JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מתארים שיטה ציטומטרית חדשנית לזרימה לבידוד פרוספקטיבי של אריתרואיד יחידה יוצרת התפרצות מוקדמת (BFU-e) ואריתרואיד יחידה יוצרת מושבה (CFU-e) ישירות ממח עצם וטחול טריים של עכבר. פרוטוקול זה, שפותח על סמך נתוני תעתיק חד-תאיים, הוא הראשון לבודד את כל אבות האריתרואידים של הרקמה בטוהר גבוה.

Abstract

אבות אריתרואידים מוקדמים הוגדרו במקור על ידי פוטנציאל יצירת המושבה שלהם במבחנה וסווגו ל"יחידות" יוצרות התפרצויות ויוצרות מושבות הידועות בשם BFU-e ו- CFU-e. עד לאחרונה, שיטות לבידוד פרוספקטיבי ישיר ומלא של אבות טהורים של BFU-e ו- CFU-e ממח עצם של עכבר בוגר שבודד זה עתה לא היו זמינות. כדי להתמודד עם פער זה, נותח מערך נתונים חד-תאי של RNA-seq (scRNAseq) של מח עצם עכבר לביטוי גנים המקודדים עבור סמני פני השטח של התא. ניתוח זה שולב עם מבחני גורל התא, ואיפשר פיתוח של גישה ציטומטרית חדשנית לזרימה המזהה ומאפשרת בידוד של תת-קבוצות שלמות וטהורות של אבות BFU-e ו-CFU-e במח עצם או טחול של עכבר. גישה זו מזהה גם תת-קבוצות אבות אחרות, כולל תת-קבוצות מועשרות עבור תאים בזופיליים/פיטום ופוטנציאלים מגה-קריוציטיים. השיטה כוללת תיוג של תאי מח עצם או טחול טריים עם נוגדנים המכוונים לקיט ו-CD55. אבות אבות המבטאים את שני הסמנים הללו מחולקים לאחר מכן לחמש אוכלוסיות עיקריות. אוכלוסייה 1 (P1 או CFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105 med/high CD71 med/high) מכילה את כל אבות ה-CFU-e ועשויה להיות מחולקת ל-P1-low (CD71 med CD150גבוה) ו-P1-hi (CD71גבוה CD150נמוך), המתאים ל-CFU-e מוקדם ומאוחר, בהתאמה; אוכלוסייה 2 (P2 או BFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105med/high CD71נמוך CD150 גבוה) מכילה את כל אבות ה-BFU-e; אוכלוסייה P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49f med/גבוה CD105 med/נמוך CD150נמוך CD41 נמוך) מועשרת עבור אבות אבזם של תאי בזופיל/פיטום; אוכלוסייה 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150גבוה CD41+) מועשרת עבור אבות מגה-קריוציטים; ואוכלוסיה 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150גבוה CD41-) מכילה אבות עם אריתרואיד, תא בזופיל/פיטום, ופוטנציאל מגה-קריוציטי (EBMP) ואריתרואיד/מגה-קריוציטית/בזופילים רב-פוטנציאליים (MPPs). גישה חדשנית זו מאפשרת דיוק רב יותר בעת ניתוח אריתרואידים ואבות המטופויאטיים אחרים וגם מאפשרת התייחסות למידע תעתיק עבור כל אוכלוסייה מוגדרת ציטומטרית של זרימה.

Introduction

ניתן לחלק את אריתרופואזיס לשני שלבים עיקריים: אריתרופואזיס מוקדם והבחנה סופנית אריתרואידית (איור 1)1,2,3. באריתרופויאזיס מוקדם, תאי גזע המטופויאטיים מתחייבים לשושלת האריתרואידים ומולידים אבות אריתרואידים מוקדמים, שזוהו לראשונה בשנות השבעים בהתבסס על פוטנציאל יצירת המושבה שלהם בתווך מוצק למחצה 4,5,6,7,8,9 . באופן כללי, אבות אריתרואידים מחולקים לשתי קטגוריות: אבות קדמונים יותר שכל אחד מהם מוליד "פרץ" (צבר גדול של אשכולות תאים אריתרואידים קטנים יותר), הנקראים "אריתרואיד יחידה יוצר פרץ" או BFU-e 4,5,6; וצאצאיהם, שכל אחד מהם יוצר אשכול או מושבה בודדים וקטנים של תאי אריתרואיד, הנקראים "אריתרואיד יחידה יוצרת מושבה" או CFU-e 7,8,9. BFU-e ו-CFU-e עדיין לא מבטאים גנים אריתרואידים סופניים ואינם ניתנים לזיהוי מורפולוגית. לאחר מספר חלוקות תא של התחדשות עצמית או התפשטות, ה-CFU-e עובר מתג שעתוק שבו מושרים גנים אריתרואידיים כגון גלובין, ובכך עובר להתמיינות מסוף אריתרואידים (ETD)1,10. במהלך ETD, אריתרובלסטים עוברים שלוש עד חמש חלוקות תאי התבגרות לפני שהם מתאחדים ליצירת רטיקולוציטים, אשר מבשילים לתאים אדומים.

