유세포분석에 의한 마우스 조직으로부터 파열 형성 단위 및 콜로니 형성 단위 적혈구 전구체의 식별 및 분리

요약

여기에서는 신선한 마우스 골수 및 비장에서 직접 조기 파열 형성 단위 적혈구 (BFU-e) 및 콜로니 형성 단위 적혈구 (CFU-e) 전구 세포를 전향 적으로 분리하기위한 새로운 유세포 분석 방법을 설명합니다. 단일 세포 전사체 데이터를 기반으로 개발된 이 프로토콜은 조직의 모든 적혈구 전구체를 고순도로 분리한 최초의 프로토콜입니다.

초록

초기 적혈구 전구 세포는 원래 시험관 내에서 콜로니 형성 잠재력에 의해 정의되었으며 BFU-e 및 CFU-e로 알려진 파열 형성 및 집락 형성 "단위"로 분류되었습니다. 최근까지, 새로 분리된 성인 마우스 골수로부터 순수한 BFU-e 및 CFU-e 전구세포를 직접 전향적이고 완전히 분리하는 방법은 이용 가능하지 않았다. 이러한 격차를 해소하기 위해 마우스 골수의 단일 세포 RNA-seq (scRNAseq) 데이터 세트를 분석하여 세포 표면 마커를 암호화하는 유전자의 발현을 분석했습니다. 이 분석은 세포 운명 분석과 결합되어 마우스 골수 또는 비장에서 BFU-e 및 CFU-e 전구 세포의 완전하고 순수한 하위 집합을 식별하고 분리할 수 있는 새로운 유세포 분석 접근법을 개발할 수 있었습니다. 이 접근법은 또한 호염기구/비만 세포 및 거핵구 전위에 대해 풍부한 하위세트를 포함하는 다른 전구 하위세트를 식별한다. 이 방법은 신선한 골수 또는 비장 세포를 Kit 및 CD55로 향하는 항체로 표지하는 것으로 구성됩니다. 이 두 마커를 모두 발현하는 전구 세포는 5 개의 주요 집단으로 세분됩니다. 집단 1(P1 또는 CFU-e, Kit+ CD55⁺ CD49f med/low CD105 med/high CD71 ^med/high)은 모든 CFU-e 전구 세포를 포함하며, 각각 초기 및 후기 CFU-e에 해당하는 P1-low(CD71^med CD150 high) 및 P1-hi(CD71 ^high CD150^low)로 더 세분화될 수 있다. 인구 2 (P2 또는 BFU-e, 키트 + CD55 ⁺ CD49f med / 낮은 CD105 ^{med / 높은} CD71 ^낮은 CD150^높음)는 모든 BFU-e 전구 세포를 포함합니다. 집단 P3 (P3, Kit+ CD55⁺ CD49f 중간/^높은 CD105 중간/낮은 CD150^낮은 CD41^낮음)은 호염기구^/비만 세포 전구체에 대해 풍부합니다. 인구 4 (P4, Kit + CD55 + CD49f 중간 / 높은 CD105^{중간 / 낮은} CD150^높은 CD41 ⁺)는 거대 핵 세포 전구 세포에 대해 풍부합니다. 및 인구 5(P5, Kit+ CD55⁺ CD49f med/high CD105^med/low CD150^high CD41^-)에는 적혈구, 호염기구/비만 세포 및 거대핵구 전위(EBMP) 및 적혈구/거핵세포^/호염기구 편향 다중 전위 전구체(MPP)가 있는 전구체가 포함됩니다. 이 새로운 접근 방식은 적혈구 및 기타 조혈 전구 세포를 분석할 때 더 높은 정밀도를 허용하고 유세포 측정적으로 정의된 각 집단에 대한 전사체 정보를 참조할 수도 있습니다.

서문

적혈구 생성은 초기 적혈구 생성과 적혈구 말단 분화의 두 가지 주요 단계로 나눌 수 있습니다(그림 1)^1,2,3. 초기 적혈구 생성에서 조혈 줄기 세포는 적혈구 계통에 전념하고 초기 적혈구 전구 세포를 생성하며, 이는 반고체 배지에서 집락 형성 잠재력을 기반으로 1970 년대에 처음 확인되었습니다 4,5,6,7,8,9 . 대체로 적혈구 전구 세포는 두 가지 범주로 나뉩니다 : 각각 "파열 형성 단위 적혈구"또는 BFU-e ^4,5,6으로 명명 된 "파열"(더 ....

