3단계 G-Quadruplex 등온 지수 증폭 반응에 의해 촉진되는 Aptamer 기반 표적 검출

요약

현재 프로토콜은 표적을 검출하기 위해 빠른 3단계 압타머 기반 지수 증폭 분석의 사용을 보여줍니다. 샘플 준비, 신호 증폭 및 색상 현상은 카페인보다 테오필린의 존재를 인식하기 위해 이 시스템을 구현하기 위해 다룹니다.

초록

압타머는 높은 친화력과 특이성으로 결합하는 표적 인식 분자입니다. 이러한 특성은 신호 생성 능력을 가진 다른 분자를 제어하는 데 활용할 수 있습니다. 본원에 기술된 시스템의 경우, 변형된 귀상어 리보자임의 앱타머 도메인, 줄기 II를 통한 표적 인식은 초기에 구조화되지 않은 구축물을 안정화시킴으로써 자가-절단 리보자임을 활성화시킨다. 시스 절단 RNA는 줄기 III와 줄기 I의 접합부에서 작용하여 두 개의 절단 산물을 생성합니다. 더 긴 절단 생성물은 두 개의 유사한 촉매 활성 G-쿼드러플렉스의 등온 지수 증폭 반응(EXPAR)을 프라이밍합니다. 이러한 결과 증폭 산물은 과산화효소 환원을 촉매하며, 이는 육안으로 감지할 수 있는 출력으로 비색 기질의 환원과 결합됩니다. 본 연구에 설명된 3파트 시스템은 0.5분 이내에 15μM의 낮은 테오필린의 존재를 나타내는 시각적으로 검출 가능한 신호를 생성하여 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)과 같은 검출 방식을 개선합니다.

서문

압타머는 전형적으로 원하는 표적에 대한 높은 결합 친화도 및 특이성을 갖는 진화적 과정을 통해 선택된 단일 가닥 DNA 또는 RNA이다¹. 결합 능력에 더하여, 앱타머는 신호-출력 기능^(2,3)으로 모티프에 연결되고 제어될 수 있으며^, 상기 신호를 증폭하고 시스템의 감도를 향상시킬 수 있다. G-쿼드러플렉스 등온 지수 증폭 반응(GQ-EXPAR) 시스템은^{시각적 출력(}4)을 생성하기 위해 연속적인 구성 요소가 단일 반응 용기에 추가될 때 시각적 신호를 발생시키는 세 부분으로 구성된 시스템(그림 1)입니다. 이 시스템은 관심 표적을 빠르고 구체적으로 검출할 수 있도록 간소화된 워크플로우를 사용하여 주어진 샘플에서 특정 표적(여기서는 테오필린)을 15분 이내에 검출할 수 있습니다. 이 방법은 목표 농도의 특정 정량화가 짧은 시간 내에 반응의 높은 특이성보다 낮은 관심사인 샘플에 대해 고려되어야 합니다.

자기 절단을 겪는 구조 전환 RNA 분자(리보자임)인 알로스테릭 리보스위치(allosteric riboswitch)가 초기 신호를 생성합니다. 이 구조는 귀상어 리보자임을 기반으로 하며, 절단 활성의 조절자로서 Stem II에 도입된 앱타머 도메인이 있습니다. 그것의 자기 분열 기능은 그것의 압타머 도메인이 그것의 표적에 결합할 때 안정화될 때 활성화된다⁵. 그렇지 않으면 스위치가 기본 상태에서 비활성 상태가 됩니다.

후속 지수 증폭 반응(EXPAR)은 첫 번째 단계에서 자가 절단된 RNA 가닥의 방출을 사용하여 등온 증폭 반응⁶을 프라이밍합니다. EXPR의 증폭 산물은 시스템의 마지막 단계의 기초로 작용하는 과산화효소 활성⁷을 갖는다. 일부 기질이 과산화물 분해와 함께 산화되면 다양한 기기에서 측정할 수 있는 형광 출력이 생성됩니다. 다른 일반적인 기질은 시각적 검출을 위한 착색된 생성물을 생산하기 위해 대체될 수 있다. EXPAR 및 이의 증폭 산물의 과산화효소 활성은 2단계 신호-증강제로서 작용하여, 종래의 전략에 비해 더 높은 수준에 대한 민감도를 증가시킨다 ^7,8.

테오필린 대 카페인의 검출은 단일 메틸기만 다르기 때문에 이 검출 플랫폼의 특이성의 예로 사용됩니다(그림 2). 이 시스템 시연은 최소 500nM 테오필린의 시각적 검출을 위한 비색 출력을 생성합니다.

프로토콜

반응 성분의 특정 부피 및 농도를 포함하는 튜브 준비에 대해서는 보충 표 1 (반응 설정표)을 참조하십시오. 여기에 설명된 프로토콜은 재료 표에 설명된 대로 사전 조립된 검출 플랫폼 키트를 사용합니다. 달리 명시되지 않는 한 모든 구성 요소는 얼음 위에 보관해야 합니다.

1. 리보자임의 제조

참고: 1차 검출 성분은 테오필린을 인식하는 알로스테릭(압타머 조절) 리보자임입니다( 보충 표 2 참조).

1. PCR 튜브에 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 5U(0.5μL, 재료 표 참조)를 수집하여 리보자임 절단 산물을 활성화하는 데 사용합니다.
   알림: 이 구성 요소가 먼저 추가되어 사용자가 효소의 올바른 분배를 볼 수 있습니다.
2. 미리 준비된 5x 리보자임 완충액( 재료 표 참조) 1μL을 각 샘플 튜브(PCR 튜브)에 추가합니다.
3. 특이성을 시각적으로 입증하기 위해 1.5μL의 2mM 테오필린(표적) 또는 2mM 카페인(대조군)( 재료 표 참조)을 각 샘플 튜브에 테스트 샘플로 추가합니다.
   참고: 표준 곡선을 설정하려면 3.125mM 분석물에서 시작하여 0.001mM까지 5배 희석을 테스트하는 것이 좋습니다.
4. 각 샘플 튜브를 5-10회 피펫팅하여 완전히 혼합합니다.
5. 표적에 특이적인 앱타머 도메인을 포함하는 600nM RNA 2μL( 재료 표 참조)를 각 샘플 튜브에 추가하여 5μL의 테스트 용액에 240nM의 최종 농도를 만든 다음 피펫팅으로 빠르게 혼합하고 콜드 블록에 올려 배경 신호를 최소화합니다.
   참고: 리보자임이 리보자임 완충액과 결합될 때 자가 절단 반응이 즉시 시작되고 상당한 배경을 생성할 수 있으므로 초기에 리보자임 없이 모든 반응을 준비하는 것이 중요합니다.
6. 모든 반응 튜브가 준비되면 타이머를 사용하여 각 샘플(5μL)을 실온(23°C)에서 정확히 3분 동안 배양합니다. 배양 후 즉시 샘플 튜브를 얼음(4°C)으로 되돌립니다.

2. GQ-익스프레스

1. 3.5 μL의 nickase-polymerase 효소 혼합물( 재료 표 참조)을 각 샘플 튜브에 넣고 잘 섞습니다.
   참고: 필요한 효소 농도는 인식 서열, 효소 유형 및 반응 온도에 따라 달라지며, 이들의 조합은 경험적으로 결정되었습니다.
2. 주형, 뉴클레오티드 및 반응 완충액( 재료 표 참조)을 포함하는 EXPAR 반응 혼합물 31.5μL을 각 샘플 튜브와 피펫에 추가하여 혼합합니다.
   참고: 성분 농도는 중합효소 생성물의 효소 및 서열에 따라 최적화됩니다.
3. 모든 샘플이 준비되면 타이머를 사용하여 정확히 5분 동안 55°C에서 준비된 각 샘플(40μL)을 배양합니다. 가능하면 가열 된 뚜껑이 필요하지 않지만 thermocycler에서 배양하십시오.
4. 배양 단계 후 즉시 샘플 튜브를 얼음(4°C)으로 되돌립니다.

3. 발색

1. 각 샘플 튜브에 2 μL의 헤민 용액 (25 uM, 재료 표 참조)을 넣고 잘 섞는다.
2. 시중에서 판매되는 TMB 용액 58μL( 재료 표 참조)를 각 샘플 튜브에 넣고 잘 섞습니다.
3. 발색 반응물(100μL)을 실온에서 최소 3분 및 최대 30분 동안 배양합니다.
   참고: (선택 사항) 20μL의 2M 황산을 추가하여 발색을 중지할 수 있습니다.
4. 샘플을 눈으로 정성적으로 판독하거나 황산을 사용하여 발색 반응이 중단된 경우 450nm에서 흡광도 플레이트 리더를 사용하여 결과를 정량화합니다.

결과

그림 1 에 묘사된 검출 플랫폼은 앱타머 표적 인식을 단기간에 시료 전처리(표적 대 비표적, 그림 2) 간의 시각적으로 뚜렷한 차이로 변환합니다. Soukup et ^al.5 에 의해 확인된 알로스테릭 리보자임은 대조군 및 음성 샘플에 대한 표적에 대한 반응으로 덜 잡음이 적은 서열을 생성하기 위한 출발점 역할을 했습니다. 최적화된 구조는 30분 ...

토론

여기에 제시된 방법은 알로스테릭 리보자임에서 초기에 무질서한 2차 구조와 시스 절단 귀상어 리보자임을 활성화하기 위해 앱타머 도메인에 대한 표적의 결합을 통해 부여된 추가 안정성 사이의 전이를 이용합니다. 리보자임의 안정성은 표적 결합이 활성 구조를 복원하도록 허용하면서 표적의 부재 하에서 촉매 활성을 최소화하도록 조정되었다. 또한 EXPAR 및 발색을 촉진하는 데 필요한 여러 효...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution"	PerkinElmer	FOOD-1806-1000	Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2.
5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3.
5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5x Ribozyme Buffer	Aptagen, LLC	N/A	5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4.
Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit	Aptagen, LLC	GQ-EXPAR-TMB	The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group.
Bst 2.0 DNA polymerase	New England Biolabs	M0537S	Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
Buffer 3.1	New England Biolabs	B6003SVIAL	Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750-100G	Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1.
dNTPs	New England Biolabs	N0447S	Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
EXPAR reaction mixture	Aptagen, LLC	N/A	0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Hemin	Sigma-Aldrich	H9039	Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1.
Isothermal Amplification Buffer	New England Biolabs	B0537SVIAL	Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
MgCl2	Amresco (VWR)	E525-500ML	Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3.
MJ PTC-100 Thermocycler	MJ Research, Inc.	PTC-100	Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used.
N, N-Dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	227056-100ML	Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1.
Nickase-polymerase Mix	Aptagen, LLC	N/A	Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1.
Nt.BstNBI	New England Biolabs	R0607S	Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
T4 Kinase Buffer	New England Biolabs	B0201SVIAL	Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.
T4 polynucleotide kinase	New England Biolabs	M0201S	Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes.
Tecan GENios FL	Tecan	Genios-FL TWT	Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results.
Theophylline	Sigma-Aldrich	T1633-50G	Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2.
Tris-HCl	American Bioanalytical	AB14043-01000	Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.