כימות ניסיוני של אינטראקציות בין מערכות העברת תרופות ותאים במבחנה: מדריך להערכת ננו-רפואה פרה-קלינית

Summary

תהליך עבודה מודגם לכימות מוחלט של אינטראקציות בין נשא תרופה לתאים באמצעות ציטומטריה של זרימה כדי לאפשר הערכה רציונלית טובה יותר של מערכות אספקת תרופות חדשות. זרימת עבודה זו חלה על ספקי סמים מכל סוג שהוא.

Abstract

מרכיב מרכזי בתכנון מערכות אספקת תרופות נוגע לאופן שבו ניתן להגביר או להחליש אינטראקציות עם סוגי תאים ספציפיים. לדוגמה, כימותרפיה עשויה לתפקד עם נוגדן כדי לשפר את ההיקשרות לתאים סרטניים ("מיקוד") או לתפקד עם פוליאתילן גליקול כדי לסייע בהתחמקות מזיהוי תאי מערכת החיסון ("התגנבות"). אפילו ברמה התאית, אופטימיזציה של קשירה וספיגה של נשא תרופה היא בעיית תכנון ביולוגית מורכבת. לפיכך, חשוב להפריד בין עוצמת האינטראקציה של מוביל חדש עם תא לבין היעילות התפקודית של מטען המוביל לאחר שנמסר לאותו תא.

כדי להמשיך את הדוגמה הכימותרפית, "עד כמה הוא נקשר לתא סרטני" היא בעיה נפרדת מ"עד כמה הוא הורג תא סרטני". מבחנים כמותיים במבחנה עבור האחרונים מבוססים היטב ובדרך כלל מסתמכים על מדידת כדאיות. עם זאת, רוב המחקרים שפורסמו על אינטראקציות בין תאים לנשאים הם איכותניים או סמי-קוונטיים. בדרך כלל, מדידות אלה מסתמכות על תיוג פלואורסצנטי של הנשא, וכתוצאה מכך מדווחות על אינטראקציות עם תאים ביחידות יחסיות או שרירותיות. עם זאת, עבודה זו יכולה להיות סטנדרטית ולהיות כמותית לחלוטין עם מספר קטן של ניסויי אפיון. כימות מוחלט כזה הוא בעל ערך, שכן הוא מאפשר השוואות רציונליות, בין-מעמדיות ותוך-מעמדיות של מערכות אספקת תרופות שונות - ננו-חלקיקים, מיקרו-חלקיקים, וירוסים, מצומדי נוגדנים-תרופות, תאים טיפוליים מהונדסים או שלפוחיות חוץ-תאיות.

יתר על כן, כימות הוא תנאי מוקדם למטא-אנליזות הבאות או לגישות מידול סיליקו . במאמר זה מוצגים מדריכי וידאו, כמו גם עץ החלטות כיצד להשיג כימות במבחנה עבור מערכות אספקת תרופות מובילות, אשר לוקחים בחשבון הבדלים בגודל המוביל ואת מודל התיוג. בנוסף, נדונים שיקולים נוספים להערכה כמותית של מערכות מתקדמות להובלת תרופות. זה נועד לשמש משאב יקר ערך כדי לשפר את ההערכה הרציונלית ואת העיצוב עבור הדור הבא של הרפואה.

Introduction

העיצוב של מבנים לאספקת תרופות המציגים התנהגות ספציפית ומתוכננת, בהתאם לסוג התא שבו הם נתקלים, משך עניין מחקרי משמעותי. מבנים או "נשאים" פוטנציאליים של אספקת תרופות כוללים פורמולציות של שומנים, אנאורגניים שגודלו בננו, מכלולים פולימריים, שלפוחיות חוץ-תאיות, תאי חיידקים פונקציונליים או וירוסים שעברו שינוי. כל אלה יכולים להפגין ספציפיות של איברים, רקמות או תאים בשל תכונות פיזיקליות, תכונות פני שטח או פונקציות כימיות מהונדסות כגון חיבור נוגדנים ^1,2.