프로토콜

모든 실험은 동물 프로토콜 A-1586에 따라 수행되었으며 매사추세츠 대학 찬 의과 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 202200017.

참고: 여기에는 두 가지 프로토콜이 자세히 설명되어 있습니다: 첫째, 유세포 분석 분석(섹션 1), 유세포 분석 분류를 위한 프로토콜 조정(섹션 2). 아래 프로토콜은 10개 채널이 있는 유세포분석기/분류기를 사용합니다. 예제 설정은 단계 1.14.5에서 참조된 표 1에 제공됩니다. 이 프로토콜을 9개의 채널로만 실행할 수도 있습니다. 표 2의 범례를 참조하십시오.

1. 유세포 분석

1. 성체(>6주령) Balb/C 또는 C57BL6 마우스를 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 적절한 방법(예: CO₂ 흡입 후 자궁 경부 탈구)을 사용하여 안락사시킵니다. 유세포 분석을 위해서는 단일 마우스의 골수 (BM)로 충분합니다. 정렬의 경우, 마우스의 수는 다운스트림 응용 프로그램에 따라 다릅니다. 각 집단에 대한 세포 수율은 다음과 같습니다 (단계 2.3.3).
2. 조직 수확 :
   1. 얼음에 3mL의 냉(....

결과

이 프로토콜은 새로 수확한 골수 및 비장 세포에서 BFU-es 및 CFU-es를 식별하기 위한 유세포 분석 접근 방식을 설명합니다. 생쥐에서 신선한 BM과 비장을 채취하고 즉시 조직을 얼음 위에 놓는 것으로 시작합니다. 모든 절차는 세포 생존력을 보존하기 위해 추위에서 수행됩니다. 세포는 분화된 혈통의 마커를 발현하는 모든 세포의 배제를 허용하는 "계통" 항체 칵테일로 표지된다 (유동 세포측정 분석.......

토론

BFU-e 및 CFU-e 전구 세포를 고순도의 신선한 조직에서 직접 전향 적으로 분리 할 수있는 능력은 이전에 연구자를 피했습니다. scRNAseq 및 세포 운명 분석 ^1,27을 사용하여 검증된 당사의 새로운 접근법은 이제 이를 수행할 수 있는 도구를 제공합니다.

분류 프로토콜과 분석 프로토콜을 모두 성공적으로 실행하기 위한 몇 가지 핵심 사항?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0	Life Technologies	15575020
1000 µL large orifice tips	USA sceintific	1011-9000
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody	BioLegend	131806
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody	BioLegend	105826
Biotin-CD11b	BD Biosciences	557395	M1/70 (clone)
Biotin-CD19	BD Biosciences	553784	1D3 (clone)
Biotin-CD4	BD Biosciences	BDB553045	RM4-5 (clone)
Biotin-CD8a	BD Biosciences	BDB553029	53-6.7 (clone)
Biotin-F4/80	Biolegend	123106	BM8 (clone)
Biotin-Ly-6G and Ly-6C	BD Biosciences	553125	RB6-8C5 (clone)
Biotin-TER-119	BD Biosciences	553672	TER-119 (clone)
Bovine Serum Albumin	Sigma aldritch	A1470
Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody	BioLegend	313624
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody	BioLegend	133921
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody	BioLegend	115931
BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells	BD Biosciences	563827
ChromPure Rabbit IgG, whole molecule	Jackson ImmunoResearch Laboratories	011-000-003
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Life Technologies	D1306
Digital DIVA hardware and software for LSR II	BD Biosciences
FITC anti-mouse F4/80 Antibody	BioLegend	123108
FITC Rat Anti-CD11b	BD Biosciences	557396
FITC Rat Anti-Mouse CD19	BD Biosciences	553785
FITC Rat Anti-Mouse CD4	BD Biosciences	553047
FITC Rat Anti-Mouse CD8a	BD Biosciences	553031
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C	BD Biosciences	553127
FlowJo software	FlowJo	version 10	Flow cytometer analysis software
LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer	BD Biosciences		Flow cytometer
NewlineNY Stainless Steel Hand Masher & Bowl, Mortar and Pestle Set	Amazon
Normal rat serum	Stem Cell Technologies	13551
PE anti-mouse CD105 Antibody	BioLegend	120408
PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody	BioLegend	113812
Phosphate Buffered Saline, 10x Solution	Fisher scientific	BP3994
Streptavidin Nanobeads	BioLegend	480016	Magnetic beads