת בתוך ±5%.

4. [18 F]FMISO ו-[¹⁸F]הזרקת FDG

1. קבל מינון קליני של [¹⁸F]FMISO מהספק 30 דקות לפני תחילת מחקרי ההדמיה. יש ללבוש את ציוד המגן האישי המתאים (PPE), כגון מעיל מעבדה, כפפות, משקפיים מעל, תג סרט וטבעת דוזימטרים בעת טיפול בחומרים רדיואקטיביים. החליפו כפפות לעתים קרובות כדי למנוע זיהום צולב של החומרים הרדיואקטיביים.
2. מקם את תמיסות המלאי הרדיואקטיבי במיכל אחסון העופרת מאחורי מגן שולחן בלוק L. מוציאים אליציטוט של [¹⁸F]FMISO ומדללים במי מלח מעוקרים. ודא כי ריכוז הפעילות הכולל הוא 18-20 MBq ב 100 μL.
3. צייר את [¹⁸F]FMISO עם מזרק 1 מ"ל עם מחט (ראה טבלת חומרים). רשום את הרדיואקטיביות והזמן המוצגים בכיול המינון.
4. רשום את משקל העכבר לפני ההזרקה של radiotracer. השתמש באיזופלורן 5% (1 ליטר / דקה רפואי O₂) כדי להרדים את העכבר, ולאחר מכן הזריק בזהירות את המוכן [¹⁸F]FMISO דרך וריד הזנב. רשום את זמן ההזרקה ואת פעילות השאריות של המזרק כדי לקחת בחשבון תיקון ריקבון. החזירו את העכבר לכלוב למשך 180 דקות כדי לאפשר ספיגת FMISO [¹⁸F]FMISO לפני סריקת PET. אפשר לעכבר להתאושש במשך יום אחד לאחר [¹⁸F]FMISO PET.
   הערה: למרות הפרופילים הפרמקוקינטיים השונים מאוד in vivo עבור [18 F]FMISO ו- [18 F]FDG, שני נותבי הרדיו מסומנים ברדיו עם F-18, שהוא רדיונוקליד PET עם זמן מחצית חיים של ^109.77דקות (< 2 שעות). מכיוון שאות ה-PET מקורו ב-F-18, מחצית מהרדיואקטיביות הראשונית המוזרקת תאבד כל שעתיים. במקרה זה, סורק ה-PET אינו יכול עוד לזהות את האות השיורי 24 שעות לאחר ההזרקה. בנוסף, הפער של יום אחד בין זריקות [18 F]FMISO (יום 1) ו-[18 F]FDG (יום 3) יאפשר דעיכה מלאה של [18 F]FMISO כאשר [18 F]FDG PET מבוצע, ולכן אין חפיפה של אות [18 F]FMISO בסריקת [¹⁸F]FDG PET.
5. חזור על שלבים 4.1.-4.4. עבור הזרקת [¹⁸F]FDG ביום השלישי, למעט ריכוז פעילות כולל של 6-8 MBq ב 100 μL מוזרק עם ספיגה של 60 דקות לפני תחילת סריקת PET.
6. חשב את הפעילות המוזרקת [18 F]FMISO או [¹⁸F]FDG באמצעות הנוסחה הבאה ¹¹:
   פעילות בהזרקה (MBq) = פעילות במזרק לפני הזרקה - פעילות במזרק לאחר ההזרקה