אריתרובלסטים במהלך התמיינות סופנית סווגו במקור על סמך המורפולוגיה שלהם לפרואריתרובלסטים, בזופיליים, פוליכרומטיים ואורתוכרומטיים. הופעתה של ציטומטריה של זרימה אפשרה את המיון והבידוד הפרוספקטיביים שלהם בהתבסס על גודל התא (שנמדד על ידי פיזור קדימה, FSC) ושני סמני פני השטח של התא, CD71 ו-Ter11911,12,13 (איור 1). זרימה זו וגישות ציטומטריות דומות14 חוללו מהפכה בחקר ההיבטים המולקולריים והתאיים של ETD, ומאפשרות ניתוח ספציפי לשלב התפתחותי של אריתרובלסטים in vivo ו- in vitro 10,15,16,17,18,19,20. גישת CD71/Ter119 משמשת כיום באופן שגרתי בניתוח של מבשרי אריתרואידים.

עד לאחרונה, גישה ציטומטרית דומה ונגישה לזרימה לבידוד פרוספקטיבי ישיר וטהור של CFU-e ו-BFU-e מרקמת עכבר חמקה מהחוקרים. במקום זאת, חוקרים השתמשו באסטרטגיות ציטומטריות זרימה המבודדות רק חלק קטן מאבות אבותיהם, לעתים קרובות בנוכחות תאים שאינם אריתרואידים המטהרים יחד בתוך אותן תת-קבוצות ציטומטריות של זרימה21. כתוצאה מכך, החקירה של BFU-e ו- CFU-e הוגבלה למערכות הבחנה חוץ גופית הגוזרות ומגבירות את BFU-e ו- CFU-e מאבות מח עצם קודמים. לאחר מכן ניתן ליישם אסטרטגיות ציטומטריות של זרימה המבדילות בין CFU-e ל-BFU-e בתרביות מועשרות באב אריתרואידי22,23. גישה חלופית עושה שימוש ב- CFU-e ו- BFU-e עובריים, המועשרים מאוד בחלק Ter119-שלילי של כבד העובר של העכבר באמצע ההיריון 10,24,25. עם זאת, אף אחת מהגישות הללו אינה מאפשרת לחקור BFU-e ו-CFU-e בוגרים במצבם הפיזיולוגי in vivo. ניתן להעריך את גודל האתגר כאשר נזכרים כי בהתבסס על מבחני היווצרות מושבה, תאים אלה נמצאים במח העצם הבוגר בתדירות של 0.025% ו-0.3% בלבד,בהתאמה 6.

הפרוטוקול המתואר כאן הוא גישה ציטומטרית חדשנית של זרימה המבוססת על אנליזה של תעתיק חד-תאי של תאי מח עצם של עכבר Kit+ שזה עתה נקטפו (הערכה מתבטאת על ידי כל אוכלוסיות האב הקדום של מח העצם)1. הגישה שלנו מכילה כמה סמני פני שטח של תאים שכבר היו בשימוש על ידי Pronk et al.21,26. תעתיקים חד-תאיים שימשו לקביעת שילובים של סמני פני השטח של התא שמזהים אריתרואידים ואבות המטופויאטיים מוקדמים אחרים (איור 2). באופן ספציפי, חלק CD55+ של תאי Kit+ שליליים לשושלת (Lin-) עשוי להיות מחולק לחמש אוכלוסיות, ששלוש מהן מניבות מקטעים רציפים של מסלול האריתרואידים (איור 2). הזהויות השעתוק של כל אחת מאוכלוסיות אלה אושרו על ידי מיון, ולאחר מכן על ידי scRNAseq והשלכה של תעתיקים חד-תאיים ממוינים בחזרה למפת התעתיק המקורית (ניתן לחקור את ביטוי הגנים בכל אחת מחמש האוכלוסיות ואת כל מערך הנתונים של מח העצם ב-https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)1 . פוטנציאל גורל התאים של כל אחת מהאוכלוסיות אושר באמצעות מבחני היווצרות מושבות מסורתיים (איור 2), כמו גם בדיקת גורל חד-תאית חדשהבתפוקה גבוהה 1,27. ניתוחים אלה מראים כי הגישה הציטומטרית החדשה של זרימה גורמת לבידוד בטוהר גבוה של כל אבות BFU-e ו- CFU-e של מח עצם וטחול בוגרים טריים. באופן ספציפי, אוכלוסייה 1 (P1) מכילה רק CFU-e ולא אבות המטופויאטיים אחרים, ואוכלוסיה 2 (P2) מכילה את כל אבות BFU-e של מח העצם ומספר קטן של CFU-e אך לא אבות אחרים1. הפרוטוקול המפורט שלהלן מודגם עוד יותר בניסוי לדוגמה בעכברים שהוזרק להם מי מלח או עם ההורמון המגרה אריתרופואזיס אריתרופואיטין (Epo).

Protocol

כל הניסויים נערכו בהתאם לפרוטוקולים של בעלי חיים A-1586 ו-202200017 שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת מסצ'וסטס צ'אן.

הערה: שני פרוטוקולים מפורטים כאן: ראשית, ניתוח ציטומטרי של זרימה (סעיף 1), ואחריו התאמות פרוטוקול למיון ציטומטרי של זרימה (סעיף 2). הפרוטוקול שלהלן משתמש בציטומטר/סדרן זרימה עם 10 ערוצים. הגדרה לדוגמה מופיעה בטבלה 1, המכונה בשלב 1.14.5. ניתן גם להריץ פרוטוקול זה עם תשעה ערוצים בלבד; ראה את המקרא בטבלה 2.

1. ניתוח ציטומטרי זרימה

  1. יש להרדים עכברים בוגרים (בני >6 שבועות) מסוג Balb/C או C57BL6 בשיטה מתאימה שאושרה על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (לדוגמה, שאיפת CO2 ואחריה נקע צוואר הרחם). עבור ניתוח ציטומטרי זרימה, מוח העצם (BM) מעכבר יחיד יהיה מספיק. למיון, מספר העכברים תלוי ביישומים במורד הזרם. תפוקת התאים עבור כל אוכלוסייה ניתנת להלן (שלב 2.3.3).
  2. קציר רקמות:
    1. הכינו 5 מ"ל צינורות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה (FACS) המכילים 3 מ"ל של חיץ צביעה קר (4 מעלות צלזיוס) ("SB5": תמיסת מלח עם אגירת פוספט (PBS), 0.2% אלבומין בסרום בקר (BSA), 0.08% גלוקוז, 5 mM EDTA) על קרח. השתמש בזה כדי למקם רקמות שנקטפו.
    2. הכינו צינורות נפרדים לכל רקמה המנותקת מכל עכבר. אין לאגד רקמות מעכברים מרובים.
    3. קוצרים גם את עצם הירך וגם את הטיביאס. הסר את כל השרירים מן העצמות לפני הצבת אותם בצינור עם SB5.
    4. לנתח את הטחול דרך חתך בצד שמאל של הבטן.
  3. מיצוי תאי מח עצם:
    1. מניחים את עצם הירך והטיביה שזה עתה נותחו ישירות לתוך חיץ מכתים קר (SB5) ושומרים את הצינורות על הקרח עד שהם מוכנים לחילוץ מח העצם (BM). מניחים טיט מעוקר נקי על קרח בדלי. מעבירים את העצמות לטיט יחד עם ה-SB5 מהצינור.
    2. חותכים כ-1 מ"מ מהקצוות של כל עצם באמצעות מספריים לנתיחה, כך שפתח העצם הופך להיות גלוי לעין.
    3. השתמש במחט של 26 גרם ובמזרק של 3 מ"ל מלא ב- SB5 כדי לשטוף את המח מהעצמות ולאסוף אותו לתוך חומר המליטה. חזור על התהליך 3-5 פעמים באמצעות מאגר טרי בכל פעם עד שהעצמות נראות חסרות צבע.
    4. סנן את המוח הסמוק דרך מסנן רשת של 100 מיקרומטר ואסוף את התאים בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל המונח על קרח.
    5. השתמש בטיט ובמזיק כדי למחוץ את העצמות הסמוקות ב 5-10 מ"ל של SB5. סנן את תערובת העצמות המרוסקות ומאגר דרך מסננת התאים והמאגר בגודל 100 מיקרומטר עם תאים שנאספו בשלב 1.3.4.
  4. מיצוי תאי הטחול:
    1. הגדר מסנן רשת של 100 מיקרומטר על צינור צנטריפוגה ריק של 50 מ"ל המונח על קרח. מניחים טחול בודד על מסנן הרשת.
    2. הוסיפו 0.5-1 מ"ל של SB5 לטחול כדי להבטיח שהוא לא יתייבש.
    3. באמצעות צד הגומי של בוכנה מזרק 3 מ"ל או 5 מ"ל, מועכים את הטחול דרך הרשת. מוסיפים עוד SB5, 5 מ"ל בכל פעם, וממשיכים למעוך עד שכל התאים נאספו בצינור.
  5. מנקודה זו ואילך, מח העצם ותאי הטחול מטופלים באותו אופן.
  6. סובב את התאים כלפי מטה ב- 900 x g, 4 °C למשך 10 דקות. שאפו את הסופרנטנט באמצעות מערך שאיפת ואקום.
  7. כדי ליצור תרחיף חד-תאי, יש לתלות מחדש את התאים ב-2 מ"ל של SB5 ולקטר למעלה ולמטה 50 פעמים באמצעות P1000 עם קצה פתח גדול (ראו טבלת חומרים). אלה כוללים פתחי קצה רחבים כדי לסייע במניעת נזק לתאים שבירים.
  8. כדי לספור את התאים, יש להחיישם מחדש על-ידי צנרת למעלה ולמטה 20 פעמים. לדלל את התאים ביחס של 1:100 ב-SB5. יש לערבב 10 μL מהתאים המדוללים עם 10 μL של טריפן כחול ולספור על המוציטומטר ו/או מונה תאים.
  9. סובב את התאים כלפי מטה ב- 900 x g, 4 °C למשך 10 דקות. שאפו את הסופר-נאטנט והחזירו את התאים ב-33 x 106 תאים חיים/מ"ל ב-SB5.
  10. הכינו את קוקטייל Lin-FITC על ידי ערבוב כמויות שוות של כל נוגדן בטבלה 3.
  11. הכן את התאים לפקדי צבע יחיד ולבקרות "פלואורסצנציה מינוס אחת" (FMO). בצע את שלבים 1.11-1.12 במקביל להכנה והכתמה של תאי הדגימה בשלב 1.14 (דגימות לניתוח ציטומטרי של זרימה) ו/או שלב 2.1 (מיון ציטומטרי של זרימה).
    1. הכן את התאים לבקרת תאים לא מוכתמת על ידי העברת 50 μL (1.6 x 106 תאים ) של תרחיף התא לתוך צינור FACS על קרח. הכן את התאים לכל בקרת צבע יחידה (11 צינורות) על ידי העברת 50 μL (1.6 x 106 תאים ) של תרחיף התא לתוך צינור FACS על קרח.
    2. הכן פקדי FMO לצבעים הבאים (ערכה, CD41, CD150, CD49f [ארבע צינורות]) על-ידי העברת 300 μL (10 x 106 תאים ) של תרחיף התא לצינור FACS נפרד על קרח.
    3. סובבו את התאים ב-900 x g, 4 °C למשך 10 דקות ושאפו את הסופר-נטנט.
  12. צביעת נוגדנים של FMOs ובקרות צבע בודדות
    1. הכתימו את ה-FMOs ב-33 x10 6 תאים /מ"ל (בנפח כולל של 300 μL) בצינורות FACS. עבור כל פקד, הוסף את כל הנוגדנים למעט הנוגדן הנושא את שמו של ה- FMO. לדוגמה, עבור Kit FMO, השאר את נוגדן הקיט. עבור כל נוגדן, השתמש בדילול ובריכוז הסופי כמו בטבלה 2.
    2. הכתימו את פקדי הצבע היחיד ב-20 x 106 תאים /מ"ל (בנפח כולל של 50 μL) בצינורות FACS; עבור כל פקד, הוסף נוגדן יחיד בריכוז המפורט בטבלה 2.
    3. מערבולת כל צינור בקרה במשך 2-3 שניות ב-3,000 סל"ד (סיבובים לדקה), ולאחר מכן דגירה ב-4 מעלות צלזיוס, מתנדנדת במשך 2.5 שעות בחושך, מוגנת מפני אור. נדנדו את הצינורות עם ציר סיבוב מקביל לאורך הצינור, בין זווית של כ-10° לזווית של 60° מהאופקי, כך שהתוכן לא ייגע במכסה.
    4. שטפו את התאים עם SB5: הרכיבו את נפח ההשעיה של התא ל-4 מ"ל עם SB5. סובבו את התאים כלפי מטה ב-900 x גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ושאפו את הסופר-נטנט.
  13. חידוש תאים:
    1. יש להשעות את פקדי הצבע הבודדים שאינם מוכתמים (למעט פקד DAPI) ב- 300 μL של SB5 ולסנן דרך רשת מסנן של 40 מיקרומטר לתוך צינור FACS חדש.
    2. צור תמיסת DAPI/SB5 על-ידי דילול מלאי ה-DAPI (1 מ"ג/מ"ל ב-100% אתנול) ב-1:10,000 ב-SB5.
    3. השהה את ה- FMOs ב- 1.8 מ"ל של DAPI/SB5 וסנן דרך רשת מסנן של 40 מיקרומטר לתוך צינור FACS חדש
    4. חזור על פקד הצבע היחיד של DAPI ב- 300 μL של DAPI/SB5 וסנן דרך רשת סינון של 40 מיקרומטר לתוך שפופרת FACS חדשה של 4 מ"ל.
  14. הכנת הדגימה: אם התאים מוכנים לניתוח ציטומטרי של זרימה, עבור לשלב 1.14. אם אתה מכין את התאים למיון, דלג לשלב 2.1.
  15. הכתימו את דגימות הניתוח הציטומטרי של הזרימה ב-33 x 10 6 תאים/מ"ל בנפח כולל של 300 μL (10 x 106 תאים) בצינורות FACS:
    1. הכינו את תערובת הנוגדנים מאסטר. קבע את נפח תערובת האב לפי מספר הדגימות, עם 300 μL לדגימה. צור את תערובת האב על ידי דילול כל הנוגדנים המפורטים בטבלה 2 בדילול המצוין ב- SB5. ה-Rabbit IgG בתערובת הראשית משמש כבלוק Fc.
    2. מערבלים כל צינור במשך 2-3 שניות ב-3,000 סל"ד, ואז דוגרים ב-4 מעלות צלזיוס, מתנדנדים במשך 2.5 שעות בחושך, מוגנים מפני אור.
    3. שטפו את התאים עם SB5: הרכיבו את נפח ההשעיה של התא ל-4 מ"ל עם SB5. סובבו את התאים כלפי מטה ב-900 x גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ושאפו את הסופר-נטנט.
    4. דחה את הדגימות לניתוח ציטומטרי של זרימה ב-1.8 מ"ל של DAPI/SB5 כפי שהוכן בשלב 1.12.5.2 וסנן דרך רשת מסנן של 40 מיקרומטר לתוך צינור FACS.
    5. נתח את הדגימות על גבי ציטומטר עם 10 ערוצים כדי להתאים את מצומדי הנוגדנים בטבלה 2 ואת צבע הכדאיות DAPI. הגדרת ערוץ לדוגמה מופיעה בטבלה 1. אפשר גם להשתמש רק בתשעה ערוצים; ראה מקרא טבלה 2 .
    6. במהלך הניתוח של נתוני ציטומטריה של זרימה, השתמש בגישות פיצוי ספקטרליות סטנדרטיות בעזרת פקדי הצבע היחיד ובקרות FMO כמפורט בשלב 2.4.

