肝細胞癌の同所性モデルマウスにおける非侵襲的PET/MRイメージング

要約

ここでは、肝動脈結紮の有無にかかわらず同所性肝細胞癌異種移植片を作成し、[18 F]フルオロミソニダゾール([18 F]FMISO)および[18 F]フルオロデオキシグルコース([¹⁸F]FDG)を使用して腫瘍低酸素症の非侵襲的陽電子放出断層撮影(PET)を行うためのプロトコルを提示します。

要約

ヒト疾患を再現する肝細胞癌(HCC)の前臨床実験モデルは、腫瘍形成を研究し、新しい治療アプローチを評価するための重要なツールとなります。陽電子放出断層撮影(PET)を使用した非侵襲的な全身イメージングは、組織のin vivo特性に関する重要な洞察を分子レベルでリアルタイムで提供します。ここでは、腫瘍低酸素症を誘発するための肝動脈結紮(HAL)の有無にかかわらず、同所性HCC異種移植片を作成するためのプロトコルと、[18 F]フルオロミソニダゾール([18 F]FMISO)および[¹⁸F]フルオロデオキシグルコース([¹⁸F]FDG)PET /磁気共鳴(MR)イメージングを使用したin vivoでの腫瘍代謝の評価を紹介します。腫瘍低酸素症は、低酸素マーカー[18 F]FMISOを使用して容易に視覚化でき、[18 F]FMISOの取り込みは、HALを受けたHCCマウスで非HAL群よりも高かったが、[¹⁸F]FDGは2つのグループ間で腫瘍低酸素症を区別できなかったことがわかりました。HAL腫瘍はまた、低酸素に応答してより高いレベルの低酸素誘導因子(HIF)-1α発現を示した。HAL腫瘍の定量化は、標準化値取り込み(SUV)アプローチに基づく[^18F]FMISO取り込みの2.3倍の増加を示した。

概要

肝細胞がん(HCC)は、世界で6番目に診断されたがんであり、がんによる死因として3番目に多く、2020年には90万人以上の新規症例と80万人以上の死亡があります¹。主な危険因子は肝硬変であり、これはウイルス感染(B型およびC型肝炎ウイルス)、アルコール乱用、糖尿病、および非アルコール性脂肪性肝炎²の結果として発生します。HCCの管理はかなり複雑であり、疾患の病期分類に応じて、外科的切除、熱的または化学的アブレーション、移植、経動脈化学塞栓術、放射線、化学療法など、いくつかの治療オプションが利用可能です^2,3。HCCは化学療法に難治性の腫瘍であり、治癒目的の治療を受けた患者の最大70%に疾患が再発します²。

高度の腫瘍の不均一性にもかかわらず、HCCは2つの一般的な結果に関連しています:(i)HCCは非常に低酸素であり、(ii)腫瘍低酸素症は腫瘍の攻撃性および治療の失敗の増加に関連しています。HCC細胞の制御されない増殖は、血管新生に先行する高い酸素消費率をもたらし、したがって低酸素微小環境を作り出す。腫瘍内酸素レベルが低いと、腫瘍の攻撃性と治療反応に影響を与えるさまざまな生物学的反応が引き起こされます。低酸素誘導因子(HIF)は、低酸素症への応答において必須の転写調節因子として認識される^{ことがよくあります2,3}。したがって、低酸素症を検出する能力は、腫瘍性組織を視覚化し、侵襲的な手順を必要とするアクセスできない部位を特定するために重要です。また、腫瘍の攻撃性につながる分子変化をよりよく理解し、患者の治療結果を改善するのにも役立ちます。

陽電子放出断層撮影(PET)を使用した分子イメージングは、HCCを含む多くの癌の診断と病期分類に一般的に使用されています。特に、[18 F]フルオロデオキシグルコース([¹⁸F]FDG)と[¹¹C]アセテートを含むデュアルトレーサーPETイメージングを組み合わせて使用すると、HCC診断における全体的な感度が大幅に向上する可能性があります^4,5。一方、低酸素症のイメージングは、一般的に使用される低酸素マーカー[18 F]フルオロミソニダゾール([¹⁸F]FMISO)を使用して達成できます。臨床診療では、低酸素症の非侵襲的評価は、放射線治療計画のためにさまざまな種類の腫瘍と領域を区別するために重要です⁶。

前臨床イメージングは、さまざまな疾患のマウスモデルの非侵襲的および縦断的評価に不可欠なツールになっています。堅牢で再現性の高いHCCモデルは、ヒトHCCの病態生理学および新規治療法の評価に関する前臨床およびトランスレーショナル研究のための重要なプラットフォームです。PETイメージングとともに、in vivoの挙動を解明して、任意の時点で分子レベルで重要な洞察を提供することができます。ここでは、[¹⁸F]FMISOおよび[¹⁸F]FDG PET/MRを使用した肝動脈結紮(HAL)同所性HCC異種移植片の生成とそれらのin vivo腫瘍代謝の分析のためのプロトコルについて説明します。HALの組み込みは、HALが腫瘍内低酸素症を誘発するために動脈血供給を効果的に遮断することができるので、in vivoで腫瘍低酸素症を研究するためのトランスジェニックまたは化学的に誘導されたHCCマウス異種移植片の適切なモデルを作る^7,8。さらに、ピモニダゾールを用いたex vivo免疫組織化学染色とは異なり、低酸素の結果としての腫瘍代謝の変化は、PETイメージングを使用して非侵襲的に容易に視覚化および正確に定量することができ、治療反応の縦断的評価または耐性の出現の測定を可能にします^3,7,8.ここに示す方法は、PET/MRイメージングを用いた腫瘍低酸素の非侵襲的モニタリングとともに、堅牢な低酸素HCCモデルの作成を可能にし、in vivoでのHCC生物学を研究することができます。

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プロトコル

すべての動物実験は、国際実験動物ケア評価認定協会(AAALAC)の認定プログラムである香港大学比較医学研究センター(CCMR)の教育研究における生きた動物の使用に関する委員会(CULATR)に従って実施されました。研究に使用された動物は、6〜8週齢の雌のBALB / cAnN-nu(ヌード)マウスで、体重は20 g±2 gでした。食料と水は 自由に提供されました。

1.ヒト肝細胞癌細胞株の皮下注射

注:MHCC97は、皮下HCC異種移植片モデルの生成に使用されるヒトHCC細胞株です。MHCC97L細胞は^{、中華人民} 共和国上海の復旦大学中山病院肝臓がん研究所9から入手し、ショートタンデムリピート(STR)プロファイリングによって認証されます。

1. MHCC97L細胞を培養し、10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加した培養培地中で、5%_CO2 を供給された加湿インキュベーター内で37°CのT-75細胞培養フラスコに維持する( 材料の表を参照)。2日ごとに培地を交換し、80%〜90%のコンフルエントで細胞を回収します。
   注:開始セル番号は1.5 x 10 6セルであり、セルは⁶ 〜8継代以内で使用されます。
2. 培養液とトリプシン・エチレンジアミン四酢酸(トリプシン・EDTA)は、使用するまで暗所で4°Cで保存する。使用前に培地を37°Cに、トリプシン-EDTAを室温に予め温めてください。このセクションで使用されるすべての試薬と消耗品については、 材料表 を参照してください。
3. 培地を取り出します。細胞層を10 mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(DPBS、 材料表を参照)ですすいでください。
4. 5 mLのトリプシン-EDTAを培養フラスコに加え、細胞を37°Cでインキュベートします。 細胞層が分散してフラスコから完全に剥離するまで、20倍の倍率で倒立顕微鏡で細胞を確認します( 材料の表を参照)。細胞がトリプシン-EDTAに15分以上残されていないことを確認してください。
5. 5 mLの培地を培養フラスコに加えます。穏やかにピペッティングして細胞を吸引します。細胞懸濁液を遠沈管に移し、1,107 x gで5分間回転させます(材料表を参照)。
6. 上清を除去し、細胞ペレットを1 mLのPBSで穏やかに再懸濁します。十分にピペットで、単一細胞懸濁液を得た。自動セルカウンター( 材料表を参照)を使用して細胞数を決定し、PBS中で5 x 10⁶ 細胞/mLの濃度に細胞懸濁液を調製します。
7. 1 mLシリンジに25 Gの針で200 μLの細胞懸濁液を吸引します。各シリンジには、1 x 10⁶ MHCC97L細胞(200 μL中)が含まれています。注射器を湿った氷の上に置いてください。
8. ケタミン(87.5 mg / kg)とキシラジン(12.5 mg / kg)の混合物の腹腔内(i.p.)注射でマウスを麻酔します。.つま先のピンチ反射を使用して適切な麻酔を確保します。乾燥や角膜潰瘍の形成を防ぐために、マウスに目の潤滑剤を塗布してください。マウスを滅菌パッドの仰臥位に置きます( 材料の表を参照)。
9. マウスの下脇腹付近(左側または右側)の背側領域を70%エタノールで滅菌します( 材料の表を参照)。鉗子で皮膚を持ち上げ、針の斜角を皮膚の下にそっと挿入します。
10. 針の引き抜き時に注射部位から細胞懸濁液が誤って漏れないように、穿刺部位から皮下面に沿って針を4〜5mm進めます。針の挿入が皮膚の下に深すぎず、偶発的な臓器損傷を引き起こす可能性があることを確認してください。
11. 鉗子を放し、反対側を貫通しないように注意しながら、注射器の内容物を慎重にゆっくりと排出します。針を引き抜いて、注射の腫れを確認します。麻酔からの回復を助け、可動性を取り戻すために、事前に温めた加熱パッドの上に座っているケージにマウスを戻します。マウスが完全に目覚め、胸骨横臥を維持するまで、マウスの監視を続けます。
12. マウスの腫瘍の成長と健康状態を毎週監視します。ノギスを使用して腫瘍体積(V)を測定します( 材料の表を参照)。次の式¹⁰を使用して腫瘍体積を計算して記録します。
    V = (W 2× L)/²
    ここで、Wは幅、Lは腫瘍の長さです。
13. 注射後4〜6週間の間に、800〜1000 mm³のかなりの大きさの皮下腫瘍が得られることを確認します。総腫瘍負荷が体重の10%を超えないようにしてください。

2.同所性肝移植と肝動脈結紮術

1. 消毒された生物学的安全キャビネットに次の手術用試薬とツールを準備します:皿に10 mLの培地、10%ポビドンヨード溶液、70%エタノール、オートクレーブ滅菌された手術器具、すなわち鋭利なはさみ、スプリングはさみ、鉗子(湾曲した細くてまっすぐな鈍い)、針ホルダー、メスの刃、6-0および5-0ナイロン縫合糸、加熱パッド。
2. すべての手術器具をオートクレーブし、滅菌ベンチでのみ取り扱ってください。外科的処置全体を通して、マウスに適切かつ必要な術前、術中、および術後のケアを提供します(以下の手順を参照)。
   1. 術前の疼痛緩和のために、外科手術開始の少なくとも30分前にブプレノルフィン(0.1 mg / kg)の皮下注射をマウスに注射します。.術後のケアと管理のために、ブプレノルフィン(0.1 mg / kg)の皮下注射を8〜12時間に1回、3日間連続してマウスに注射します。.このセクションで使用されるすべての試薬と消耗品については、 材料表 を参照してください。
3. ペントバルビタール(330 mg / kg)のi.p.注射で皮下担癌マウスを安楽死させます。.メスの刃を使用して腫瘍部位の皮膚を切開します。皮下腫瘍ブロックを切除し、直ちに培地に移します。この手順はできるだけ早く実行してください。
4. 鋭利な外科用ハサミを使用して、腫瘍ブロックを1 mm³ の小さな腫瘍キューブにカットします。すべての腫瘍キューブを培地に入れたままにします。皮下腫瘍ブロックのコア領域の使用は避けてください。.
5. その後の同所性腫瘍移植手術を受けるマウスを麻酔します ケタミン(87.5 mg / kg)とキシラジン(12.5 mg / kg)の混合物のIP注射。マウスを麻酔する前に、ブプレノルフィンを与えてから少なくとも30分が経過したことを確認してください。.乾燥や角膜潰瘍の形成の可能性を避けるために、マウスに目の潤滑剤を塗布してください。
6. マウスを、事前に温めた加熱パッドの上にある滅菌パッドの上に仰臥位に置きます。外科的処置が終了するまで15分ごとにマウスの生理学的状態を監視および記録する。
7. マウスの手足を伸ばします。腹腹部と胸部の露出を最大化するためにテープでそれらを固定します。マウスの腹部皮膚全体を10%ポビドンヨード溶液、続いて70%エタノールで滅菌する。つま先のつまみ(ペダル離脱反射)に反応しないかどうかを確認することにより、マウスの麻酔深度を評価します。
8. 鋭利なハサミを使用して腹膜にアクセスするために約10mmの正中線切開を行うことにより、開腹術を行います。剣状突起を鉗子で頭に向かってクランプして引っ張り、肋骨下開創器を適用して手術野を開きます。手術部位の良好な外科的視野を可能にするために、適切な切開が行われていることを確認してください。
9. 濡れたガーゼ綿棒で中央葉と左葉を上向きに引っ込めます。腸を腹部の外側のマウスの左側に移動し、湿ったガーゼ綿棒で覆います。膵頭から肝茎の根元までの総肝動脈(CHA)に肝動脈結紮術(HAL)を虫眼鏡の下で行い、視覚化を最適化します。
10. 濡れたガーゼ綿棒で正中葉と左葉を前後に引っ込めて、左葉を露出させます。滅菌メスの刃で左葉の表面に長さと深さが約2mmの切開を行います。
    注:隣接する腹部臓器への外傷による偶発的な裂傷や裂傷を最小限に抑えるために、腫瘍移植に肝臓の正中葉を使用することもできます。
11. 直ちに滅菌鉗子で腫瘍片を肝臓切開部に挿入します。腫瘍が肝臓にしっかりと収まるように腫瘍を埋めます。切開部位に6-0ナイロン縫合糸を備えた8の字縫合糸を適用して、肝臓への適切な腫瘍片の移植と止血を確実にします。過度の出血を避けるために、できるだけ早くこの操作を実行してください。完了したら、中断された5-0縫合糸で腹部切開を閉じます。
12. 麻酔からの回復を助け、正しい反射を取り戻すために、事前に温められた加熱パッドの上に座っているケージにマウスを戻します。マウスが完全に目覚め、胸骨横臥を維持するまで、15分ごとにマウスの生理学的状態を監視および記録し続けます。
13. すべてのマウスが同所性腫瘍移植を通過するまで手順を繰り返します。外科手術後3日間、毎日生理状態を継続的に監視することにより、すべてのマウスに術後ケアを提供します。ブプレノルフィン(0.1 mg / kg)を8〜12時間ごとに投与します。.

3. PET/MRキャリブレーションとワークフローの設定

注:イメージングは、前臨床PET / MR 3Tシステムを使用して実行されます(材料の表を参照)。

1. 5%イソフルラン(1 L/minの医療用O₂)を使用して、誘導チャンバーでマウスを麻酔します。スキャンごとに、麻酔をかけたマウスをイメージングベッドに注意深く置き、継続的に加熱します。まず、静的[18 F]FMISOまたは[¹⁸F]FDG PETスキャンの解剖学的参照としてMR(スカウトビュー)でスキャンし、続いて解剖学的参照MRイメージングを行います。
2. ソフトウェアでシーケンシャルPET/MRイメージングワークフローを作成し( 材料表を参照)、静的PETスキャン、T1強調(減衰補正)およびT2強調(解剖学的参照)MRイメージング、およびスケジュールされたイメージングセッションの1日前にPET再構成を含めます。
3. PETを取得するには、400〜600 keVレベル識別、F-18研究同位体、1〜5同時モード、および20分のスキャンを選択します。
4. 全身のT1強調MRを取得するには、TE = 4.3 ms、TR = 16 ms、視野(FOV)= 90 mm x 60 mm、励起数(NEX)= 3、厚さ0.9 mm、ボクセルサイズ= 0.375 mm 3 x 0.375 mm 3 x 0.9 mm ³の勾配エコー3Dを使用します。
5. 全身のT2強調MRを取得するには、TE = 71.8 ms、TR = 3000 ms、FOV = 90 mm x 60 mm、NEX = 5、厚さ0.9 mm、ボクセルサイズ= 0.265 mm 3 x 0.268 mm 3 x 0.9 mm ³の高速スピンエコー2Dを使用します。
6. PETを再構築するには、テラトモ(TT3D)アルゴリズムを選択し、反復= 8、サブセット= 6、1-3同時モード、減衰、デッドタイム、ランダム、減衰、および散乱補正を使用して、全体のボクセルサイズ0.3 mm³の画像を作成します。
7. 実験開始前にPET活性試験を行い、PET定量^{の精度を確認した11}。
   1. メーカーの推奨に従って、5 mLシリンジに水または生理食塩水で希釈した5〜8 MBq [¹⁸F]FMISOを満たします。用量校正器を使用して、シリンジの活動を記録します( 材料の表を参照)。測定時刻に注意してください。
   2. 再構成された画像に関心ボリューム(VOI)を描画して、シリンジ全体をカバーします。画像から回復した活性を、線量校正器から得られた値と比較します。回復した活性が±5%以内の精度である場合、画像検査を進めてください。

4. [18 F]FMISOおよび[¹⁸F]FDGインジェクション

1. 画像検査の開始の30分前に、サプライヤーから[¹⁸F] FMISOの臨床用量を取得します。放射性物質を取り扱う際は、白衣、手袋、眼鏡、フィルムバッジ、リング線量計などの適切な個人用保護具(PPE)を着用してください。放射性物質の相互汚染を避けるために、手袋を頻繁に交換してください。
2. 放射性ストック溶液を、Lブロックテーブルトップシールドの後ろの鉛貯蔵容器に入れます。[¹⁸F] FMISOのアリコートを分注し、滅菌生理食塩水で希釈します。.総活性濃度が100μLで18〜20MBqであることを確認してください。
3. 針付きの1 mLシリンジで[¹⁸F]FMISOを作成します( 材料の表を参照)。線量校正器に示された放射能と時間を記録します。
4. 放射性トレーサーの注射前にマウスの体重を記録します。5%イソフルラン(1 L / min医療用O₂)を使用してマウスを麻酔し、準備した[¹⁸F]FMISOを尾静脈から慎重に注入します。シリンジの注入時間と残留活性を記録して、崩壊補正を行います。PETスキャンの前に[¹⁸F]FMISOを取り込むことができるように、マウスをケージに180分間戻します。[¹⁸F] FMISOペットの後、マウスが1日間回復するのを待ちます。
   注:[18 F]FMISOと[¹⁸F]FDGのin vivo薬物動態プロファイルは非常に異なりますが、両方の放射性トレーサーは、半減期が109.77分(<2時間)のPET放射性核種であるF-18で放射性標識されています。PET信号はF-18に由来するため、最初に注入された放射能の半分は2時間ごとに失われます。この場合、注入後24時間の残留信号はPETスキャナーで検出できなくなります。さらに、[18 F]FMISO(1日目)と[¹⁸F]FDG(3日目)の両方の注入の間に1日のギャップがあるため、[¹⁸F]FDG PETを実行したときに[18 F]FMISOが完全に減衰するため、[18 F]FDG PETスキャンで[¹⁸F]FMISO信号が重複することはありません。
5. 手順 4.1.-4.4 を繰り返します。3日目の[^18F]FDG注射の場合、PETスキャンの開始前に100μL中の6〜8 MBqの総活性濃度が60分の取り込みで注入されることを除いて。
6. 注入された[18 F]FMISOまたは[¹⁸F]FDG活性を次の式¹¹を使用して計算します。
   注射活性(MBq)=注射前のシリンジ内の活性-注射後のシリンジ内の活性

5. ペット/MRの取得

1. エアヒーターをオンにして、スケジュールされたPETスキャンの前にマウスイメージングベッドを温めます。5%イソフルラン(1 L/minの医療用O₂)を使用して、誘導チャンバーでマウスを麻酔します。
2. 適切に麻酔をかけ、つま先のピンチ応答を使用してチェックしたら、マウスを加熱ベッドに注意深く直ちに移し、麻酔を2%〜2.5%イソフルランに維持します。マウスの頭を伏せてバイトバーに置き、乾燥や角膜潰瘍の形成を防ぐために、両眼に目の潤滑剤を塗布します。ベッドの周囲温度を維持するために、イメージングベッドをプラスチックシートで覆います。
3. マウスの呼吸数と体温を、それぞれ内蔵の呼吸パッドとサーマルプローブを使用して監視および記録します。イソフルランレベルを調整することにより、呼吸数が毎分40〜50呼吸(bpm)の範囲に保たれている間、マウスの体温が37°Cに維持されていることを確認します。
4. スカウトビューを実行して、スキャナー内のマウスの位置を特定します。マウスのベッド位置を調整して、マウスの体全体をカバーし、胴体領域をMRの中央FOVに配置します。
5. PETスキャンを開始するには、スタディリストウィンドウで PET 取得を選択し、 次に前回取得時のスキャン範囲 を選択して、スカウトビューから事前に決定されたマウスベッド位置を使用します。 [準備]をクリックして> [OK ]をクリックすると、マウスベッドがMRからPETに自動的に移動し、取得が開始されます。
6. 放射性医薬品エディターで、適切な放射性核種を選択し、ステップ 4.3 で測定した [18 F]FMISO または [¹⁸F]FDG 注射前後の注射量と時間の詳細を入力します。およびステップ4.4。[件名情報]メニューにマウスの重量を入力します。
7. PETスキャンが完了したら、MRの取得を進めます。これを行うには、[ 準備 ] を選択してマウスを PET から MR に移動します。[ OK] をクリックして続行します。
8. すべてのスキャンが完了したら、[ ホーム ]を選択してイメージングベッドをデフォルトの位置に戻します。
9. 麻酔をオフにし、イメージングベッドを医療用O₂で洗い流します。マウスペダルの離脱反射を確認してください。マウスをイメージングベッドから加熱パッドの上に置かれた清潔なハウジングケージに戻して、麻酔からの回復を助け、直立反射を取り戻します。
10. [生のスキャン]で、[PET取得]を選択して、取得した生のPETデータをPET再構成用にロードします。マテリアル マップとして使用する MM を選択します。ステップ 3.6 の説明に従って、パラメーターを使用して PET 再構築を続行します。
11. PETイメージング研究後にマウスを取り扱う際には、地域および機関のガイドラインを厳守してください。注射器、針、手袋、ワイプなどの使用済み消耗品、およびケージの寝具や糞便などの生物学的廃棄物など、マウスに直接接触したすべての消耗品を放射性廃棄物として処理し、地域の規制に従って慎重に取り扱ってください。

6. PET画像解析

1. 画像解析ソフトウェア(材料表を参照)を開き、[DICOMデータのロード]を選択してPETおよびMR画像を開きます。
2. 対応するPET画像とMR画像をソフトウェア表示ウィンドウにドラッグし、[自動登録]を選択して、結果のPET画像とMR画像の自動共同 登録 を実行します。
   1. [登録設定] メニューで、[剛体変換] を選択します。剛体/アフィンメニューのシフトと回転を使用します。
   2. [グローバル ロールの選択] メニューで、[参照] として [MM] をクリックし、再スライスとして [静的 PET スキャン] をクリックします。
   3. 共同登録されたPET / MR画像を検査して、適切な位置合わせを確認します。必要に応じて、 手動登録 を使用して画像を手動で調整します。
   4. MR画像を使用して肝臓の同所性腫瘍を特定します。 補間楕円ROI を使用して、参照用のMR画像を使用して腫瘍にVOIを描画します。作成した腫瘍VOIをMRからPET画像に転写する。 ブラシ ツールと 消しゴムツール を選択して、VOI境界線をスライドごとに慎重に定義します。PET画像上の肝臓からの放射能取り込みの波及を避けるようにしてください。
   5. 楕円体VOIを使用して、参照器官として肝臓に3 mm³ VOIを作成します。MR画像をガイドとして使用して、目に見える肝血管および胆道構造の領域を避けてください。
   6. [ ROI テーブルを表示 ] を選択して、描画されたすべての VOI の名前を変更します。放射能(kBq/mL)や腫瘍体積(^mm3)など、必要なデータをすべてスプレッドシートに記録します。VOI図面のコピーを保存し、完了したら、生のイメージングデータと再構築されたイメージングデータの両方を外付けハードドライブにアーカイブします。
   7. 次の式¹¹を使用して、すべてのVOIの標準化取り込み値(SUV)を計算します。
      SUV = C_PET(t)/(ID/BW)
      ここで、 C_PET(t)はVOIで測定された活性、 ID はkBqで測定された注射用量、 BW は1 g / mLの組織密度を想定したマウスの体重(kg)です。

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結果

連続的な同所性移植に適した腫瘍ブロックを得るために、最初に、ヌードマウスの下脇腹にDPBS(MHCC97L細胞を含む)中の200μLの細胞懸濁液を皮下注射することによって安定したクローンを生成しました(図1A)。腫瘍の成長をモニターし、腫瘍サイズが800〜1000mm3に達したとき(注射後約4週間)、マウスを安楽死させ、得られた腫瘍ブロックを約^1mm3断片に切断し、その後?...

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ディスカッション

本研究では,皮下腫瘍を用いた肝同所性HCC異種移植片のHAL実施手順と,[18F]FMISOおよび[^18F]FDG PET/MRを用いた同所性異所性異種移植片における腫瘍低酸素症の非侵襲的モニタリング方法について説明しました。私たちの関心は、早期診断と治療反応評価のためのさまざまな癌および疾患モデルの代謝イメージングにあります^11,13,14,15

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sterile saline	BBraun	N/A	0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL
10# Scalpel blade	RWD Life Science Co.,ltd	S31010-01	Animal surgery tool
10% povidone-iodine solution	Banitore	6.425.678	For disinfection
25G needle with a 1 mL syringe	BD PrecisionGlide	N/A	1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections
5 mL syringe	Terumo	SS05L	5 mL syringe Luer Lock
70% Ethanol	Merck	1.07017	For disinfection
Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAF2000	For automated cell counting
Buprenorphine	HealthDirect	N/A	Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery
Cell Culture Dish (60 mm diameter)	Thermo Scientific	150462	For tumor tissue processing
Centrifuge	Sigma	3-16KL, fixed-angle rotor 12311	For cell suspensions collection
Centrifuge Conical Tube	Eppendorf	EP0030122151	For cell suspensions collection
Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)	Gibco	10566024	high glucose, GlutaMAX™ Supplement
Digital Caliper	RS PRO	841-2518	For subcutaneous tumor size measurement
Direct heat CO2 incubator	Techcomp Limited	NU5841	For cell culture
Dose calibrator	Biodex	N/A	Atomlab 500
DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline)	Gibco	14287072	For cell wash and injection
Eye lubricant	Alcon Duratears	N/A	Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	A4766801	Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines
Forceps (curved fine and straight blunt)	RWD Life Science Co.,ltd	F12012-10 & F12011-13	Animal surgery tool
Heating pad	ALA Scientific Instruments	N/A	Heat pad for mice during surgery
Insulin syringe	Terumo	10ME2913	1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections
InterView fusion software	Mediso	Version 3.03	Post-processing and image analysis software
Inverted microscope	Yu Lung Scientific Co., Ltd	BM-209G	For cells morphology visualization
Isoflurane	Chanelle Pharma	N/A	Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL
Ketamine	Alfasan International B.V.	HK-37715	Ketamine 10% injection solution, 10 mL
Medical oxygen	Linde HKO	101-HR	compressed gas, 99.5% purity
nanoScan PET/MR Scanner	Mediso	N/A	3 Tesla MR
Needle holder	RWD Life Science Co.,ltd	F31026-12	Animal surgery tool
Nucline nanoScan software	Mediso	Version 3.0	Scanner operating software
Nylon Suture (6/0 and 5/0)	Healthy Medical Company Ltd	000524 & 000526	Animal surgery tool
Penicillin- Streptomycin	Gibco	15140122	Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin.
Pentabarbital	AlfaMedic	13003	Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice
Sharp scissors	RWD Life Science Co.,ltd	S14014-10	Animal surgery tool
Spring Scissors	RWD Life Science Co.,ltd	S11005-09	Animal surgery tool
Trypan Blue Solution, 0,4%	Gibco	15250061	For cell counting
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red.	Gibco	25200072	For cell digestion
Xylazine	Alfasan International B.V.	HK-56179	Xylazine 2% injection solution, 30 mL