5. רכישת PET/MR

1. הפעל את מחמם האוויר כדי לחמם את מיטת ההדמיה של העכבר לפני סריקת PET המתוזמנת. השתמש 5% isoflurane (1 L / min רפואי O₂) כדי להרדים את העכבר בתא אינדוקציה.
2. לאחר הרדמה ובדיקה נכונה באמצעות תגובת צביטת הבוהן, העבירו בזהירות ומיד את העכבר למיטת החימום ושמרו על הרדמה באיזופלורן 2%-2.5%. הניחו את ראש העכבר על מוט הנשיכה ומרחו חומר סיכה לעיניים על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות והיווצרות אפשרית של כיבים בקרנית. כסו את מיטת ההדמיה בסדין פלסטיק כדי לשמור על הטמפרטורה שמסביב למיטה.
3. נטר ורשום את קצב הנשימה וטמפרטורת הגוף של העכבר באמצעות כרית הנשימה הפנימית והבדיקה התרמית, בהתאמה. ודא כי טמפרטורת הגוף של העכבר נשמרת על 37 ° C בעוד קצב הנשימה נשמר בטווח של 40-50 נשימות לדקה (bpm) על ידי התאמת רמת isoflurane.
4. בצע תצוגת מעקב כדי לאתר את מיקום העכבר בתוך הסורק. התאם את מיקום מיטת העכבר כך שיכסה את כל גוף העכבר, כאשר אזור פלג הגוף העליון ממוקם במרכז FOV של ה- MR.
5. כדי להתחיל סריקת PET, בחר/י ״ רכישת PET ״ בחלון רשימת המחקר ולאחר מכן בחר/י ״טווח סריקה ברכישה קודמת ״ כדי להשתמש במיקום מיטת העכבר שנקבע מראש מתצוגת הצופים. לחץ על הכן > אישור כדי להעביר אוטומטית את מיטת העכבר מ- MR ל- PET ולהתחיל את הרכישה.
6. תחת עורך התרופות הרדיואקטיביות, בחר את הרדיונוקליד המתאים, ולאחר מכן הזן את הפרטים של מינון ההזרקה והזמן לפני ואחרי [18 F]FMISO או [¹⁸F]הזרקת FDG, כפי שנמדד בשלב 4.3. ושלב 4.4. הזן את עובי העכבר בתפריט Subject Information.
7. המשך ברכישות MR עם השלמת סריקת PET. לשם כך, בחר הכן כדי להעביר את העכבר ל- MR מ- PET. לחץ על אישור כדי להמשיך.
8. לאחר השלמת כל הסריקות, בחר בית כדי להזיז את מיטת ההדמיה בחזרה למיקום ברירת המחדל.
9. כבו את חומר ההרדמה ושטפו את מיטת ההדמיה ב-O₂ רפואי. בדוק את רפלקס המשיכה של דוושת העכבר. העבירו את העכבר ממיטת ההדמיה בחזרה לכלוב דיור נקי המונח על גבי כרית חימום כדי לסייע בהתאוששות מההרדמה ולהחזיר את רפלקס הימין.
10. תחת Raw Scan, בחר PET Acquisition כדי לטעון את נתוני ה-PET הגולמיים שנרכשו לצורך שחזור PET . בחר MM לשימוש כמפת חומרים. המשך בשחזור PET באמצעות הפרמטר כמתואר בשלב 3.6.
11. יש להקפיד על ההנחיות המקומיות והמוסדיות בעת טיפול בעכברים לאחר מחקרי הדמיה של PET. יש להתייחס לכל החומרים המתכלים המשומשים, כגון מזרקים, מחטים, כפפות, מגבונים ופסולת ביולוגית, כגון מצעי כלוב וחומר צואתי, שהיו במגע ישיר עם העכבר כפסולת רדיואקטיבית, ולטפל בזהירות בהתאם לתקנות המקומיות.

6. ניתוח תמונות PET

1. פתח את התוכנה Image Analysis (ראה רשימת חומרים) ובחר Load DICOM Data כדי לפתוח את תמונות PET ו-MR.
2. גררו את תמונות ה-PET וה-MR התואמות לחלון התצוגה של התוכנה ובחרו באפשרות 'רישום אוטומטי' כדי לבצע רישום משותף אוטומטי של תמונות ה-PET וה-MR שהתקבלו.
   1. בתפריט Registration Setup , בחר Rigid Transformation. השתמשו ב'הזחה ' וב'סיבוב ' בתפריט 'קשיח'/'עדינה' .
   2. בתפריט בחירת תפקיד גלובלית, לחץ על MM כהפניה ועל סריקת PET סטטית כפריכה.
   3. בדוק את תמונות ה-PET/MR הרשומות במשותף כדי לוודא יישור תקין. במידת הצורך, השתמש ברישום ידני כדי להתאים את התמונות באופן ידני.
   4. אתר את הגידול האורתוטופי בכבד באמצעות תמונת MR. השתמש ב - Interpolated Ellipse ROI כדי לצייר VOI על הגידול, תוך שימוש בתמונת MR לעיון. העבר את VOI הגידול שנוצר מ- MR לתמונת PET. בחרו בכלי מברשת ובכלי מחק כדי להגדיר בקפידה את גבול VOI שקופית אחר שקופית. יש להקפיד להימנע מזליגה של ספיגת רדיואקטיביות מהכבד בתמונת ה-PET.
   5. השתמש באליפסואיד VOI כדי ליצור 3 מ"מ³ VOI על הכבד כאיבר ייחוס. הקפד להימנע מאזורים של מבנים גלויים של כלי הדם ודרכי המרה בכבד על ידי שימוש בתמונת MR כמדריך.
   6. בחר הצג טבלת החזר השקעה כדי לשנות את שמם של כל ה- VOI שצוירו. רשום את כל הנתונים הדרושים, כגון רדיואקטיביות (kBq/mL) ונפח הגידול (מ"מ³), בגיליון אלקטרוני. שמור עותק של שרטוטי VOI ואחסן בארכיון הן את נתוני ההדמיה הגולמיים והן את נתוני ההדמיה המשוחזרים בכונן קשיח חיצוני לאחר השלמתם.
   7. חשב את ערך הספיגה המתוקנן (SUV) עבור כל VOI באמצעות המשוואה הבאה¹¹:
      SUV = C_PET(t)/(ID/BW)
      כאשר C_PET(t) היא הפעילות הנמדדת ב-VOI, ID הוא המינון המוזרק הנמדד ב-kBq, ו-BW הוא משקל גוף העכבר בק"ג, בהנחה שצפיפות הרקמה היא 1 גרם/מ"ל.

תוצאות

כדי להשיג בלוק גידול מתאים להשתלה אורתוטופית עוקבת, שיבוטים יציבים נוצרו תחילה על-ידי הזרקה תת-עורית של 200 מיקרוליטר של תרחיף תאים ב-DPBS (המכיל תאי MHCC97L) לתוך האגף התחתון של עכברים עירומים (איור 1A). צמיחת הגידול נוטרה, וכאשר גודל הגידול הגיע ל 800-1000 מ"מ 3 (כ -4 שבועות לאחר ההז...

Discussion

במחקר זה, תיארנו את ההליכים לביצוע HAL על HCC xenografts אורתוטופי בכבד באמצעות גידולים תת עוריים, יחד עם שיטות לניטור לא פולשני של היפוקסיה גידולית ב xenografts אורתוטופיים באמצעות [18 F]FMISO ו [¹⁸F]FDG PET/MR. העניין שלנו הוא הדמיה מטבולית של מודלים שונים של סרטן ומחלות לאבחון מוקדם והערכת תגובה לטי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sterile saline	BBraun	N/A	0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL
10# Scalpel blade	RWD Life Science Co.,ltd	S31010-01	Animal surgery tool
10% povidone-iodine solution	Banitore	6.425.678	For disinfection
25G needle with a 1 mL syringe	BD PrecisionGlide	N/A	1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections
5 mL syringe	Terumo	SS05L	5 mL syringe Luer Lock
70% Ethanol	Merck	1.07017	For disinfection
Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAF2000	For automated cell counting
Buprenorphine	HealthDirect	N/A	Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery
Cell Culture Dish (60 mm diameter)	Thermo Scientific	150462	For tumor tissue processing
Centrifuge	Sigma	3-16KL, fixed-angle rotor 12311	For cell suspensions collection
Centrifuge Conical Tube	Eppendorf	EP0030122151	For cell suspensions collection
Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)	Gibco	10566024	high glucose, GlutaMAX™ Supplement
Digital Caliper	RS PRO	841-2518	For subcutaneous tumor size measurement
Direct heat CO2 incubator	Techcomp Limited	NU5841	For cell culture
Dose calibrator	Biodex	N/A	Atomlab 500
DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline)	Gibco	14287072	For cell wash and injection
Eye lubricant	Alcon Duratears	N/A	Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	A4766801	Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines
Forceps (curved fine and straight blunt)	RWD Life Science Co.,ltd	F12012-10 & F12011-13	Animal surgery tool
Heating pad	ALA Scientific Instruments	N/A	Heat pad for mice during surgery
Insulin syringe	Terumo	10ME2913	1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections
InterView fusion software	Mediso	Version 3.03	Post-processing and image analysis software
Inverted microscope	Yu Lung Scientific Co., Ltd	BM-209G	For cells morphology visualization
Isoflurane	Chanelle Pharma	N/A	Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL
Ketamine	Alfasan International B.V.	HK-37715	Ketamine 10% injection solution, 10 mL
Medical oxygen	Linde HKO	101-HR	compressed gas, 99.5% purity
nanoScan PET/MR Scanner	Mediso	N/A	3 Tesla MR
Needle holder	RWD Life Science Co.,ltd	F31026-12	Animal surgery tool
Nucline nanoScan software	Mediso	Version 3.0	Scanner operating software
Nylon Suture (6/0 and 5/0)	Healthy Medical Company Ltd	000524 & 000526	Animal surgery tool
Penicillin- Streptomycin	Gibco	15140122	Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin.
Pentabarbital	AlfaMedic	13003	Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice
Sharp scissors	RWD Life Science Co.,ltd	S14014-10	Animal surgery tool
Spring Scissors	RWD Life Science Co.,ltd	S11005-09	Animal surgery tool
Trypan Blue Solution, 0,4%	Gibco	15250061	For cell counting
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red.	Gibco	25200072	For cell digestion
Xylazine	Alfasan International B.V.	HK-56179	Xylazine 2% injection solution, 30 mL