Hepatosellüler Karsinomun Ortotopik Fare Modelinde Non-İnvaziv PET/MR Görüntüleme

Özet

Burada, hepatik arter ligasyonu olan ve olmayan ortopik hepatosellüler karsinom ksenogreftleri oluşturmak ve [18 F]Floromisonidazol ([18 F]FMISO) ve [18 F]Florodeoksiglukoz ([¹⁸F]FDG) kullanılarak tümör hipoksisinin non-invaziv pozitron emisyon tomografisi (PET) görüntülemesini gerçekleştirmek için bir protokol sunuyoruz.

Özet

İnsan hastalığını özetleyen hepatosellüler karsinomun (HCC) klinik öncesi deneysel modelleri, tümörigenezi incelemek ve yeni terapötik yaklaşımları değerlendirmek için önemli bir araçtır. Pozitron emisyon tomografisi (PET) kullanılarak yapılan non-invaziv tüm vücut görüntüleme, dokuların moleküler düzeyde in vivo özellikleri hakkında gerçek zamanlı olarak kritik bilgiler sağlar. Burada, tümör hipoksisini indüklemek için hepatik arter ligasyonu (HAL) olan ve olmayan ortopik HCC ksenogreft oluşturulması ve [18 F]Floromisonidazol ([18 F]FMISO) ve [18 F]Florodeoksiglukoz ([¹⁸F]fdg) evcil hayvan/manyetik rezonans (MR) görüntüleme kullanılarak tümör metabolizmasının in vivo olarak değerlendirilmesi için bir protokol sunuyoruz. Tümör hipoksisi, hipoksi belirteci [18 F] FMISO kullanılarak kolayca görselleştirilebilir ve [18 F] FMISO alımının, HAL uygulanan HCC farelerinde, HAL olmayan gruba göre daha yüksek olduğu, oysa [¹⁸F] FDG'nin iki grup arasında tümör hipoksisini ayırt edemediği bulunmuştur. HAL tümörleri ayrıca hipoksiye yanıt olarak daha yüksek düzeyde hipoksi ile indüklenebilir faktör (HIF)-1α ekspresyonu gösterdi. HAL tümörlerinin nicelleştirilmesi, standartlaştırılmış değer alımı (SUV) yaklaşımına dayanarak [¹⁸F] FMISO alımında 2.3 kat artış göstermiştir.

Giriş

Hepatosellüler karsinom (HCC), 2020 yılında 900.000'den fazla yeni vaka ve 800.000 ölümle dünya çapında en çok teşhis edilen altıncı kanser ve kanserden üçüncü en yaygın ölüm nedenidir¹. En büyük risk faktörü, viral enfeksiyonlar (hepatit B ve C virüsleri), alkol kötüye kullanımı, diyabet ve alkolsüz steatohepatit^2'nin bir sonucu olarak ortaya çıkan sirozdur. HCC'nin yönetimi oldukça karmaşıktır ve hastalığın evrelemesine bağlı olarak cerrahi rezeksiyon, termal veya kimyasal ablasyon, transplantasyon, transarteriyel kemoembolizasyon, radyasyon ve kemoterapi dahil olmak üzere çeşitli tedavi seçenekleri mevcuttur ^2,3. HCC, küratif amaçlı tedavi uygulanan hastaların %70'inde hastalık nükseden kemoterapiye dirençli bir tümördür².

Yüksek derecede tümör heterojenliğine rağmen, HCC iki yaygın sonuçla ilişkilidir: (i) HCC çok hipoksiktir ve (ii) tümör hipoksisi daha büyük tümör agresifliği ve tedavi başarısızlığı ile bağlantılıdır. HCC hücrelerinin kontrolsüz çoğalması, vaskülarizasyondan önce yüksek bir oksijen tüketim oranı ile sonuçlanır ve böylece hipoksik bir mikro ortam yaratır. Düşük tümöral içi oksijen seviyeleri daha sonra tümör agresifliğini ve tedavi yanıtını etkileyen bir dizi biyolojik yanıtı tetikler. Hipoksi ile indüklenebilir faktörler (HIF'ler) genellikle hipoksi ^2,3'e yanıtta temel transkripsiyonel düzenleyiciler olarak kabul edilir. Bu nedenle, hipoksiyi tespit etme yeteneği, neoplastik dokuları görselleştirmek ve invaziv prosedürler gerektiren erişilemeyen bölgeleri tanımlamak için çok önemlidir. Ayrıca, tümör agresifliğine yol açan moleküler değişikliklerin daha iyi anlaşılmasına ve hasta tedavi sonuçlarının iyileştirilmesine yardımcı olur.

Pozitron emisyon tomografisi (PET) kullanılarak moleküler görüntüleme, HCC de dahil olmak üzere birçok kanserin tanı ve evrelemesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Özellikle, [18 F] Florodeoksiglukoz ([¹⁸F] FDG) ve [^{11 C]}Asetat içeren çift izleyicili PET görüntülemenin kombine kullanımı, HCC tanısında genel duyarlılığı önemli ölçüde artırabilir ^4,5. Öte yandan, hipoksinin görüntülenmesi, yaygın olarak kullanılan hipoksik belirteç [18 F] Floromisonidazol ([¹⁸F] FMISO) kullanılarak elde edilebilir. Klinik pratikte, hipoksinin non-invaziv değerlendirmesi, radyasyon tedavisi planlaması için çeşitli tümör tipleri ve bölgeler arasında ayrım yapmak için önemlidir⁶.

Preklinik görüntüleme, farklı hastalıklar için fare modellerinin non-invaziv ve uzunlamasına değerlendirilmesinde vazgeçilmez bir araç haline gelmiştir. Sağlam ve yüksek oranda tekrarlanabilir bir HCC modeli, insan HCC'sinin patofizyolojisine ve yeni tedavilerin değerlendirilmesine yönelik klinik öncesi ve translasyonel araştırmalar için önemli bir platformu temsil etmektedir. PET görüntüleme ile birlikte, herhangi bir zaman noktası için moleküler düzeyde önemli bilgiler sağlamak için in vivo davranışlar açıklığa kavuşturulabilir. Burada, hepatik arter ligasyonu (HAL) ortotopik HCC ksenogreftlerinin üretimi ve [18 F] FMISO ve [¹⁸F] FDG PET / MR kullanılarak in vivo tümör metabolizmalarının analizi için bir protokol tarif ediyoruz. HAL'in dahil edilmesi, tümör hipoksisini in vivo olarak incelemek için transgenik veya kimyasal olarak indüklenen HCC fareleri ksenogreftlerinin uygun bir modelini oluşturur, çünkü HAL, tümör içi hipoksi ^7,8'i indüklemek için arteriyel kan akışını etkili bir şekilde bloke edebilir. Ek olarak, pimonidazol kullanılarak yapılan ex vivo immünohistokimyasal boyamanın aksine, hipoksi sonucu tümör metabolizmasındaki değişiklikler, PET görüntüleme kullanılarak kolayca görselleştirilebilir ve invaziv olmayan bir şekilde ölçülebilir, böylece tedavi yanıtının uzunlamasına değerlendirilmesi veya direncin ortaya çıkışının ölçülmesi ^3,7,8 . Burada gösterilen yöntemimiz, HCC biyolojisini in vivo olarak incelemek için PET / MR görüntüleme kullanarak tümör hipoksisinin non-invaziv izlenmesi ile birlikte sağlam bir hipoksik HCC modelinin oluşturulmasına izin verir.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları, Uluslararası Laboratuvar Hayvanları Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından akredite edilmiş bir program olan Hong Kong Üniversitesi Karşılaştırmalı Tıp Araştırma Merkezi'nde (CCMR) Canlı Hayvanların Öğretimde ve Araştırmada Kullanımı Komitesi (CULATR) uyarınca gerçekleştirilmiştir. Çalışmada kullanılan hayvanlar, 6-8 haftalıkken, 20 g ± 2 g ağırlığında dişi BALB / cAnN-nu (Çıplak) farelerdi. Yiyecek ve su ad libitum sağlandı.

1. İnsan hepatosellüler karsinom hücre hatlarının deri altı enjeksiyonu

NOT: MHCC97, deri altı HCC ksenograft modelini oluşturmak için kullanılan bir insan HCC hücre hattıdır. MHCC97L hücreleri, Karaciğer Kanseri Enstitüsü, Fudan Üniversitesi Zhongshan Hastanesi, Şanghay, Çin Halk Cumhuriyeti^9'dan elde edilir ve kısa tandem tekrarlama (STR) profillemesi ile doğrulanır.

1. Kültür MHCC97L hücreleri ve% 5 CO₂ ile sağlanan nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de bir T-75 hücre kültürü şişesinde% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş kültür ortamında muhafaza edilir (bkz. Kültür ortamını her 2 günde bir değiştirin ve hücreleri% 80 -% 90 oranında hasat edin.
   NOT: Başlangıç hücre sayısı 1,5 x 10 6 hücredir ve hücreler^6-8 pasaj içinde kullanılır.
2. Kültür ortamını ve tripsin-etilendiamintetraasetik asidi (tripsin-EDTA) kullanıma kadar karanlıkta 4 °C'de saklayın. Kullanmadan önce kültür ortamını 37 °C'ye ve tripsin-EDTA'yı oda sıcaklığına ısıtın. Bu bölümde kullanılan tüm reaktifler ve sarf malzemeleri için Malzeme Tablosuna bakın.
3. Kültür medyasını kaldırın. Hücre tabakasını 10 mL steril fosfat tamponlu salin ile durulayın (DPBS, bakınız Malzeme Tablosu).
4. Kültür şişesine 5 mL tripsin-EDTA ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de inkübe edin. Hücre tabakası dağılana ve şişeden tamamen ayrılana kadar hücreleri ters çevrilmiş bir mikroskop altında 20x büyütmede kontrol edin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Hücrelerin tripsin-EDTA'da 15 dakikadan fazla bırakılmadığından emin olun.
5. Kültür şişesine 5 mL kültür medyası ekleyin. Hücreleri nazikçe pipetleyerek aspire edin. Hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne aktarın ve 5 dakika boyunca 1.107 x g'de döndürün (bkz.
6. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 1 mL PBS ile nazikçe yeniden askıya alın. Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için pipeti iyice kullanın. Otomatik hücre sayacını kullanarak hücre sayısını belirleyin (bkz. Malzeme Tablosu) ve hücre süspansiyonunu PBS'de 5 x 10⁶ hücre/mL konsantrasyonuna hazırlayın.
7. 1 mL'lik bir şırıngada 25 G'lik bir iğne ile 200 μL hücre süspansiyonu hazırlayın. Her şırınga 1 x 10⁶ MHCC97L hücre içerir (200 μL'de). Şırıngayı ıslak buz üzerinde tutun.
8. Fareyi, ketamin (87.5 mg / kg) ve ksilazin (12.5 mg / kg) karışımının intraperitoneal (i.p.) enjeksiyonu ile anestezikleştirin. Ayak parmağını sıkıştırma refleksini kullanarak uygun anesteziyi sağlayın. Kurumayı ve kornea ülserlerinin potansiyel oluşumunu önlemek için fareye göz yağlayıcısı uyguladığınızdan emin olun. Fareyi steril bir pedin üzerine sırtüstü bir konuma getirin (bkz.
9. Farenin alt kanadının (sol veya sağ tarafı) yakınındaki sırt bölgesini %70 etanol ile sterilize edin ( bkz. Cildi forseps ile yukarı kaldırın ve iğne eğimini cildin altına yavaşça yerleştirin.
10. İğnenin çekilmesi üzerine hücre süspansiyonunun enjeksiyon bölgesinden kazara sızmasını önlemek için iğneyi deri altı düzlemi boyunca delinme bölgesinden 4-5 mm ilerletin. İğne yerleştirmenin cildin altında çok derin olmadığından emin olun, bu da kazara organ hasarına neden olabilir.
11. Forsepsleri serbest bırakın ve karşı tarafa nüfuz etmemeye dikkat ederek şırınganın içeriğini dikkatlice ve yavaşça boşaltın. Enjeksiyonda şişlik olup olmadığını kontrol etmek için iğneyi çekin. Anesteziden kurtulmaya yardımcı olmak ve hareketliliği yeniden kazanmak için fareyi önceden ısıtılmış bir ısıtma yastığının üzerine oturan kafese geri yerleştirin. Fare tamamen uyanık olana ve sternal yassılığını koruyana kadar fareyi izlemeye devam edin.
12. Farenin tümör büyümesini ve refahını haftalık olarak izleyin. Bir kumpas kullanarak tümör hacmini (V) ölçün (bkz. Aşağıdaki formül^10'u kullanarak tümör hacmini hesaplayın ve kaydedin:
    V = (G 2× L)/²
    burada W genişliktir ve L, tümörün uzunluğudur.
13. Enjeksiyondan 4-6 hafta sonra, 800-1000^mm3 arasında önemli miktarda subkutan tümör elde edildiğini kontrol edin. Toplam tümör yükünün vücut ağırlığının% 10'unu geçmediğinden emin olun.

2. Ortotopik karaciğer implantasyonu ve hepatik arter ligasyonu

1. Aşağıdaki cerrahi reaktifleri ve aletleri dezenfekte edilmiş bir biyolojik güvenlik kabininde hazırlayın: Bir tabakta 10 mL kültür ortamı,% 10 povidon-iyot çözeltisi,% 70 etanol, otoklavlanmış cerrahi aletler, yani keskin makas, yaylı makas, forseps (kavisli ince ve düz künt), iğne tutucu, neşter bıçağı, 6-0 ve 5-0 naylon sütür, bir ısıtma yastığı.
2. Tüm cerrahi aletleri otoklav yapın ve sadece steril bir tezgahta tutun. Cerrahi prosedürler boyunca farelere ameliyat öncesi, içi ve sonrası yeterli ve gerekli bakımı sağlayın (aşağıdaki adımlara bakın).
   1. Ameliyat öncesi ağrının giderilmesi için, fareye cerrahi prosedürün başlamasından en az 30 dakika önce deri altı buprenorfin (0.1 mg / kg) enjeksiyonu enjekte edin. Ameliyat sonrası bakım ve yönetim için, fareye her 8-12 saatte bir, sürekli olarak 3 gün boyunca deri altı buprenorfin (0.1 mg / kg) enjeksiyonu enjekte edin. Bu bölümde kullanılan tüm reaktifler ve sarf malzemeleri için Malzeme Tablosuna bakın.
3. Subkutan tümör taşıyan fareyi bir i.p. pentobarbital enjeksiyonu (330 mg / kg) ile ötenazileştirin. Bir neşter bıçağı kullanarak tümör bölgesinin derisinde bir kesi yapın. Subkutan tümör bloğunu tüketin ve hemen kültür ortamına aktarın. Bu adımı mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirin.
4. Tümör bloğunu keskin cerrahi makas kullanarak 1^mm3 küçük tümör küplerine kesin. Tüm tümör küplerini kültür ortamında saklayın. Subkutan tümör bloğunun çekirdek bölgesini kullanmaktan kaçının.
5. Daha sonraki ortotopik tümör implantasyon ameliyatından geçecek fareyi, ketamin (87.5 mg / kg) ve ksilazin (12.5 mg / kg) karışımının i.p. enjeksiyonu ile anestezi altına alın. Fareyi uyuşturmadan önce buprenorfin verdikten sonra en az 30 dakika geçtiğinden emin olun. Kurumasını ve kornea ülserlerinin potansiyel oluşumunu önlemek için fareye göz yağlayıcısı uyguladığınızdan emin olun.
6. Fareyi, önceden ısıtılmış bir ısıtma yastığının üstündeki steril bir pedin üzerine sırtüstü bir konuma getirin. Cerrahi prosedürün sonuna kadar farenin fizyolojik durumunu her 15 dakikada bir izleyin ve kaydedin.
7. Farenin uzuvlarını uzatın. Ventral karın ve toraksın maruziyetini en üst düzeye çıkarmak için bunları bantla sabitleyin. Farenin tüm karın derisini% 10'luk bir povidon-iyot çözeltisi veya% 70 etanol ile sterilize edin. Ayak parmağını kıstırmaya yanıt verilip verilmediğini kontrol ederek farenin anestezik derinliğini değerlendirin - pedal çekilme refleksi.
8. Keskin makas kullanarak peritona erişmek için yaklaşık 10 mm'lik bir orta hat kesisi yaparak laparotomi yapın. Ksifoid işlemi forseps ile kafaya doğru kelepçeleyin ve çekin ve cerrahi alanı açmak için subkostal retraktörleri uygulayın. Ameliyat bölgesinin iyi bir cerrahi görünümünü sağlamak için uygun bir kesi yapıldığından emin olun.
9. Medyan ve sol lobları ıslak bir gazlı bezle yukarı doğru çekin. Bağırsakları karın dışına farenin sol tarafına taşıyın ve ıslak bir gazlı bezle örtün. Optimize edilmiş görselleştirme için bir büyüteç lambası altında, pankreas kafasından hepatik pediküldeki köküne kadar uzanan ortak hepatik arter (CHA) üzerinde hepatik arter ligasyonu (HAL) gerçekleştirin.
10. Sol lobu açığa çıkarmak için medyan ve sol lobları ıslak bir gazlı bezle geriye / aşağıya doğru çekin. Sol lobun yüzeyinde steril bir neşter bıçağı ile yaklaşık 2 mm uzunluğunda ve derinliğinde bir kesi yapın.
    NOT: Komşu karın organlarına travma sonucu kazara yırtılmaları veya yırtılmaları en aza indirmek için tümör implantasyonu için karaciğerin medyan lobunu kullanmak da mümkündür.
11. Hemen steril forseps ile karaciğer insizyonuna bir tümör parçası yerleştirin. Tümörü karaciğerde güvenli bir şekilde oturacak şekilde gömün. Karaciğer ve hemostaza uygun tümör fragmanı implantasyonunu sağlamak için insizyon bölgesine 6-0 naylon sütür ile sekiz rakamlı bir sütür uygulayın. Aşırı kanamayı önlemek için bu işlemi mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirin. Tamamlandığında, karın kesisini kesilmiş 5-0 dikişle kapatın.
12. Anesteziden kurtulmaya yardımcı olmak ve doğru refleksi yeniden kazanmak için fareyi önceden ısıtılmış bir ısıtma yastığının üzerine oturan kafese geri yerleştirin. Fare tamamen uyanık olana ve sternal yaslanmayı koruyana kadar farenin fizyolojik durumunu her 15 dakikada bir izlemeye ve kaydetmeye devam edin.
13. Tüm fareler ortopik tümör implantasyonundan geçene kadar prosedürü tekrarlayın. Cerrahi operasyondan sonraki 3 gün boyunca fizyolojik durumlarını günlük olarak sürekli izleyerek tüm farelere ameliyat sonrası bakım sağlayın. Her 8-12 saatte bir buprenorfin (0.1 mg / kg) verin.

3. PET/MR kalibrasyonlarının ve iş akışının ayarlanması

NOT: Görüntüleme, klinik öncesi bir PET/MR 3T sistemi kullanılarak gerçekleştirilir (bkz.

1. Bir indüksiyon odasında fareyi uyuşturmak için% 5 izofluran (1 L / dak tıbbi_O2) kullanın. Her tarama için, anestezi uygulanan fareyi sürekli ısıtmalı bir görüntüleme yatağına dikkatlice yerleştirin; İlk olarak, statik [18 F] FMISO ^{veya [18}F] FDG PET taramaları için anatomik referans olarak MR (izci görünümü) ile tarama yapın, ardından anatomik referans MR görüntüleme.
2. Statik PET taraması, T1 ağırlıklı (zayıflama düzeltmesi) ve T2 ağırlıklı (anatomik referans) MR görüntüleme ve planlanan görüntüleme oturumundan 1 gün önce PET rekonstrüksiyonunu içerecek şekilde yazılımda sıralı bir PET/MR görüntüleme iş akışı oluşturun (bkz.
3. PET elde etmek için 400-600 keV seviyesinde ayrım, F-18 çalışma izotopu, 1-5 tesadüf modu ve 20 dakikalık taramalar seçin.
4. Tüm vücut T1 ağırlıklı MR elde etmek için, TE = 4,3 ms, TR = 16 ms, görüş alanı (FOV) = 90 mm x 60 mm, uyarma sayısı (NEX) = 3, 0,9 mm kalınlığında 28 dilim ve voksel boyutu = 0,375 mm 3 x 0,375 mm 3 x 0,9^mm 3 ile gradyan^eko-3D kullanın.
5. Tüm vücut T2 ağırlıklı MR elde etmek için, TE = 71.8 ms, TR = 3000 ms, FOV = 90 mm x 60 mm, NEX = 5, 0.9 mm kalınlığında 28 dilim, voksel boyutu = 0.265 mm 3 x 0.268 mm³ x 0.9 mm³ ile hızlı dönüşlü echo 2D kullanın.
6. PET'i yeniden yapılandırmak için Tera-Tomo (TT3D) algoritmasını, yinelemeler = 8, alt kümeler = 6, 1-3 tesadüf modunu ve bozulma, ölü zaman, rastgele, zayıflama ve dağılım düzeltmeleriyle birlikte genel voksel boyutu 0,3^mm3 olan görüntüler oluşturmak üzere seçin.
7. PET kantitasyonu^11'in doğruluğunu kontrol etmek için deneyin başlamasından önce bir PET aktivite testi yapın.
   1. 5 mL'lik bir şırıngayı, üreticinin tavsiyesine göre su veya tuzlu suyla seyreltilmiş 5-8 MBq [¹⁸F] FMISO ile doldurun. Şırınganın aktivitesini kaydetmek için bir doz kalibratör kullanın (bkz. Ölçüm zamanına dikkat edin.
   2. Tüm şırıngayı kaplamak için yeniden yapılandırılmış görüntüye bir ilgi hacmi (VOI) çizin. Görüntüden geri kazanılan aktiviteyi doz kalibratöründen elde edilen değerle karşılaştırın. İyileşen aktivite% ±5 içinde doğru olduğunda görüntüleme çalışmalarına devam edin.

4. [18 F] FMISO ve [¹⁸F] FDG enjeksiyonu

1. Görüntüleme çalışmalarının başlamasından 30 dakika önce tedarikçiden [¹⁸F] FMISO klinik dozu alın. Radyoaktif malzemeleri kullanırken laboratuvar önlüğü, eldiven, gözlük, film rozeti ve halka dozimetreleri gibi uygun kişisel koruyucu ekipmanları (KKD) giyin. Radyoaktif maddelerin çapraz kontaminasyonunu önlemek için eldivenleri sık sık değiştirin.
2. Radyoaktif stok çözümlerini, L bloklu bir masa üstü kalkanın arkasındaki kurşun saklama kabına yerleştirin. Bir aliquot [¹⁸F] FMISO dağıtın ve sterilize edilmiş salin ile seyreltin. Toplam aktivite konsantrasyonunun 100 μL'de 18-20 MBq olduğundan emin olun.
3. [¹⁸F]FMISO'yu iğneli 1 mL'lik bir şırınga ile hazırlayın (bkz. Doz kalibratöründe gösterilen radyoaktiviteyi ve zamanı kaydedin.
4. Radyotracer'in enjeksiyonundan önce fare ağırlığını kaydedin. Fareyi anestezik etmek için% 5 izofluran (1 L / dak tıbbi O₂) kullanın, ardından hazırlanan [¹⁸F] FMISO'yu kuyruk damarından dikkatlice enjekte edin. Çürük düzeltmesini hesaba katmak için şırınganın enjeksiyon süresini ve kalıntı aktivitesini kaydedin. PET taramasından önce [18 F]FMISO alımına izin vermek için fareyi ¹⁸⁰dakika boyunca kafese geri yerleştirin. Farenin [¹⁸F]FMISO PET'ten sonraki 1 gün boyunca iyileşmesine izin verin.
   NOT: [18 F]FMISO ^{ve [}18 F]FDG için çok farklı in vivo farmakokinetik profillere rağmen, her iki radyotracer de yarı ömrü 109.77 dakika (< 2 saat) olan bir PET radyonüklid olan ^F-18ile radyoetiketlenmiştir. PET sinyali F-18'den kaynaklandığından, ilk enjekte edilen radyoaktivitenin yarısı her 2 saatte bir kaybolacaktır. Bu durumda, enjeksiyon sonrası 24 saat kalan sinyal artık PET tarayıcı tarafından tespit edilemez. Ek olarak, hem [18 F]FMISO (^{gün 1}) hem de [¹⁸F]FDG (gün 3) enjeksiyonları arasındaki 1 günlük boşluk, [18 F]FDG PET gerçekleştirildiğinde [18 F]FMISO'nun tamamen bozulmasına izin verecektir, bu nedenle [18 F]FDG PET taramasında [¹⁸F]FMISO sinyalinin üst üste binmesine izin vermeyecektir.
5. 4.1.-4.4 arasındaki adımları yineleyin. 3. günde [¹⁸F] FDG enjeksiyonu için, 100 μL'de 6-8 MBq'luk toplam aktivite konsantrasyonunun, PET taramasının başlamasından önce 60 dakikalık bir alım ile enjekte edilmesi dışında.
6. Aşağıdaki formülü kullanarak enjekte edilen [18 F]FMISO veya [¹⁸F]FDG etkinliğini hesaplayın ¹¹:
   Enjekte edilen aktivite (MBq) = Enjeksiyondan önce şırıngadaki aktivite - Enjeksiyondan sonra şırıngadaki aktivite

5. PET/MR alımı

1. Zamanlanan PET taramasından önce fare görüntüleme yatağını ısıtmak için hava ısıtıcısını açın. Bir indüksiyon odasında fareyi uyuşturmak için% 5 izofluran (1 L / dak tıbbi_O2) kullanın.
2. Ayak parmağı sıkışma tepkisi kullanılarak düzgün bir şekilde anestezi uygulandıktan ve kontrol edildikten sonra, fareyi dikkatlice ve hemen ısıtma yatağına aktarın ve% 2 -% 2.5 izofluranda anesteziyi koruyun. Fare kafasına eğilimli fareyi ısırık çubuğuna yerleştirin ve kurumasını ve kornea ülserlerinin potansiyel oluşumunu önlemek için her iki göze de göz yağlayıcısı uygulayın. Yatağın çevre sıcaklığını korumak için görüntüleme yatağını plastik bir tabaka ile örtün.
3. Sırasıyla şirket içi solunum yastığı ve termal probu kullanarak farenin solunum hızını ve vücut sıcaklığını izleyin ve kaydedin. İzofluran seviyesini ayarlayarak farenin vücut ısısının 37 °C'de tutulduğundan, solunum hızının dakikada 40-50 nefes (bpm) aralığında tutulduğundan emin olun.
4. Tarayıcının içindeki fare konumunu bulmak için bir keşif görünümü gerçekleştirin. Fare yatağı konumunu, gövde bölgesi MR'nin merkezinde yer alacak şekilde tüm fare gövdesini kaplayacak şekilde ayarlayın.
5. Bir PET taraması başlatmak için etüt listesi penceresinde PET Alımı'nı seçin, ardından izci görünümünden önceden belirlenmiş fare yatağı konumunu kullanmak için Önceki Alım'da Tarama Aralığı'nı seçin. Fare yatağını otomatik olarak MR'den PET'e taşımak ve satın almayı başlatmak için Tamam'> Hazırla'ya tıklayın.
6. Radyofarmasötik Editör altında, uygun radyonüklidi seçin, ardından adım 4.3'te ölçüldüğü gibi [¹⁸F] FMISO veya [¹⁸F] FDG enjeksiyonundan önce ve sonra enjeksiyon dozunun ayrıntılarını ve süresini girin. ve adım 4.4. Konu Bilgileri menüsünün altına farenin ağırlığını girin.
7. PET taramasının tamamlanmasının ardından MR edinimlerine devam edin. Bunu yapmak için, fareyi PET'ten MR'ye taşımak üzere Hazırla'yı seçin. Devam etmek için Tamam'ı tıklatın.
8. Tüm taramalar tamamlandıktan sonra, görüntüleme yatağını varsayılan konuma geri taşımak için Giriş'i seçin.
9. Anesteziyi kapatın ve görüntüleme yatağını tıbbi_O2 ile yıkayın. Fare pedalı çekilme refleksini kontrol edin. Anesteziden kurtulmaya yardımcı olmak ve doğru refleksi yeniden kazanmak için fareyi görüntüleme yatağından bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirilmiş temiz bir muhafaza kafesine geri aktarın.
10. Ham Tarama altında, PET yeniden yapılandırılması için elde edilen ham PET verilerini yüklemek üzere PET Alımı'nı seçin. Malzeme haritası olarak kullanmak için MM'yi seçin. Adım 3.6'da açıklandığı gibi parametreyi kullanarak PET yeniden yapılandırmasına devam edin.
11. PET görüntüleme çalışmalarından sonra fareleri kullanırken yerel ve kurumsal kurallara kesinlikle uyun. Şırıngalar, iğneler, eldivenler, mendiller ve fare ile doğrudan temas halinde olan kafes yatakları ve dışkı maddesi gibi biyolojik atıklar gibi tüm kullanılmış sarf malzemelerini radyoaktif atık olarak arıtın ve yerel yönetmeliklere göre dikkatli kullanın.

6. PET görüntü analizi

1. Görüntü Analizi yazılımını açın (bkz. Malzeme Tablosu) ve PET ve MR görüntülerini açmak için DICOM Verilerini Yükle'yi seçin.
2. İlgili PET ve MR görüntülerini yazılım görüntüleme penceresine sürükleyin ve elde edilen PET ve MR görüntülerinin otomatik olarak birlikte kaydedilmesini gerçekleştirmek için Otomatik Kayıt'ı seçin.
   1. Kayıt Ayarları menüsü altında, Katı dönüşüm'ü seçin. Rijit/Benzin menüsünde Shift ve Rotation seçeneklerini kullanın.
   2. Genel Rol Seçimi menüsü altında, Referans olarak MM'ye ve Yeniden Dilim olarak Statik PET Taraması'na tıklayın.
   3. Doğru hizalamayı sağlamak için birlikte kayıtlı PET/MR görüntülerini inceleyin. Gerekirse, görüntüleri manuel olarak ayarlamak için Manuel Kayıt'ı kullanın.
   4. MR görüntüsünü kullanarak karaciğerdeki ortotopik tümörü bulun. Referans olarak MR görüntüsünü kullanarak tümör üzerinde bir VOI çizmek için İnterpolasyonlu Elips ROI'yi kullanın. Oluşturulan tümör VOI'yi MR'den PET görüntüsüne aktarın. VOI kenarlığını slayt slayt dikkatlice tanımlamak için Fırça Aracı ve Silgi Aracı'nı seçin. PET görüntüsünde karaciğerden radyoaktivite alımının yayılmasını önlediğinizden emin olun.
   5. Karaciğer üzerinde referans organ olarak 3^mm3 VOI oluşturmak için Elipsoid VOI kullanın. MR görüntüsünü kılavuz olarak kullanarak görünür hepatik vasküler ve biliyer yapıların alanlarından kaçındığınızdan emin olun.
   6. Çizilen tüm VOI'leri yeniden adlandırmak için YG Tablosunu Göster'i seçin. Gerekli tüm verileri, örneğin radyoaktivite (kBq / mL) ve tümör hacmi (mm³) bir elektronik tabloya kaydedin. VOI çizimlerinin bir kopyasını kaydedin ve tamamlandığında hem ham hem de yeniden oluşturulmuş görüntüleme verilerini harici bir sabit sürücüye arşivleyin.
   7. Aşağıdaki denklem^11'i kullanarak tüm VOI'ler için standartlaştırılmış alım değerini (SUV) hesaplayın:
      SUV = C_PET(t)/(ID/BW)
      burada C_PET(t) VOI'de ölçülen aktivitedir, ID kBq cinsinden ölçülen enjekte edilen dozdur ve BW , 1 g / mL'lik bir doku yoğunluğu varsayılarak kg cinsinden fare vücut ağırlığıdır.

Sonuçlar

Ardışık ortopik implantasyon için uygun bir tümör bloğu elde etmek için, stabil klonlar ilk önce DPBS'de (MHCC97L hücreleri içeren) 200 μL hücre süspansiyonunun çıplak farelerin alt kanadına deri altı enjeksiyonu ile üretildi (Şekil 1A). Tümör büyümesi izlendi ve tümör boyutu 800-1000 mm3'e ulaştığında (enjeksiyondan yaklaşık 4 hafta sonra), fareler ötenazi yapıldı ve ortaya çıkan tümör bloğu, başka bir çıplak fare grubuna (n = 6) sonraki karaciğer...

Tartışmalar

Bu çalışmada, subkutan tümörler kullanılarak karaciğer ortotopik HCC ksenogreftlerinde HAL uygulama prosedürleri ve [18 F] FMISO ve [¹⁸F] FDG PET / MR kullanılarak ortotopik ksenogreftlerde tümör hipoksisinin non-invaziv izlenmesi için yöntemler tanımlanmıştır. İlgi alanımız, erken tanı ve tedaviye yanıt değerlendirmesi için çeşitli kanser ve hastalık modellerinin metabolik görüntülemesinde yatmaktadır ^11,13,14,15

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sterile saline	BBraun	N/A	0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL
10# Scalpel blade	RWD Life Science Co.,ltd	S31010-01	Animal surgery tool
10% povidone-iodine solution	Banitore	6.425.678	For disinfection
25G needle with a 1 mL syringe	BD PrecisionGlide	N/A	1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections
5 mL syringe	Terumo	SS05L	5 mL syringe Luer Lock
70% Ethanol	Merck	1.07017	For disinfection
Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAF2000	For automated cell counting
Buprenorphine	HealthDirect	N/A	Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery
Cell Culture Dish (60 mm diameter)	Thermo Scientific	150462	For tumor tissue processing
Centrifuge	Sigma	3-16KL, fixed-angle rotor 12311	For cell suspensions collection
Centrifuge Conical Tube	Eppendorf	EP0030122151	For cell suspensions collection
Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)	Gibco	10566024	high glucose, GlutaMAX™ Supplement
Digital Caliper	RS PRO	841-2518	For subcutaneous tumor size measurement
Direct heat CO2 incubator	Techcomp Limited	NU5841	For cell culture
Dose calibrator	Biodex	N/A	Atomlab 500
DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline)	Gibco	14287072	For cell wash and injection
Eye lubricant	Alcon Duratears	N/A	Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	A4766801	Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines
Forceps (curved fine and straight blunt)	RWD Life Science Co.,ltd	F12012-10 & F12011-13	Animal surgery tool
Heating pad	ALA Scientific Instruments	N/A	Heat pad for mice during surgery
Insulin syringe	Terumo	10ME2913	1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections
InterView fusion software	Mediso	Version 3.03	Post-processing and image analysis software
Inverted microscope	Yu Lung Scientific Co., Ltd	BM-209G	For cells morphology visualization
Isoflurane	Chanelle Pharma	N/A	Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL
Ketamine	Alfasan International B.V.	HK-37715	Ketamine 10% injection solution, 10 mL
Medical oxygen	Linde HKO	101-HR	compressed gas, 99.5% purity
nanoScan PET/MR Scanner	Mediso	N/A	3 Tesla MR
Needle holder	RWD Life Science Co.,ltd	F31026-12	Animal surgery tool
Nucline nanoScan software	Mediso	Version 3.0	Scanner operating software
Nylon Suture (6/0 and 5/0)	Healthy Medical Company Ltd	000524 & 000526	Animal surgery tool
Penicillin- Streptomycin	Gibco	15140122	Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin.
Pentabarbital	AlfaMedic	13003	Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice
Sharp scissors	RWD Life Science Co.,ltd	S14014-10	Animal surgery tool
Spring Scissors	RWD Life Science Co.,ltd	S11005-09	Animal surgery tool
Trypan Blue Solution, 0,4%	Gibco	15250061	For cell counting
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red.	Gibco	25200072	For cell digestion
Xylazine	Alfasan International B.V.	HK-56179	Xylazine 2% injection solution, 30 mL