צעד כמעט בכל מקום בהערכת נשאים במבחנה הוא דגירה של תאים עם תרחיף המכיל את המוביל העמוס בתרופות. לאחר הדגירה, ביצועי המוביל נמדדים באמצעות קריאה פונקציונלית של ביצועי מטען התרופה, לדוגמה, יעילות העברה או רעילות. קריאות פונקציונליות הן שימושיות, מכיוון שהן מהוות מדד במורד הזרם ליעילות הספק. עם זאת, עבור מבנים מורכבים יותר של אספקת תרופות, חשוב יותר ויותר להתקדם מעבר לקריאות פונקציונליות ולכמת בנפרד את מידת האינטראקציה של הנשא עם התא המעניין. יש לכך כמה סיבות.

ראשית, יש עניין גובר בגילוי (ובשיפור איטרטיבי) של טכנולוגיות "פלטפורמה", שיכולות לשאת מגוון מטענים. לדוגמה, ננו-חלקיקי ליפידים (LNPs) שנועדו לתמצת רנ"א יכולים להחליף רצף רנ"א אחד באחר עם מעט אזהרות³. לכן, כדי לשפר באופן איטרטיבי את טכנולוגיית המוביל, זה קריטי לכמת את הביצועים שלה ללא תלות בפונקציונליות המטען. שנית, קריאות פונקציונליות עשויות להיות לא פשוטות עבור המטען המעניין, ולפגוע ביכולת לחזור ולהעריך במהירות את ניסוחי המוביל. בעוד שניתן לבצע אופטימיזציה במבחנה באמצעות מטען מודל עם קריאה פונקציונלית פשוטה (למשל, פלואורסצנציה), שינוי המטען יכול לשנות את התגובה הביולוגית למוביל⁴ ולפיכך לא להניב תוצאות מייצגות. שלישית, נשאים רבים מתוכננים לקיים אינטראקציה עם סוג תא מסוים ולהיקלט על ידו. יכולת מיקוד כזו של מוביל יכולה וצריכה להיות מובחנת מביצועי המטען הטיפולי שלו לאחר המיקוד. כדי להמשיך את הדוגמה של LNP, מטען RNA עשוי להיות חזק ביותר, אך אם ה-LNP אינו מסוגל להיקשר לתא, להיות מופנם ולשחרר את ה-RNA, לא תיראה השפעה תפקודית במורד הזרם. זו יכולה להיות בעיה במיוחד עבור נשאים המיועדים להתמקד בסוגי תאים קשים לשינוי, כגון תאי T⁵. לעומת זאת, LNP יכול לכוון ביעילות רבה, אך מטען הרנ"א עשוי שלא לתפקד. בדיקה במורד הזרם שמודדת רק את פונקציונליות המטען לא תוכל להבדיל בין שני מצבים אלה, ובכך תסבך את הפיתוח והאופטימיזציה של מערכות אספקת תרופות מובילות.

בעבודה זו, כיצד לכמת לחלוטין את איגוד המוביל נדון. אסוציאציה היא מונח המתייחס למידת האינטראקציה שנמדדה בניסוי בין נשא לתא. אסוציאציה אינה מבדילה בין קשירת ממברנה לבין הפנמה - נשא עשוי להיות קשור משום שהוא קשור לפני השטח של התא או משום שהתא הפנים אותו. אסוציאציה נמדדת בדרך כלל כחלק מניסויי דגירה של נשאים תאיים. מבחינה היסטורית, הקשר דווח ביחידות פלואורסצנטיות שרירותיות (בדרך כלל "עוצמת פלואורסצנציה חציונית" או MFI) או כ"אחוז שיוך", מדדים שמגבלותיהם נדונו בעבר⁶. בקיצור, מדידות אלה אינן ניתנות להשוואה בין ניסויים, מעבדות ונשאי תרופות בשל הבדלים בפרוטוקולי הניסוי, הגדרות ציטומטר זרימה ועוצמות הסימון של נשאים שונים. נעשו מאמצים להתגבר על הראשון על ידי כיול הציטומטר, ובכך להמיר את המידה היחסית של MFI למדד כמותי לחלוטין של פלואורסצנציה⁷. עם זאת, שיטה זו אינה מביאה בחשבון את השונות בעוצמת הסימון של נשאים שונים, ולכן אינה מאפשרת השוואה רציונלית של ביצועי נשאים שונים בתא יעד של בחירה⁸.