2. התאמות פרוטוקול למיון ציטומטרי זרימה

  1. הכנת לין-
    1. איגום כל התאים שחולצו מאותה רקמה (BM או טחול) מ-10 עכברים לצינור של 50 מ"ל. יש לתלות מחדש כל דגימה שנאגרה על-ידי פיפטינג באמצעות P1000 עם קצה פתח גדול.
    2. סובבו את התאים ב-900 x g, 4 °C למשך 10 דקות ושאפו את הסופר-נטנט.
    3. הכן פקדי צבע יחיד ופקדי FMO כמתואר בסעיף 1 באמצעות תאים לא מועשרים.
    4. העשרת תאי לין למיון באמצעות העשרת חרוזים מגנטיים של תאי Lin:
    5. יש להשעות את התאים ב-1 x 108 תאים למ"ל עם SB5 ולהעביר אותם לצינור של 15 מ"ל. הוסיפו סרום חולדות רגיל ואת הנוגדנים הביוטינילטים המפורטים בטבלה 4 ודגרו עם נדנדה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
    6. סובבו את התאים כלפי מטה ב-900 x גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ושאפו את הסופר-נטנט. יש להשעות את התאים ב-15 מ"ל של SB5 קר.
    7. סובבו את התאים כלפי מטה ב-900 x גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ושאפו את הסופר-נטנט. יש לתלות את התאים ב-1 x 108 תאים /מ"ל ב-SB5 קר ולשמור אותם על קרח.
    8. מערבולת את הננו-חרדים המגנטיים ב-3,000 סל"ד במשך 5-10 שניות. קח 1 מ"ל של ננו-חרדים מגנטיים עבור כל 10 מ"ל של תאים.
    9. שטפו את הננו-בדים בצינור FACS של 5 מ"ל. הפוך את עוצמת הקול ל -4 מ"ל עם SB5, סובב ב 900 x גרם, 4 °C למשך 5 דקות, ושאף את supernatant.
    10. יש להשעות את הננו-בורדים ב-500 μL של SB5 ולהתערבב עם התאים שהוכנו בשלב 2.1.7. דגירה ב-4 מעלות צלזיוס עם נדנדה למשך 15 דקות.
    11. סובבו את התאים כלפי מטה ב-900 x גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ושאפו את הסופר-נטנט. השהה את התאים ב- 1 x 108 תאים למ"ל עם SB5.
    12. מניחים את השפופרת על מגנט בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    13. בזהירות לשפוך את supernatant לתוך צינור חדש 15 מ"ל.
    14. מניחים את הצינור המכיל את הסופר-נטנט משלב 2.1.13 על מגנט בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. בזהירות לשפוך את supernatant לתוך צינור חדש 15 מ"ל.
    15. סובב את התאים מהסופרנטנט בשלב 2.1.14 ב-900 x גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ושאף את הסופר-נטנט.
    16. החזירו את התאים המועשרים בלין ב-1 מ"ל של SB5.
    17. יש לדלל 10 μL מהתאים ב-1:100 ב-SB5. יש לערבב 10 μL מהתאים המדוללים עם 10 μL של טריפן כחול ולספור על המוציטומטר ו/או מונה תאים.
    18. בהתבסס על ספירת התאים בשלב 2.1.17, השהה מחדש את התאים המועשרים ב- Lin ב- 33 x 106 תאים למ"ל.
  2. צביעת תאים מועשרים:
    1. הכתימו את דגימות התאים המועשרות ב-33 x 106 תאים /מ"ל בצינורות FACS על ידי הוספת כל הנוגדנים המפורטים בטבלה 2. מערבלים כל צינור במשך 2-3 שניות ב-3,000 סל"ד, ואז דוגרים ב-4 מעלות צלזיוס, מתנדנדים במשך 2.5 שעות בחושך, מוגנים מפני אור.
    2. שטפו את התאים עם SB5: הרכיבו את נפח צינורות ה-FACS ל-4 מ"ל עם SB5. סובבו את התאים כלפי מטה בטמפרטורה של 900 x גרם, 4°C למשך 10 דקות, והסירו את הסופר-נטנט.
    3. השהה מחדש את הדגימות לניתוח ציטומטרי של זרימה ב-4-6 מ"ל של DAPI/SB5 כפי שהוכנו בשלב 1.12.5.2 וסנן דרך רשת מסנן של 40 מיקרומטר לצינור FACS חדש של 4 מ"ל.
  3. מיון לדוגמה:
    1. מיין את הדגימות עם זרבובית גדולה ולחץ נמוך כדי למקסם את תפוקת CFU-e מכיוון שתאי CFU-e ניזוקים בקלות בלחץ גבוה. עבור ציטומטר הזרימה ששימש במחקר זה, השתמש ב- 14 psi ובזרבובית של 100 מיקרומטר או 12 psi עם זרבובית של 130 מיקרומטר. הגדר את שערי המיון כמתואר בשלב 2.4 להלן.
    2. הכינו את מאגר האיסוף: הוסיפו 20% סרום בקר עוברי ל-PBS.
    3. כדי לבדוק את טוהר האוכלוסיות הממוינות, הפעל מחדש אליקוט קטן מכל אוכלוסייה ממוינת במאגר המכיל DAPI, כמתואר בשלב 1.12.5.2.
      הערה: בדרך כלל, BM מ-10 עכברים בסך הכל (בערך 1 x 109 תאים ) מניב לפחות 50,000-100,000 תאים עבור כל אחת מאוכלוסיות P1-hi, P1-low ו-P2 עם כדאיות של כ-70%.
  4. השתמשו באסטרטגיית המיון המוצגת באיור 3 לצורך ניתוח או הגדרת שערי המיון.
    1. השתמש בפרמטר פיזור קדימה (FSC) כדי להסיר את הלכלוך בהתבסס על גודל. השתמש בהיסטוגרמה של גובה FSC לעומת אזור FSC כדי לא לכלול צברי תאים ולבחור תאים בודדים; חזור על הפעולה עם היסטוגרמה של פיזור צד (SSC) לעומת היסטוגרמה של אזור SSC.
    2. אל תכלול את התאים המתים על-ידי מיון התאים החיוביים לצבע הדנ"א DAPI, שאליו תאים בני קיימא הם אטומים.
    3. בחר תאי Lin-Ter119-Kit+, ומתוך אלה, בחר תת-אוכלוסייה המבטאת CD55.
    4. חלקו את תאי Lin- Ter119-Kit+CD55+ לשתי אוכלוסיות עיקריות, P6 ו-P7, בהתבסס על הביטוי של CD49f ו-CD105.
    5. בהתבסס על הביטוי של CD150 ו-CD41, חלקו את P6 בהמשך ל-P3 (אבות אבים של תאי בזופיל או פיטום), P4 (אבות מגריוציטים) ו-P5 (EBMP ו-MPP מוטה אריתרואידים).
    6. בהתבסס על הביטוי של CD150 ו-CD71, חלקו את P7 בהמשך ל-P2 (BFU-e), CFU-e מוקדם (P1-low) ו-CFU-e מאוחר (P1-hi).

תוצאות

הפרוטוקול מתאר גישה ציטומטרית של זרימה לזיהוי BFU-es ו-CFU-es בתאי מח עצם וטחול שזה עתה נקטפו. זה מתחיל בקצירת BM וטחול טריים מעכברים ומיד הנחת הרקמה על קרח. כל ההליכים מתבצעים בקור כדי לשמור על כדאיות התא. התאים מסומנים בקוקטייל נוגדנים "שושלת" המאפשר הרחקה של כל התאים המבטאים סמנים של שושלות דם מ...

Discussion

היכולת לבודד באופן פרוספקטיבי אבות BFU-e ו-CFU-e ישירות מרקמה טרייה בעלת טוהר גבוה חמקה בעבר מהחוקרים. הגישה החדשנית שלנו, שאומתה באמצעות scRNAseq ומבחני גורל התא 1,27, מציעה כעת את הכלים לעשות זאת.

ישנן מספר נקודות מפתח לביצוע מוצלח הן של המיון והן של ה?...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי מענקי NIH R01DK130498, R01DK120639 ו- R01HL141402

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTA, pH 8.0Life Technologies15575020
1000 µL large orifice tipsUSA sceintific1011-9000
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) AntibodyBioLegend131806
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) AntibodyBioLegend105826
Biotin-CD11bBD Biosciences557395M1/70 (clone)
Biotin-CD19BD Biosciences5537841D3 (clone)
Biotin-CD4BD BiosciencesBDB553045RM4-5 (clone)
Biotin-CD8aBD BiosciencesBDB55302953-6.7 (clone)
Biotin-F4/80Biolegend123106BM8 (clone)
Biotin-Ly-6G and Ly-6CBD Biosciences553125RB6-8C5 (clone)
Biotin-TER-119BD Biosciences553672TER-119 (clone)
Bovine Serum AlbuminSigma aldritchA1470
Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f AntibodyBioLegend313624
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 AntibodyBioLegend133921
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) AntibodyBioLegend115931
BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid CellsBD Biosciences563827
ChromPure Rabbit IgG, whole moleculeJackson ImmunoResearch Laboratories011-000-003
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Life TechnologiesD1306
Digital DIVA hardware and software for LSR IIBD Biosciences
FITC anti-mouse F4/80 AntibodyBioLegend123108
FITC Rat Anti-CD11bBD Biosciences557396
FITC Rat Anti-Mouse CD19BD Biosciences553785
FITC Rat Anti-Mouse CD4BD Biosciences553047
FITC Rat Anti-Mouse CD8aBD Biosciences553031
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6CBD Biosciences553127
FlowJo software FlowJoversion 10Flow cytometer analysis software
LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzerBD BiosciencesFlow cytometer 
NewlineNY Stainless Steel Hand Masher & Bowl, Mortar and Pestle SetAmazon
Normal rat serumStem Cell Technologies13551
PE anti-mouse CD105 AntibodyBioLegend120408
PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 AntibodyBioLegend113812
Phosphate Buffered Saline, 10x SolutionFisher scientificBP3994
Streptavidin NanobeadsBioLegend480016Magnetic beads

References

  1. Tusi, B. K., et al. Population snapshots predict early haematopoietic and erythroid hierarchies. Nature. 555 (7694), 54-60 (2018).
  2. Socolovsky, M. The role of specialized cell cycles during erythroid lineage development: Insights from single-cell RNA sequencing. International Journal of Hematology. 116 (2), 163-173 (2022).
  3. Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2021).
  4. Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M., Heath, D. S., Robinson, W. A. Properties of Cells that Produce Erythrocytic Colonies In Vitro. Hemopoiesis in Culture. , (1974).
  5. Heath, D. S., Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M. Separation of the erythropoietin-responsive progenitors BFU-E and CFU-E in mouse bone marrow by unit gravity sedimentation. Blood. 47 (5), 777-792 (1976).
  6. Iscove, N. N., Sieber, F. Erythroid progenitors in mouse bone marrow detected by macroscopic colony formation in culture. Experimental Hematology. 3 (1), 32-43 (1975).
  7. Gregory, C. J., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: State of differentiation. Journal of Cell Physiology. 81 (3), 411-420 (1973).
  8. Gregory, C. J., Tepperman, A. D., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: Response of normal and genetically anemic W-W-V mice to manipulations of the erythron. Journal of Cell Physiology. 84 (1), 1-12 (1974).
  9. Gregory, C. J. Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in the hemopoietic system: studies of three erythropoietic colony responses in culture. Journal of Cell Physiology. 89 (2), 289-301 (1976).
  10. Pop, R., et al. A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression. PLoS Biology. 8 (9), 1000484 (2010).
  11. Koulnis, M., et al. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. Journal of Visualized Experiments. (54), e2809 (2011).
  12. Liu, Y., et al. Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in vivo. Blood. 108 (1), 123-133 (2006).
  13. Socolovsky, M., et al. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).
  14. Chen, K., et al. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17413-17418 (2009).
  15. Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2020).
  16. Hidalgo, D., et al. EpoR stimulates rapid cycling and larger red cells during mouse and human erythropoiesis. Nature Communications. 12 (1), 7334 (2021).
  17. Porpiglia, E., Hidalgo, D., Koulnis, M., Tzafriri, A. R., Socolovsky, M. Stat5 signaling specifies basal versus stress erythropoietic responses through distinct binary and graded dynamic modalities. PLoS Biology. 10 (8), 1001383 (2012).
  18. Koulnis, M., et al. Contrasting dynamic responses in vivo of the Bcl-xL and Bim erythropoietic survival pathways. Blood. 119 (5), 1228-1239 (2012).
  19. Shearstone, J. R., et al. Global DNA demethylation during mouse erythropoiesis in vivo. Science. 334 (6057), 799-802 (2011).
  20. Koulnis, M., Liu, Y., Hallstrom, K., Socolovsky, M. Negative autoregulation by Fas stabilizes adult erythropoiesis and accelerates its stress response. PLoS One. 6 (7), 21192 (2011).
  21. Pronk, C. J., et al. Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy. Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).
  22. Dolznig, H., et al. Expansion and differentiation of immature mouse and human hematopoietic progenitors. Methods in Molecular Medicine. 105, 323-344 (2005).
  23. Li, J., et al. Isolation and transcriptome analyses of human erythroid progenitors: BFU-E and CFU-E. Blood. 124 (24), 3636-3645 (2014).
  24. Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: Functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).
  25. Flygare, J., Rayon Estrada, V., Shin, C., Gupta, S., Lodish, H. F. HIF1alpha synergizes with glucocorticoids to promote BFU-E progenitor self-renewal. Blood. 117 (12), 3435-3444 (2011).
  26. Pronk, C. J., Attema, J., Rossi, D. J., Sigvardsson, M., Bryder, D. Deciphering developmental stages of adult myelopoiesis. Cell Cycle. 7 (6), 706-713 (2008).
  27. Khoramian Tusi, B., Socolovsky, M. High-throughput single-cell fate potential assay of murine hematopoietic progenitors in vitro. Experimental Hematology. 60, 21-29 (2018).
  28. Erslev, A. J., Caro, J. Erythropoietin titers in response to anemia or hypoxia. Blood Cells. 13 (1-2), 207-216 (1987).
  29. Koury, M. J., Bondurant, M. C. The molecular mechanism of erythropoietin action. European Journal of Biochemistry. 210 (3), 649-663 (1992).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

189FACSCFU eBFU e

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved