זיהוי מטרות מבוסס Aptamer המתאפשר על ידי תגובת הגברה מעריכית איזותרמית G-Quadruplex תלת-שלבית

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מדגים את השימוש בבדיקת הגברה מעריכית מהירה, תלת שלבית, מבוססת אפטמר כדי לזהות מטרות. הכנת דגימות, הגברת אותות ופיתוח צבע מכוסים כדי ליישם מערכת זו כדי לזהות נוכחות של תיאופילין על פני זה של קפאין.

Abstract

Aptamers הן מולקולות זיהוי מטרה שנקשרות עם זיקה גבוהה וספציפיות. ניתן למנף מאפיינים אלה כדי לשלוט במולקולות אחרות בעלות יכולת יצירת אותות. עבור המערכת המתוארת כאן, זיהוי מטרה באמצעות תחום אפטמרי, Stem II של ריבוזימי ראש פטיש שונה, מפעיל את הריבוזיום המתבקע מעצמו על ידי ייצוב המבנה הבלתי מובנה הראשוני. הרנ"א החותך פועל בצומת של גזע III וגבעול I, ויוצר שני תוצרי מחשוף. מכפלת המחשוף הארוכה יותר יוצרת תגובת הגברה מעריכית איזותרמית (EXPAR) של שני מרובעי G פעילים קטליטית דומים. תוצרי ההגברה המתקבלים מזרזים הפחתת פרוקסידאז, המשולבת להפחתה של מצע קולורימטרי עם פלט שהעין הבלתי יכולה לזהות. המערכת בת 3 החלקים המתוארת במחקר הנוכחי משפרת את שיטות הזיהוי כגון בדיקות אימונוסורבנטיות מקושרות אנזימים (ELISAs) על ידי הפקת אות חזותי הניתן לזיהוי לציון נוכחות של תאופילין נמוך עד 0.5 מיקרומטר תוך 15 דקות בלבד.

Introduction

Aptamers הם בדרך כלל DNA חד גדילי או RNA שנבחר בתהליך אבולוציוני עם זיקה גבוהה קישור וספציפיות למטרות הרצויות¹. בנוסף ליכולת הקשירה, ניתן לקשר ולשלוט במוטיבים של אות^{פלט 2,3,} להגביר את האות האמור ולשפר את רגישות המערכת. מערכת G-quadruplex איזותרמית מעריכית מעריכית (GQ-EXPAR) היא מערכת בת שלושה חלקים (איור 1) המפתחת אות חזותי כאשר רכיבים עוקבים מתווספים לכלי תגובה יחיד כדי להפיק פלט חזותי⁴. מערכת זו מאפשרת זיהוי של מטרה ספציפית, להלן תיאופילין, בדגימה נתונה תוך 15 דקות באמצעות זרימת עבודה יעילה המאפשרת זיהוי מהיר וספציפי של מטרה מעניינת. יש לשקול שיטה זו עבור דגימות שבהן כימות ספציפי של ריכוז המטרה הוא חשש נמוך יותר מאשר ספציפיות גבוהה של התגובה בזמן קצר.

ריבומתג אלוסטרי, מולקולת RNA מחליפת מבנה (ריבוזים) שעוברת פיצול עצמי, מייצרת את האות הראשוני. מבנה זה מבוסס על ריבוזימי ראש פטיש, עם תחום אפטמרי שהוכנס בגזע II כמווסת של פעילות המחשוף. פונקציית המחשוף העצמי שלו מופעלת כאשר התחום האפטמרי שלו מיוצב על קשירה למטרה⁵. אחרת, המתג אינו פעיל במצבו המקורי.

תגובת ההגברה המעריכית העוקבת (EXPAR) משתמשת בשחרור גדיל הרנ"א העצמי מהשלב הראשון לתגובת הגברה איזותרמית⁶. תוצר ההגברה של EXPAR הוא בעל פעילות פרוקסידז⁷, הפועל כבסיס לשלב האחרון של המערכת. כאשר חלק מהמצעים מחומצנים בשילוב עם פירוק מי חמצן, הם מייצרים פלט פלואורסצנטי שניתן למדוד על מכשור שונה. ניתן להחליף מצעים נפוצים אחרים כדי לייצר מוצר צבעוני לזיהוי חזותי. EXPAR ופעילות הפרוקסידז של מוצרי ההגברה שלה פועלים כמשפר אותות דו-שלבי, ומגבירים את הרגישות לרמות גבוהות יותר בהשוואה לאסטרטגיות קונבנציונליות ^7,8.

הזיהוי של תאופילין לעומת קפאין משמש כדוגמה לספציפיות של פלטפורמת הזיהוי הזו, מאחר שהם נבדלים רק בקבוצת מתיל אחת (איור 2). הדגמה זו של המערכת מייצרת פלט קולורימטרי לזיהוי חזותי של לפחות 500 ננומטר תיאופילין.

Protocol

ראה טבלה משלימה 1 (טבלת מערך התגובה) להכנת הצינור, כולל הנפחים והריכוזים הספציפיים של רכיבי התגובה. הפרוטוקול המוצג כאן משתמש בערכת פלטפורמת זיהוי שהורכבה מראש כמתואר בטבלת החומרים. כל הרכיבים חייבים להישמר על קרח אלא אם צוין אחרת.

1. הכנת ריבוזימים

הערה: רכיב הזיהוי העיקרי הוא ריבוזים אלוסטרי (מווסת אפטמר) המזהה תאופילין (ראה טבלה משלימה 2).

1. יש לאסוף 5U של פולינוקלאוטיד קינאז T4 (0.5 μL, ראו טבלת חומרים) בצינור PCR, אשר ישמש להפעלת תוצרי המחשוף של הריבוזים.
   הערה: רכיב זה נוסף תחילה כדי שהמשתמש יוכל לראות את הניפוק הנכון של האנזים.
2. הוסף 1 μL של חיץ ריבוזימי 5x מוכן מראש (ראה טבלת חומרים) לכל צינור דגימה (צינור PCR).
3. למטרות הדגמה חזותית של ספציפיות, הוסף 1.5 μL של 2 mM תאופילין (מטרה) או 2 mM קפאין (בקרה) (ראה טבלת חומרים) לכל מבחנה כדגימות הבדיקה.
   הערה: לצורך קביעת עקומה סטנדרטית, מומלץ להתחיל באנליזה של 3.125 מילימטר ולבדוק דילול פי חמישה עד 0.001 מילימטר.
4. מערבבים היטב כל צינורית דגימה על ידי פיפטינג 5-10 פעמים.
5. הוסף 2 μL של 600 nM RNA המכיל תחום aptameric ספציפי למטרה (ראה טבלת חומרים) לכל צינור דגימה כדי להגיע לריכוז סופי של 240 nM ב 5 μL של תמיסת בדיקה, ולאחר מכן לערבב במהירות על ידי pipetting ולהניח על בלוק קר כדי למזער את אות הרקע.
   הערה: חשוב להכין תחילה את כל התגובות ללא ריבוזים, שכן תגובת המחשוף העצמי תתחיל מיד כאשר ריבוזים משולב עם חיץ ריבוזימים ועשוי לייצר רקע משמעותי.
6. לאחר הכנת כל צינורות התגובה, יש לדגור על כל דגימה (5 מיקרוליטר) בטמפרטורת החדר (23°C) למשך 3 דקות בדיוק באמצעות טיימר. מיד להחזיר את צינורות הדגימה לקרח (4 ° C) לאחר הדגירה.

2. GQ-EXPAR

1. הוסיפו 3.5 מיקרוליטר של תערובת אנזימים ניקאז-פולימראז (ראו טבלת חומרים) לכל צינור דגימה וערבבו היטב.
   הערה: ריכוזי האנזימים הנדרשים תלויים ברצפי הזיהוי, סוגי האנזימים וטמפרטורות התגובה, שהשילוב ביניהם נקבע אמפירית.
2. הוסף 31.5 μL של תערובת תגובת EXPAR המכילה תבנית, נוקלאוטידים ומאגר תגובה (ראה טבלת חומרים) לכל צינור דגימה ופיפט לערבוב.
   הערה: ריכוזי הרכיבים ממוטבים בהתבסס על האנזימים והרצפים של תוצרי פולימראז.
3. לאחר הכנת כל הדגימות, יש לדגור על כל דגימה מוכנה (40 מיקרוליטר) בטמפרטורה של 55°C למשך 5 דקות בדיוק באמצעות טיימר. אם אפשר, לדגור על thermocycler, אם כי מכסה מחומם הוא מיותר.
4. מיד להחזיר את צינורות הדגימה לקרח (4 ° C) לאחר שלב הדגירה.

3. פיתוח צבע

1. הוסף 2 μL של תמיסת Hemin (25 uM, ראה טבלה של חומרים) לכל צינור דגימה וערבב היטב.
2. הוסף 58 μL של תמיסת TMB הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) לכל שפופרת דגימה וערבב היטב.
3. לדגור על תגובת התפתחות הצבע (100 μL) בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות לפחות ועד 30 דקות.
   הערה: (אופציונלי) ניתן לעצור את התפתחות הצבע על-ידי הוספת 20 מיקרוליטר של חומצה גופרתית בנפח 2 M.
4. קרא את הדגימות באופן איכותי בעין, או כמת את התוצאות באמצעות קורא לוחות ספיגה ב 450 ננומטר אם תגובות התפתחות הצבע נעצרות באמצעות חומצה גופרתית.

תוצאות

פלטפורמת הזיהוי המתוארת באיור 1 ממירה זיהוי מטרה אפטמרי להבדלים חזותיים ברורים בין תכשירי הדגימה (מטרה לעומת מטרה שאינה מטרה, איור 2) בפרק זמן קצר. ריבוזים אלוסטרי שזוהה על ידי Soukup et ^al.5 שימש כנקודת המוצא ליצירת רצף פחות רועש עם תגובה למטרה על פני...

Discussion

השיטה המוצגת כאן מנצלת את המעבר בין מבנה משני לא מסודר בתחילה בריבוזימים אלוסטריים לבין היציבות הנוספת המוענקת באמצעות קשירת המטרה לתחום האפטמרי כדי להפעיל את ריבוזימי ראש הפטיש cis-cranking. יציבות הריבוזים הותאמה כדי למזער את הפעילות הקטליטית בהיעדר המטרה תוך מתן אפשרות לקשירת המטרה לשחזר ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution"	PerkinElmer	FOOD-1806-1000	Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2.
5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3.
5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5x Ribozyme Buffer	Aptagen, LLC	N/A	5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4.
Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit	Aptagen, LLC	GQ-EXPAR-TMB	The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group.
Bst 2.0 DNA polymerase	New England Biolabs	M0537S	Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
Buffer 3.1	New England Biolabs	B6003SVIAL	Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750-100G	Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1.
dNTPs	New England Biolabs	N0447S	Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
EXPAR reaction mixture	Aptagen, LLC	N/A	0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Hemin	Sigma-Aldrich	H9039	Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1.
Isothermal Amplification Buffer	New England Biolabs	B0537SVIAL	Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
MgCl2	Amresco (VWR)	E525-500ML	Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3.
MJ PTC-100 Thermocycler	MJ Research, Inc.	PTC-100	Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used.
N, N-Dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	227056-100ML	Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1.
Nickase-polymerase Mix	Aptagen, LLC	N/A	Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1.
Nt.BstNBI	New England Biolabs	R0607S	Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
T4 Kinase Buffer	New England Biolabs	B0201SVIAL	Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.
T4 polynucleotide kinase	New England Biolabs	M0201S	Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes.
Tecan GENios FL	Tecan	Genios-FL TWT	Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results.
Theophylline	Sigma-Aldrich	T1633-50G	Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2.
Tris-HCl	American Bioanalytical	AB14043-01000	Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.