כאן, כיצד להמיר למעשה מיחידות פלואורסצנטיות יחסיות ושרירותיות למדד הכמותי המוחלט של "מספר הנשאים לתא" מודגם על ידי ביצוע מספר קטן של ניסויי אפיון נוספים. אם רוצים מדד אחר של ריכוז נשאים (למשל, מסת נשא לתא או נפח נשא לתא), קל להמיר מנשאים לכל תא, בתנאי שנעשה אפיון נשא. למען הקיצור וכדי להימנע מז'רגון, המילה "נשא" משמשת בעבודה זו כדי להתייחס למגוון העצום של מבני אספקת תרופות. טכניקות כימות אלה ישימות באותה מידה, בין אם הן מיושמות על חלקיק זהב מהונדס בננו או על חיידק מהונדס ביולוגית.

כמה עובדות מאפשרות המרה מיחידות פלואורסצנטיות שרירותיות לנשאים לכל תא. ראשית, עוצמת הפלואורסצנציה הנמדדת פרופורציונלית לריכוז של פלואורופור⁹ (או נשא המסומן באופן פלואורסצנטי), בהנחה שהפלואורסצנציה נמצאת בגבולות הגילוי של המכשיר והגדרות המכשור זהות. לפיכך, אם הפלואורסצנטיות של נשא והפלואורסצנטיות של דגימה ידועות, ניתן לקבוע כמה נשאים נמצאים בדגימה זו אם כל המדידות בוצעו באותן הגדרות ותנאים. עם זאת, במיוחד עבור נשאים קטנים יותר, ייתכן שלא ניתן יהיה למדוד פלואורסצנציה של נשאים, פלואורסצנציה של תאים ופלואורסצנטיות של תאים הקשורים לנשאים באותו מכשיר עם אותן הגדרות. במקרה זה, קיימת דרישה שנייה שתאפשר להמיר בין פלואורסצנציה נמדדת במכשיר אחד לפלואורסצנטיות מדודה במכשיר אחר. לשם כך, ניתן לקבוע עקומה סטנדרטית של ריכוז פלואורופור כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות בשני המכשירים, תוך ניצול המולקולות של פלואורוכרום מסיס שווה ערך (MESF) תקן⁹. לאחר מכן זה מאפשר מדידה של פלואורסצנציה של המוביל בתפזורת על גבי לא ציטומטר, מדידה שניתן לבצע על נשאים בכל גודל או מאפיין. כאשר כימות בתפזורת כזה נעשה על השעיית נשא של ריכוז ידוע, ניתן לחשב שוב את מספר הנשאים לכל תא של דגימה.

בעוד שעבודה זו מדגימה את התהליך למדידת שיוך נשאים (כפי שנקבע על ידי עוצמת פלואורסצנטיות נמדדת), פרוטוקול אנלוגי יכול להתבצע עבור מדידות אחרות של אינטראקציה בין תא לנשא (למשל, פרוטוקול ניסיוני המבדיל בין נשאים מופנמים לבין נשאים הקשורים לממברנה). בנוסף, פרוטוקול זה יהיה זהה במידה רבה אם הקשר יימדד באמצעות בדיקה שאינה פלואורסצנטית (למשל, באמצעות ציטומטריה של מסה).

Protocol

1. בחירת הזרם המתאים

1. עקבו אחר עץ ההחלטות המתואר באיור 1 כדי לקבוע את זרימת העבודה (זרם) הטובה ביותר (איור 2) עבור מערך הניסוי שבו נעשה שימוש. עיין בדיון להערות נוספות על בחירה זו של זרם.
2. אם בעקבות זרם הציטומטר, המשך בשלבים 2.1.1-2.2.7. אם אתה עוקב אחר הזרם בתפזורת, המשך בשלבים 3.1.1.1-3.1.5.7.

איור 1: עץ החלטות של זרם העבודה. ההחלטה באיזה זרם להשתמש תלויה בעיקר בסוג העניין של הספק. נשאים גדולים יותר ונשאים בעלי תכונות פיזור גבוהות יכולים להיות מזוהים בקלות רבה יותר בנפרד על ציטומטרים, ובכך להפוך אותם למתאימים לכימות באמצעות זרם הציטומטר. הזרם בתפזורת מתאים לכל סוגי הספקים האחרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: סקירה כללית של זרמי עבודה. פרוטוקול זה מפוצל לשני זרמים שונים. זרם הציטומטר משתמש בציטומטר רגיש כדי לספור את הנשאים בהשעיה, למדוד את הפלואורסצנטיות האינדיבידואלית שלהם, ולאחר מכן לקבוע את הפלואורסצנטיות של תאים הדוגרים עם נשאים. הזרם בתפזורת משתמש בטכניקות שאינן מבוססות על ציטומטריה, כגון ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, כדי לספור את הנשאים בתרחיף. לאחר מכן מכמתים את הפלואורסצנציה של המוביל הבודד באמצעות קורא מיקרו-פלטות או ספקטרופלואורומטר. השימוש בציטומטר הזרימה מוגבל, אם כן, למדידת הפלואורסצנטיות הסופית של תאים המודגרים עם נשאים, מדידה שניתן לבצע על טווח רחב יותר של ציטומטרים והיא בלתי תלויה בסוג המוביל המשמש. קיצורים: MESF = מולקולות של פלואורוכרום מסיס שווה ערך; MFI = עוצמת פלואורסצנציה חציונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

2. זרם הציטומטר

1. ספירת ספקים
   הערה: ניתן להשתמש בכל ציטומטר זרימה למדידה זו, בתנאי שקצב הזרימה (μL/s) ידוע. אם קצב הזרימה אינו ידוע ולא ניתן לקבוע אותו, אל תמשיך בשלב זה. במקום זאת, המשך לשלב 3.1. ספירת הנשאים בהשעיה מאפשרת קביעה מדויקת וניתנת לשחזור של מספר הנשאים שהודגרו בכל ניסוי בתא.
   1. הגדר את הציטומטר כדי לזהות נשאים, הן על ידי ערוץ פיזור אופטי (בדרך כלל פיזור צדדי [SSC]) והן על ידי פלואורסצנציה. הקפידו להתאים את הסף כדי לאפשר זיהוי של המנשאים.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך באיטרציה דרך ערוצי פיזור אופטיים שונים אם SSC אינו מספק אות ברור (לדוגמה, פיזור קדימה [FSC]).
   2. הפעל דגימה מדוללת בלבד כדי לכמת את ספירת אירועי הרקע הן בערוצי SSC והן בערוצים פלואורסצנטיים.
      הערה: ספירות האירועים האידיאליות ברקע הן <100 אירועים/שניות.
   3. הכן את הספקים עבור cytometry זרימה.
      1. ודא שהנשאים תלויים היטב על ידי מערבולת או סוניקציה, בהתאם למערכת המוביל המעורבת.
      2. במידת האפשר, ודא שריכוז הנשאים הוא בין 1,000 נשאים/μL ל-10,000 נשאים/μL. ספירת אירועים של אחד עד שני סדרי גודל גבוהים מהרקע היא התחלה טובה. אם סדר הגודל של ריכוז המוביל אינו ידוע, התחלה טובה היא להכין דילול של 1:1,000 מהמלאי. השתמש בתוצאות הראשוניות כמשוב כדי ליידע על דילולים עתידיים של דגימות.
         הערה: מתלה מעונן הוא בדרך כלל מרוכז מדי.
   4. טען את דגימת המוביל הראשונה על הציטומטר והתחל להקליט.
   5. השווה ספירת אירועים הנובעת הן מערוצי SSC והן מערוצי פלואורסצנציה; אלה צריכים להיות שווים בערך (הבדל של <10%). אם לא, בדוק את הגדרות הציטומטר, לדוגמה, הגדרות שפופרת פוטומולטיפלייר (PMT) ועוצמת לייזר עבור ערוץ הפלואורסצנט. לחלופין, השתמש בשיטות אחרות כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לאמת שהתיוג הפלואורסצנטי של הנשאים קיים ואחיד.
   6. חזור על שלבים 2.1.3-2.1.5 פעמיים נוספות או יותר עם דילולים שונים מהמניה. ודא שספירת האירועים בכל מדגם גבוהה לפחות בסדר גודל אחד מספירת אירועי הרקע.
   7. ודא ששלוש דגימות או יותר מראות מגמה ליניארית, כלומר, דילול דגימה כפול אמור לגרום להפחתה מקבילה פי שניים בריכוז הנשא הנמדד.
   8. השתמש בדגימות בטווח הליניארי, בגורמי הדילול המתאימים ובקצב זרימת הציטומטר הידוע כדי לחשב את ריכוז נשא המניות על פי משוואה (1):
      (1)
      כאשר C הוא ריכוז המוביל במנשאים/מ"ל. מומלץ להשתמש בספירת האירועים הנגזרת מזיהוי פיזור אופטי ולא פלואורסצנטיות.
2. קריאת ציטומטריה של זרימה של ניסוי תא נשא, כולל קביעת עוצמת פלואורסצנטיות לכל נשא
   הערה: באופן אידיאלי, עוצמת הפלואורסצנט לכל נשא תיקבע קרוב ככל האפשר לניסוי בתא הנשא. זאת כדי להבטיח שניתן להשוות ישירות את ה- MFIs המתקבלים עבור נשאים בודדים ל- MFIs של תאים הקשורים לנשאים. בפועל, ציטומטר בדרך כלל יפיק תוצאות דומות כאשר משתמשים בו בימים רצופים באמצעות אותם מתחי PMT, אך לא ניתן להבטיח זאת.
   1. תכנן את הניסוי בתא הנשא. השתמש בריכוז המוביל שנקבע בשלב 2.1 כדי לתת את המינון הרצוי של נשאים.
   2. הגדר את ציטומטר הזרימה לניסוי הסופי בתא המוביל על ידי קביעת הגדרות מתח PMT אופטימליות בערוצים הרלוונטיים. הגדר את ערכי הסף כדי לאפשר זיהוי של ספק הרשת.
   3. הפעל את הספקים בהשעיה כדי לקבוע את עוצמת הפלואורסצנטיות לכל מוביל תחת הגדרות PMT הנוכחיות.
   4. במידת הצורך, שנה את ספי הציטומטר כדי לזהות את התאים ולא את הנשאים.
   5. הפעל דגימת בקרה שלילית - תאים שאינם מודגרים עם נשאים - כדי לקבוע את הרקע הפלואורסצנטי (autofluorescence) של התאים.
   6. הפעל את דגימות תאי הנשא כדי לקבוע את עוצמת הפלואורסצנטיות לכל תא. פלואורסצנציה זו היא שילוב ליניארי של אוטופלואורסצנציה תאית ונוכחות של נשאים פלואורסצנטיים.
   7. חשב את מספר הספקים לתא באמצעות המשוואה הבאה (2):
      (2)
      כאשר _{P assoc} הוא מספר הנשאים המשויכים לכל תא, _תא FI הוא MFI של תאים הדוגרים עם נשאים, _רקע FI הוא MFI של תאים שאינם דוגרים עם נשאים, _ונשא FI הוא MFI של נשאים בהשעיה.

3. הזרם הגדול

1. ספירת נשאים: ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים
   הערה: בזרם בתפזורת, ספירת נשאים היא צעד הכרחי לכימות עוצמת הפלואורסצנטיות המוחלטת לכל נשא (ראה שלב 3.1.4). בנוסף, ספירת הנשאים בהשעיה מאפשרת קביעה מדויקת וניתנת לשחזור של מספר הנשאים המודגרים בכל ניסוי תא.
   1. הכנה
      1. הרכב את תא הזרימה על מודול הלייזר ונעל את כל מודול הלייזר במקומו בתוך המכשיר.
      2. לאט (לא מהר יותר מ 0.1 מ"ל / שנייה) לשטוף את תא הזרימה עם ~ 1 מ"ל של מים מזוקקים. אם נוצרות בועות בתוך תא הזרימה, חזור על המתלה באופן חלקי כדי למזג את הבועה עם ממשק האוויר-נוזל לפני שתמשיך.
      3. הפעל את המצלמה בערך באמצע ההדחה; הקפד לאשר כי פסולת המוביל נשטף החוצה. בחר לכידה כדי לפתוח את הגדרות לכידה לחץ על הכרטיסייה ולחץ התחל מצלמה.
      4. יבש את המערכת עם 1 מ"ל של אוויר. אם נשאים סטטיים כלשהם נראים על המסך, נקה את תא הזרימה בהתאם להוראות היצרן.
      5. הכן את הנשאים לניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים על-ידי הבטחה שהנשאים תלויים היטב באמצעות מערבולת או סוניקציה, בהתאם למערכת הנשאים המעורבת. אם סדר הגודל של ריכוז המניה אינו ידוע, הכן דילול של 1:100 מהמלאי והשתמש בתוצאות הראשוניות כמשוב כדי להודיע על דילולי מדגם עתידיים. לדלל את הנשאים במים ולא במלח עם אגירת פוספט (PBS) כדי להכין לפחות ~ 0.6-1 מ"ל מכל דגימה עם ריכוז נשא בין 1 × 10⁷ נשאים / מ"ל ו 1 × 10^{9 נשאים} / מ"ל.
         הערה: מתלה מעונן הוא בדרך כלל מרוכז מדי. חוצצים ומלחים יכולים ליצור רעשי רקע גבוהים.
   2. מדידה
      1. הוציאו את מודול הלייזר והניחו אותו זקוף.
      2. צייר את מדגם המוביל הראשון לתוך מזרק 1 מ"ל. חבר את המזרק לכניסת הצינור וטען בזהירות את הדגימה לתא הזרימה. אם נוצרות בועות בתוך תא הזרימה, חזור על המתלה באופן חלקי כדי למזג את הבועה עם ממשק האוויר-נוזל לפני שתמשיך. ודא שתא הזרימה כולו מלא בנוזל, ולאחר מכן השהה.
      3. כוונן את מיקוד המצלמה במידת הצורך כדי לדמיין ספקים בודדים. בצע כוונוני מיקוד גסים באמצעות הידית המסתובבת בצד ימין של המכשיר. בצע התאמות עדינות יותר על-ידי בחירה בכרטיסיה חומרה | משאבות/במה. שנו את המיקוד על-ידי התאמת המחוון ' מיקוד' .
      4. כוונן את רמת המצלמה כדי לוודא שאין פיזור יתר. בכרטיסייה ' לכידה' , בחר את רמת המצלמה האופטימלית על-ידי כוונון המחוון.
      5. אם המכשיר מצויד באביזר זה, טען את המזרק המכיל את דגימת המוביל לתוך משאבת המזרק כדי להבטיח זרימת דגימה רציפה במהלך המדידות.
      6. תחת הכרטיסייה SOP , בחר מדידה רגילה כדי לבצע חמש לכידות של 30 שניות כל אחת. הזן את שם הקובץ Base , ואם תרצה, הוסף מידע נוסף לדוגמה על-ידי לחיצה על הלחצן Advanced (הפותח דיאלוג מודאלי עם מגוון אפשרויות).
         הערה: אם הוזן מקדם דילול, מדידת ריכוז הספק הסופית תותאם באופן אוטומטי על-ידי התוכנה. הזנת גורם זה מומלצת נגד. במקום זאת, בצע את ההתאמה באופן ידני, מה שמקל על הניתוח ומאפשר להעריך אם כל דילול נופל בטווח הדינמי של המכשיר (שלב 3.1.3.4).
      7. לחץ על צור והפעל סקריפט והמתן עד שיופיע חלון קופץ המבקש אנא דוגמה מראש.
      8. אם אתה משתמש במשאבת המזרק, בחר בכרטיסייה חומרה | כרטיסיית משאבת מזרק | הגדר את קצב העירוי על 30-80 ולחץ על Infuse. אם אינך משתמש במשאבת המזרק, קדם את הדגימה באופן ידני.
      9. בחלון המוקפץ, בחר אישור כדי להתחיל ללכוד. לאחר כל אחת מחמש הלכידות, כאשר החלון הקופץ נא מראש מופיע שוב, בדוק שהדגימה עדיין נעה בתא הזרימה, באופן ידני או באמצעות משאבת המזרק. לאחר מכן, בחר אישור כדי להמשיך עם הלכידה הבאה.
         הערה: לאחר חמש לכידות, התוכנה פותחת באופן אוטומטי את הכרטיסייה תהליך ופותחת חלון קופץ המבקש להתאים את הגדרות התהליך.
   3. ניתוח
      1. בכרטיסיה תהליך , התאם את המחוון סף זיהוי (בין 4 ל- 8) כדי לזהות נכונה ספקים נפרדים הנראים על המסך. התאם גם את רווח המסך כדי לסייע בהדמיה; זה לא ישפיע על הניתוח במורד הזרם. השתמש במחוון שמתחת למסך הלכידה כדי לגלול בין מסגרות מרובות של הווידאו כדי לסייע בהגדרת סף הזיהוי.
         הערה: יש להגדיר את סף הזיהוי פעם אחת, ולאחר מכן אין לשנותו בין מדידות או דגימות.
      2. בחלון המוקפץ (הערה לאחר שלב 3.1.2.9), לחץ על אישור כדי להתחיל בניתוח מעקב. עקוב אחר התקדמות הניתוח על ידי לחיצה על הכרטיסיה ניתוח | הכרטיסיה 'ניתוח יחיד '.
      3. לאחר סיום הניתוח, חפשו בקשה לייצוא קביעות , שבה יש לבחור כברירת מחדל באפשרות ' כלול PDF ' ו'כלול סיכום ניסוי' . בחר תבניות ייצוא אחרות כרצונך.
      4. במקטע 'תוצאות ' של ייצוא נתוני PDF, כדי לוודא שהריכוז שנמדד אמין, ודא שריכוז המוביל הנמדד הוא בין 1 × 10⁷ נשאים/מ"ל לבין 1 × 10⁹ נשאים/מ"ל - הטווח הדינמי של המכשיר - ובדוק אם יש הודעות שגיאה או הודעות אזהרה מתחת לתוצאת מדידת הריכוז.
      5. חזור על שלבים 3.1.2.1-3.1.3.4 פעמיים או יותר עם דילולים שונים מהמניה. ודא שהריכוז של כל דגימה נמצא בטווח הליניארי של המכשיר.
      6. בחר שלוש דגימות או יותר המציגות מגמה ליניארית, כלומר, דילול דגימה כפול אמור לגרום להפחתה מקבילה פי שניים בריכוז המוביל הנמדד. השתמש בדגימות שנבחרו ובגורמי הדילול המתאימים כדי לחשב את ריכוז המוביל במלאי.
   4. קביעת עוצמת הפלואורסצנציה המוחלטת לכל נשא
      הערה: מכיוון שלא ניתן לאפיין ישירות את הפלואורסצנטיות של נשאים בודדים בזרם זה, עוצמת הפלואורסצנציה מכמתת בכמויות גדולות. שיטה זו מסתמכת על העובדה שעוצמת הפלואורסצנציה קשורה באופן ליניארי לריכוז הפלואורוכרום על פי חוק למברט-באר. כאשר כימות כזה בתפזורת של נשאים בהשעיה נעשה על השעיה של ריכוז נשאים ידוע (ראה שלב 3.1), ניתן לגזור את הפלואורסצנטיות לכל מוביל. שלב זה יכול להיעשות על קורא לוחות פלואורסצנטיים או ספקטרופלואורומטר. עוצמת הפלואורסצנציה מושווית לעקומה סטנדרטית של דגימות עם פלואורסצנציה מוחלטת ידועה, הנתונה במספר MESFsf.
      1. השתמש בתמיסה של הפלואורוכרום החופשי כדי לסמן את המנשא: השהה את הצבע במאגר המתאים (לדוגמה, DMSO) ובצע דילולים נוספים באותו חיץ כמו דילול המנשא. לחלופין, השתמש בתמיסה של נוגדן המצומד לפלואורוכרום. חשב את ריכוז תמיסת המניות (MESF/mL) מהריכוז ב-mg/mL, את המשקל המולקולרי ב-mg/mole ואת המספר של אבוגדרו באמצעות משוואה (3). בצע דילול סדרתי במדלל המוביל כדי ליצור דגימות עקומה סטנדרטיות.
         (3)
         הערה: השתמש בנוגדן מצומד פלואורוכרום רק אם מידת התווית, כלומר היחס הטוחן בין הפלואורוכרום לנוגדן בתמיסה, ידועה. בתחילה, ליצור עקומה סטנדרטית עם טווח רחב, כמו עוצמת פלואורסצנטיות של מדגם המוביל עדיין לא ידוע. מכאן, צמצמו אותו כך שיכלול את הטווח הנדרש.
      2. הכן את דוגמאות המוביל.
         הערה: השיטה המומלצת היא לבדוק שני דילולים של נשאים או יותר כדי לוודא שהמדידות הן ליניאריות ונמצאות בטווח של העקומה הסטנדרטית.
      3. מדוד את הפלואורסצנטיות של נפחים שווים של כל דגימה, כלומר, הן עקומות נשא והן עקומות סטנדרטיות.
      4. צור עקומה סטנדרטית ונקה את עוצמת הפלואורסצנטיות המוחלטת בתפזורת ב- MESF/mL עבור דגימות הנשא שנמדדו.
      5. חישוב עוצמת הפלואורסצנציה המוחלטת לכל נשא (MESF/carrier) על ידי חלוקת הפלואורסצנציה בתפזורת (MESF/mL) בריכוז המוביל (נשאים/מ"ל) כמו במשוואה (4):
         (4)
   5. ניסוי תאי (כולל קביעת עוצמת פלואורסצנציה שוות ערך לכל נשא)
      הערה: בשלב זה, חרוזי כמות של ציטומטריה של זרימה משמשים ליצירת עקומה סטנדרטית של הקשר בין MESF ל- MFI. חרוזים כמותיים אלה מורכבים מאוכלוסיות חרוזים מרובות עם מספר ידוע של MESF לכל חרוז, וחרוזים בודדים אלה יכולים להיות מזוהים על ידי כל ציטומטר. באופן אידיאלי, העקומה הסטנדרטית של MESF נקבעת במקביל לקריאת הניסויים בתאי הנשא. זאת כדי להבטיח שניתן להשוות ישירות את ערכי ה- MFI המחושבים עבור נשאים בודדים ל- MFI של תאים הקשורים לנשאים. בפועל, ציטומטר בדרך כלל יפיק תוצאות דומות כאשר משתמשים בו בימים רצופים באמצעות אותם מתחי PMT, אך לא ניתן להבטיח זאת.
      1. תכנן את הניסוי בתא הנשא. השתמש בריכוז המוביל שנקבע בסעיף 3.1.3 כדי לתת את המינון הרצוי של נשאים.
      2. הגדר את ציטומטר הזרימה לניסוי הסופי בתא המוביל על ידי קביעת הגדרות מתח PMT אופטימליות בערוצים הרלוונטיים.
      3. הפעל דגימת בקרה שלילית, כלומר, תאים שאינם דוגרים עם נשאים, כדי לקבוע את הפלואורסצנציה ברקע.
      4. הכן והנחה מחדש את חרוזי הכמות של ציטומטריה של זרימה. השתמש באותו מאגר המשמש עבור דגימות התאים (לדוגמה, PBS). אם אוכלוסיות החרוזים מסופקות בנפרד, איחד אותן יחד.
      5. הפעל את דגימת החרוזים הכמותית של ציטומטריה של זרימה.
      6. הפעל את דגימות תאי הנשא כדי לקבוע את עוצמת הפלואורסצנטיות לכל תא.
      7. השתמש בדגימת החרוזים הכמותית כדי ליצור עקומה סטנדרטית הממירה את עוצמת הפלואורסצנציה המוחלטת (MESF) ל- MFI. השתמש בעקומה סטנדרטית זו ובתוצאות משלב 3.1.4 כדי לחשב את ה- MFI התיאורטי של הספקים. חישוב מספר הנשאים לתא באמצעות משוואה (5):
         (5)
         כאשר _{P assoc} הוא מספר הנשאים המשויכים לכל תא, _תא FI הוא MFI של תאים הדוגרים עם נשאים, _רקע FI הוא MFI של תאים שאינם דוגרים עם נשאים, _ונשא FI הוא ה- MFI המחושב של נשאים בהשעיה (שלב 3.1.4).

תוצאות

כפי שנדון קודם לכן, סוגים שונים של מובילי תרופות דורשים שימוש בטכניקות שונות לכימות מוחלט של שיוך נשא תא. לדוגמה, חלקיקי מעטפת הליבה של חומצה מתקרילית (חומצה מתקרילית) (_{PMA SH}) מיוצבים על ידי דיסולפיד של 633 ננומטר הם גדולים וצפופים מספיק לזיהוי באמצעות ציטומטר זרימה רגיש. ככאלה, החלקיקים ...

Discussion

אפיון יחסי הגומלין בין מובילי תרופות ותאים הופך לחשוב יותר ויותר בפיתוח מערכות אספקת תרופות חדשניות. באופן ספציפי, כדי לאפשר הערכה רציונלית והשוואה של מבני נשאים שונים, כימות מוחלט של הביצועים של המוביל האמור כדי לקיים אינטראקציה עם תאי מטרה ותאי מטרה הוא קריטי. פרוטוקול זה מתאר מתודולוג?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide	Invitrogen	A20347	pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies
Apogee A50 Microflow	Apogee		Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting
CytoFLEX S Flow Cytometer	Beckman Coulter		Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments
FCS Express	De Novo Software		Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python
Infinite 200 PRO	Tecan Lifesciences		Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution
LSRFortessa Cell Analyzer	BD Biosciences		Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment
NanoSight NS300	Malvern Panalytical		Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis
Prism 8	GraphPad		Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others
Quantum MESF kits Alexa Fluor 647	Bangs Laboratories	647	Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard