JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, erken patlama oluşturan birim eritroid (BFU-e) ve koloni oluşturan birim eritroid (CFU-e) progenitörlerinin doğrudan taze fare kemik iliği ve dalağından prospektif izolasyonu için yeni bir akış sitometrik yöntemi tanımladık. Tek hücreli transkriptomik verilere dayanarak geliştirilen bu protokol, dokunun tüm eritroid progenitörlerini yüksek saflıkta izole eden ilk protokoldür.

Özet

Erken eritroid progenitörler başlangıçta in vitro koloni oluşturma potansiyelleri ile tanımlandı ve BFU-e ve CFU-e olarak bilinen patlama oluşturan ve koloni oluşturan "birimler" olarak sınıflandırıldı. Yakın zamana kadar, saf BFU-e ve CFU-e progenitörlerinin taze izole edilmiş yetişkin fare kemik iliğinden doğrudan prospektif ve tam izolasyonu için yöntemler mevcut değildi. Bu boşluğu gidermek için, hücre yüzey belirteçlerini kodlayan genlerin ekspresyonu için fare kemik iliğinin tek hücreli bir RNA-seq (scRNAseq) veri kümesi analiz edildi. Bu analiz, fare kemik iliği veya dalağında BFU-e ve CFU-e progenitörlerinin tam ve saf alt kümelerinin izolasyonunu tanımlayan ve izin veren yeni bir akış sitometrik yaklaşımının geliştirilmesine izin veren hücre kaderi tahlilleri ile birleştirildi. Bu yaklaşım aynı zamanda bazofil / mast hücresi ve megakaryositik potansiyeller için zenginleştirilmiş alt kümeler de dahil olmak üzere diğer progenitör alt kümelerini de tanımlar. Yöntem, taze kemik iliği veya dalak hücrelerinin Kit ve CD55'e yönlendirilmiş antikorlarla etiketlenmesinden oluşur. Her iki belirteci de ifade eden öncüller daha sonra beş ana popülasyona ayrılır. Popülasyon 1 (P1 veya CFU-e, Kit + CD55 + CD49f med / düşük CD105 med / yüksek CD71 med / yüksek) tüm CFU-e progenitörlerini içerir ve sırasıyla erken ve geç CFU-e'ye karşılık gelen P1-low (CD71med CD150yüksek) ve P1-hi (CD71 yüksek CD150düşük) olarak alt bölümlere ayrılabilir; Popülasyon 2 (P2 veya BFU-e, Kit + CD55+ CD49f med/düşük CD105med/yüksek CD71düşük CD150yüksek) tüm BFU-e progenitörlerini içerir; Popülasyon P3 (P3, Kit + CD55+ CD49f med /yüksek CD105 med / düşük CD150 düşük CD41düşük) bazofil / mast hücre progenitörleri için zenginleştirilmiştir; Popülasyon 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49f med/yüksek CD105med/düşük CD150yüksek CD41+) megakaryositik progenitörler için zenginleştirilmiştir; ve Popülasyon 5 (P5, Kit + CD55 + CD49f med / yüksek CD105med / düşük CD150yüksek CD41-) eritroid, bazofil / mast hücresi ve megakaryositik potansiyele (EBMP) sahip progenitörler ve eritroid/ megakaryositik / bazofil önyargılı çok potansiyelli progenitörler (MPP'ler) içerir. Bu yeni yaklaşım, eritroid ve diğer hematopoetik progenitörleri analiz ederken daha fazla hassasiyet sağlar ve ayrıca sitometrik olarak tanımlanmış her akış popülasyonu için transkriptom bilgisine atıfta bulunulmasına izin verir.

Giriş

Eritropoez iki ana faza ayrılabilir: erken eritropoez ve eritroid terminal farklılaşması (Şekil 1)1,2,3. Erken eritropoezde, hematopoetik kök hücreler eritroid soyuna bağlanır ve ilk olarak 1970'lerde yarı katı ortamda koloni oluşturma potansiyellerine dayanarak tanımlanan erken eritroid progenitörlere yol açar 4,5,6,7,8,9 . Genel olarak, eritroid progenitörler iki kategoriye ayrılır: her biri "patlama oluşturan birim eritroid" veya BFU-e 4,5,6 olarak adlandırılan bir "patlamaya" (daha küçük eritroid hücre kümelerinin büyük bir toplamı) yol açan önceki progenitörler; ve her biri "koloni oluşturan birim eritroid" veya CFU-e 7,8,9 olarak adlandırılan tek, küçük bir eritroid hücre kümesi veya kolonisi oluşturan soyları. BFU-e ve CFU-e henüz terminal eritroid genleri eksprese etmemektedir ve morfolojik olarak tanınabilir değildir. Bir dizi kendini yenileme veya genişleme hücresi bölünmesinden sonra, CFU-e, globinler gibi eritroid genlerin indüklendiği ve böylece eritroid terminal farklılaşmasına (ETD) geçiş yaptığı bir transkripsiyonel anahtara uğrar. ETD sırasında, eritroblastlar, kırmızı hücrelere olgunlaşan retikülositler oluşturmak için enükleasyona uğramadan önce üç ila beş olgun hücre bölünmesine uğrar.

Terminal farklılaşma sırasındaki eritroblastlar başlangıçta proeritroblastlar, bazofilik, polikromatik ve ortokromatik morfolojilerine göre sınıflandırılmıştır. Akış sitometrisinin ortaya çıkışı, hücre büyüklüğüne (ileri saçılma, FSC ile ölçülür) ve iki hücre yüzey belirtecine, CD71 ve Ter119 11,12,13'e (Şekil 1) dayalı olarak prospektif sıralama ve izolasyonlarına izin verdi. Bu ve benzeri akım sitometrik yaklaşımları 14, ETD'nin moleküler ve hücresel yönlerinin araştırılmasında devrim yaratarak, in vivo ve in vitro 10,15,16,17,18,19,20 eritroblastların gelişim aşamasına özgü analizine izin vermiştir. CD71/Ter119 yaklaşımı artık eritroid öncüllerin analizinde rutin olarak kullanılmaktadır.

Yakın zamana kadar, CFU-e ve BFU-e'nin fare dokusundan doğrudan, yüksek saflıkta prospektif izolasyonu için benzer, erişilebilir bir akış sitometrik yaklaşımı, araştırmacılardan kaçınmıştır. Bunun yerine, araştırmacılar bu progenitörlerin sadece bir kısmını izole eden akış sitometrik stratejilerini, genellikle aynı akış sitometrik alt kümeleri21 içinde birlikte saflaştıran eritroid olmayan hücrelerin varlığında kullanmışlardır. Sonuç olarak, BFU-e ve CFU-e'nin araştırılması, BFU-e ve CFU-e'yi daha önceki kemik iliği progenitörlerinden türeten ve çoğaltan in vitro farklılaşma sistemleriyle sınırlıydı. Daha sonra bu eritroid progenitörle zenginleştirilmiş kültürlerde CFU-e'yi BFU-e'den ayıran akış sitometrik stratejileri uygulamak mümkündür22,23. Alternatif bir yaklaşım, gebeliğin ortasında fare fetal karaciğerinin Ter119-negatif fraksiyonunda oldukça zenginleştirilmiş olan fetal CFU-e ve BFU-e'yi kullanır 10,24,25. Bununla birlikte, bu yaklaşımların hiçbiri, yetişkin BFU-e ve CFU-e'nin fizyolojik durumlarında in vivo olarak araştırılmasına izin vermez. Mücadelenin büyüklüğü, koloni oluşum analizlerine dayanarak, bu hücrelerin yetişkin kemik iliğinde sırasıyla% 0.025 ve% 0.3 frekansında bulunduğunu hatırlatırken takdiredilebilir.

Burada açıklanan protokol, yeni hasat edilmiş Kit + fare kemik iliği hücrelerinin tek hücreli transkriptomik analizine dayanan yeni bir akış sitometrik yaklaşımıdır (Kit, kemik iliğinin tüm erken progenitör popülasyonları tarafından ifade edilir)1. Yaklaşımımız, Pronk ve ark.21,26 tarafından halihazırda kullanılmakta olan bazı hücre yüzey belirteçlerini içermektedir. Eritroid ve diğer erken hematopoetik progenitörleri tanımlayan hücre yüzey belirteçlerinin kombinasyonlarını belirlemek için tek hücreli transkriptomlar kullanıldı (Şekil 2). Spesifik olarak, soy-negatif (Lin-) Kit + hücrelerinin CD55 + fraksiyonu, üçü eritroid yörüngenin bitişik segmentlerini veren beş popülasyona bölünebilir (Şekil 2). Bu popülasyonların her birinin transkriptomik kimlikleri sıralama ile doğrulandı, ardından scRNAseq ve sıralanmış tek hücreli transkriptomların orijinal transkriptomik haritaya geri yansıtılması (beş popülasyonun her birindeki gen ekspresyonu ve tüm kemik iliği veri kümesi https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html'de araştırılabilir)1 . Popülasyonların her birinin hücre kaderi potansiyeli, geleneksel koloni oluşum testleri (Şekil 2) ve ayrıca yeni bir yüksek verimli tek hücreli kader testi 1,27 kullanılarak doğrulanmıştır. Bu analizler, yeni akım sitometrik yaklaşımının, taze yetişkin kemik iliği ve dalağının tüm BFU-e ve CFU-e progenitörlerinin yüksek saflıkta izolasyonu ile sonuçlandığını göstermektedir. Spesifik olarak, popülasyon 1 (P1) sadece CFU-e içerir ve başka hematopoetik progenitörler içermez ve popülasyon 2 (P2) kemik iliğinin tüm BFU-e progenitörlerini ve az sayıda CFU-e'yi içerir, ancak başka progenitörleriiçermez 1. Aşağıdaki ayrıntılı protokol, salin veya eritropoez uyarıcı hormon eritropoietin (Epo) ile enjekte edilen farelerde yapılan örnek bir deneyle daha da gösterilmiştir.

Protokol

Tüm deneyler, Massachusetts Chan Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan A-1586 ve 202200017 hayvan protokollerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

NOT: Burada iki protokol detaylandırılmıştır: birincisi, akış sitometrik analizi (bölüm 1), ardından akış sitometrik sıralama için protokol ayarlamaları (bölüm 2). Aşağıdaki protokol, 10 kanallı bir akış sitometresi/sıralayıcı kullanır. Örnek kurulum, adım 1.14.5'te atıfta bulunulan Tablo 1'de verilmiştir. Bu protokolü yalnızca dokuz kanalla çalıştırmak da mümkündür; Tablo 2'deki göstergeye bakın.

1. Akış sitometrik analizi

  1. Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteniz tarafından onaylanan uygun bir yöntem kullanarak yetişkin (>6 haftalık) Balb / C veya C57BL6 farelerini ötenazi yapın (örneğin, CO2 inhalasyonu ve ardından servikal çıkık). Akış sitometrik analizi için, tek bir fareden kemik iliği (BM) yeterli olacaktır. Sıralama için, fare sayısı aşağı akış uygulamalarına bağlıdır. Her popülasyon için hücre verimi aşağıda verilmiştir (adım 2.3.3).
  2. Doku hasadı:
    1. Buz üzerinde 3 mL soğuk (4 °C) boyama tamponu ("SB5": fosfat tamponlu salin (PBS), %0,2 sığır serum albümini (BSA), %0,08 glikoz, 5 mM EDTA) içeren 5 mL floresan aktif hücre sıralama (FACS) tüpleri hazırlayın. Hasat edilen dokuları yerleştirmek için bunu kullanın.
    2. Her fareden disseke edilen her doku için ayrı tüpler hazırlayın. Birden fazla fareden dokuları bir araya getirmeyin.
    3. Hem femurları hem de tibiasları hasat edin. SB5 ile tüpe yerleştirmeden önce tüm kasları kemiklerden çıkarın.
    4. Dalağı karnın sol tarafındaki bir kesiden diseke edin.
  3. Kemik iliği hücre ekstraksiyonu:
    1. Yeni disseke edilmiş femurları ve tibiasları doğrudan soğuk boyama tamponuna (SB5) yerleştirin ve kemik iliğini (BM) çıkarmaya hazır olana kadar tüpleri buz üzerinde tutun. Bir kovada buz üzerine temiz bir sterilize edilmiş harç yerleştirin. Kemikleri tüpten SB5 ile birlikte harçlara aktarın.
    2. Her kemiğin uçlarının yaklaşık 1 mm'sini diseksiyon makası ile kesin, böylece kemiğin deliği sadece görünür hale gelir.
    3. İliği kemiklerden temizlemek ve harçta toplamak için 26 G'lik bir iğne ve SB5 ile doldurulmuş 3 mL'lik bir şırınga kullanın. Kemikler renksiz görünene kadar her seferinde taze tampon kullanarak işlemi 3-5 kez tekrarlayın.
    4. Yıkanmış iliği 100μm'lik bir ağ filtreden süzün ve hücreleri buz üzerine yerleştirilmiş 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın.
    5. Yıkanmış kemikleri 5-10 mL SB5'te ezmek için harcı ve havaneyi kullanın. Ezilmiş kemiklerin ve tamponun karışımını 100 μm hücre süzgeci ve havuz boyunca adım 1.3.4'te toplanan hücrelerle filtreleyin.
  4. Dalak hücresi ekstraksiyonu:
    1. Buz üzerine yerleştirilmiş boş bir 50 mL santrifüj tüpü üzerine 100 μm örgü filtre kurun. Ağ filtresine tek bir dalak yerleştirin.
    2. Kurumadığından emin olmak için dalağa 0,5-1 mL SB5 ekleyin.
    3. 3 mL veya 5 mL şırınga pistonunun kauçuk tarafını kullanarak, dalağı ağdan ezin. Bir seferde daha fazla SB5, 5 mL ekleyin ve tüm hücreler tüpte toplanana kadar püre haline getirmeye devam edin.
  5. Bu noktadan itibaren kemik iliği ve dalak hücreleri aynı şekilde tedavi edilir.
  6. Hücreleri 10 dakika boyunca 900 x g, 4 ° C'de döndürün. Bir vakum aspirasyon kurulumu kullanarak süpernatantı aspire edin.
  7. Tek hücreli bir süspansiyon yapmak için, hücreleri 2 mL SB5'te yeniden askıya alın ve büyük bir delik ucuna sahip bir P1000 kullanarak 50 kez yukarı ve aşağı pipet yapın (bkz. Bunlar, kırılgan hücrelerin zarar görmesini önlemeye yardımcı olmak için geniş uç açıklıklarına sahiptir.
  8. Hücreleri saymak için, 20 kez yukarı ve aşağı pipetle çekerek yeniden askıya alın. SB5'te hücreleri 1:100 oranında seyreltin. Seyreltilmiş hücrelerin 10 μL'sini 10 μL tripan mavisi ile karıştırın ve bir hemositometre ve / veya hücre sayacına güvenin.
  9. Hücreleri 10 dakika boyunca 900 x g, 4 ° C'de döndürün. Süpernatantı aspire edin ve SB5'te hücreleri 33 x 106 canlı hücre / mL'de yeniden askıya alın.
  10. Lin-FITC kokteylini, Tablo 3'teki her antikorun eşit hacimlerini karıştırarak hazırlayın.
  11. Hücreleri tek renk kontrolleri ve "Floresan eksi bir" (FMO) kontrolleri için hazırlayın. Adım 1.14'teki (akış sitometrik analizi için numuneler) ve/veya adım 2.1'deki (akış sitometrik sıralama) numune hücrelerinin hazırlanması ve boyanmasına paralel olarak 1.11-1.12 adımlarını uygulayın.
    1. Hücre süspansiyonunun 50 μL'sini (1.6 x 106 hücre) buz üzerindeki bir FACS tüpüne aktararak hücreleri lekesiz bir hücre kontrolü için hazırlayın. Hücre süspansiyonunun 50 μL'sini (1.6 x 106 hücre) buz üzerindeki bir FACS tüpüne aktararak hücreleri her bir tek renk kontrolü (11 tüp) için hazırlayın.
    2. Hücre süspansiyonunun 300 μL'sini (10 x 106 hücre) buz üzerinde ayrı bir FACS tüpüne aktararak aşağıdaki renkler (Kit, CD41, CD150, CD49f [dört tüp]) için FMO kontrollerini hazırlayın.
    3. Hücreleri 900 x g, 4 ° C'de 10 dakika boyunca döndürün ve süpernatanı aspire edin.
  12. FMO'ların antikor boyama ve tek renk kontrolleri
    1. FMO'ları FACS tüplerinde 33 x 106 hücre / mL'de (toplam 300 μL hacimde) sabitleyin. Her kontrol için, FMO'nun adaşı antikoru dışındaki tüm antikorları ekleyin. Örneğin, Kit FMO için, Kit antikorunu dışarıda bırakın. Her antikor için, Tablo 2'deki gibi seyreltme ve son konsantrasyonu kullanın.
    2. FACS tüplerinde 20 x 106 hücre / mL'de (toplam 50 μL hacimde) tek renk kontrollerini sabitleyin; Her kontrol için, Tablo 2'de listelenen konsantrasyonda tek bir antikor ekleyin.
    3. Her kontrol tüpünü 3.000 rpm'de (dakikada dönüş) 2-3 s vorteks yapın ve daha sonra karanlıkta 2,5 saat sallanarak ışıktan korunarak 4 ° C'de inkübe edin. Tüpleri, tüpün uzunluğuna paralel bir dönme ekseni ile, yataydan yaklaşık 10 ° ila 60 ° açı arasında sallayın, böylece içerikler kapağa temas etmez.
    4. Hücreleri SB5 ile yıkayın: SB5 ile hücre süspansiyonunun hacmini 4 mL'ye kadar yapın. Hücreleri 10 dakika boyunca 900 x g, 4 ° C'de döndürün ve süpernatanı aspire edin.
  13. Hücre resüspansiyonu:
    1. 300 μL SB5'te boyanmamış ve tüm tek renk kontrollerini (DAPI kontrolü hariç) yeniden askıya alın ve 40 μm'lik bir filtre ağından yeni bir FACS tüpüne filtreleyin.
    2. DAPI stoğunu (% 100 etanolde 1 mg / mL) SB5'te 1:10.000'de seyrelterek bir DAPI / SB5 çözeltisi yapın.
    3. FMO'ları 1,8 mL DAPI/SB5'te yeniden askıya alın ve 40 μm'lik bir filtre ağından yeni bir FACS tüpüne filtreleyin
    4. DAPI tek renk kontrolünü 300 μL DAPI/SB5'te yeniden askıya alın ve 40 μm'lik bir filtre ağından yeni bir 4 mL FACS tüpüne filtreleyin.
  14. Numune hazırlama: Hücreler akış sitometrik analizi için hazırlanıyorsa, adım 1.14'e gidin. Hücreleri sıralama için hazırlıyorsanız, adım 2.1'e atlayın.
  15. Akış sitometrik analiz numunelerini FACS tüplerinde toplam 300 μL (10 x 106 hücre) hacimde 33 x 106 hücre / mL'de sabitleyin:
    1. Antikor ana karışımını hazırlayın. Ana karışımın hacmini, numune başına 300 μL ile numune sayısına göre belirleyin. SB5'te belirtilen seyreltmede Tablo 2'de listelenen tüm antikorları seyrelterek ana karışımı yapın. Ana karışımdaki Tavşan IgG, bir Fc bloğu görevi görür.
    2. Her tüpü 3.000 rpm'de 2-3 s vorteks yapın ve daha sonra karanlıkta 2,5 saat sallanarak ışıktan korunarak 4 ° C'de kuluçkaya yatırın.
    3. Hücreleri SB5 ile yıkayın: SB5 ile hücre süspansiyonunun hacmini 4 mL'ye kadar yapın. Hücreleri 10 dakika boyunca 900 x g, 4 ° C'de döndürün ve süpernatanı aspire edin.
    4. Adım 1.12.5.2'de hazırlandığı gibi 1,8 mL DAPI/SB5'te akış sitometrik analizi için numuneleri yeniden askıya alın ve 40 μm'lik bir filtre ağından bir FACS tüpüne süzün.
    5. Tablo 2'deki antikor konjugatlarını ve canlılık boyası DAPI'yi yerleştirmek için örnekleri 10 kanallı bir sitometre üzerinde analiz edin. Örnek bir kanal kurulumu Tablo 1'de verilmiştir. Sadece dokuz kanal kullanmak da mümkündür; Tablo 2 göstergesine bakın.
    6. Akış sitometrisi verilerinin analizi sırasında, adım 2.4'te ayrıntılı olarak açıklandığı gibi tek renk kontrolleri ve FMO kontrolleri yardımıyla standart spektral kompanzasyon yaklaşımlarını kullanın.

2. Akış sitometrik sıralama için protokol ayarlamaları

  1. Lin- Hazırlanması
    1. Aynı dokudan (BM veya dalak) çıkarılan tüm hücreleri 10 fareden 50 mL'lik bir tüpe toplayın. Büyük bir delik ucuna sahip bir P1000 kullanarak pipetleme yaparak havuza alınan her numuneyi yeniden askıya alın.
    2. Hücreleri 900 x g, 4 ° C'de 10 dakika boyunca döndürün ve süpernatanı aspire edin.
    3. Zenginleştirilmemiş hücreleri kullanarak bölüm 1'de açıklandığı gibi tek renk ve FMO denetimleri hazırlayın.
    4. Lin- hücrelerinin manyetik boncuk zenginleştirmesini kullanarak sıralama için Lin- hücrelerini zenginleştirin:
    5. SB5 ile hücreleri 1 x 108 hücre / mL'de yeniden askıya alın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Normal sıçan serumunu ve Tablo 4'te listelenen biyotinile antikorları ekleyin ve 1 saat boyunca 4 ° C'de sallanarak inkübe edin.
    6. Hücreleri 10 dakika boyunca 900 x g, 4 ° C'de döndürün ve süpernatanı aspire edin. Hücreleri 15 mL soğuk SB5'te yeniden askıya alın.
    7. Hücreleri 10 dakika boyunca 900 x g, 4 ° C'de döndürün ve süpernatanı aspire edin. Soğuk SB5'te hücreleri 1 x 108 hücre / mL'de yeniden askıya alın ve buz üzerinde tutun.
    8. Manyetik nanoboncukları 5-10 s için 3.000 rpm'de vorteksleyin. Her 10 mL hücre için 1 mL manyetik nanoboncuk alın.
    9. Nanoboncukları 5 mL'lik bir FACS tüpünde yıkayın. SB5 ile hacmi 4 mL'ye kadar yükseltin, 900 x g'de, 5 dakika boyunca 4 ° C'de döndürün ve süpernatanı aspire edin.
    10. Nanoboncukları 500 μL SB5'te yeniden askıya alın ve adım 2.1.7'de hazırlanan hücrelerle karıştırın. 4 ° C'de 15 dakika sallanarak inkübe edin.
    11. Hücreleri 10 dakika boyunca 900 x g, 4 ° C'de döndürün ve süpernatanı aspire edin. SB5 ile hücreleri 1 x 108 hücre/mL'de yeniden askıya alın.
    12. Tüpü 5 dakika boyunca 4 ° C'de bir mıknatısa yerleştirin.
    13. Süpernatantı dikkatlice yeni bir 15 mL tüpe dökün.
    14. 2.1.13 adımından itibaren süpernatantı içeren tüpü 5 dakika boyunca 4 ° C'de bir mıknatıs üzerine yerleştirin. Süpernatantı dikkatlice yeni bir 15 mL tüpe dökün.
    15. Hücreleri süpernatanttan 2.1.14 adımında 900 x g, 4 ° C'de 10 dakika boyunca döndürün ve süpernatanı aspire edin.
    16. Lin-zenginleştirilmiş hücreleri 1 mL SB5'te yeniden askıya alın.
    17. SB5'te 1:100'de hücrelerin 10 μL'sini seyreltin. Seyreltilmiş hücrelerin 10 μL'sini 10 μL tripan mavisi ile karıştırın ve bir hemositometre ve / veya hücre sayacına güvenin.
    18. Adım 2.1.17'deki hücre sayısına dayanarak, Lin-ile zenginleştirilmiş hücreleri 33 x 106 hücre / mL'de yeniden askıya alın.
  2. Zenginleştirilmiş hücrelerin boyanması:
    1. Tablo 2'de listelenen tüm antikorları ekleyerek zenginleştirilmiş hücre örneklerini FACS tüplerinde 33 x 106 hücre / mL'de sabitleyin. Her tüpü 3.000 rpm'de 2-3 s vorteks yapın ve daha sonra karanlıkta 2,5 saat sallanarak ışıktan korunarak 4 ° C'de kuluçkaya yatırın.
    2. Hücreleri SB5 ile yıkayın: SB5 ile FACS tüplerinin hacmini 4 mL'ye kadar yapın. Hücreleri 10 dakika boyunca 900 x g, 4 ° C'de döndürün ve süpernatanı çıkarın.
    3. Adım 1.12.5.2'de hazırlandığı gibi 4-6 mL DAPI/SB5'te akış sitometrik analizi için numuneleri yeniden askıya alın ve 40 μm'lik bir filtre ağından yeni bir 4 mL FACS tüpüne süzün.
  3. Örnek sıralama:
    1. CFU-e hücreleri yüksek basınç altında kolayca hasar gördüğünden, CFU-e verimini en üst düzeye çıkarmak için numuneleri büyük bir nozul ve düşük basınçla sıralayın. Bu çalışmada kullanılan akış sitometresi için, 14 psi ve 100 μm nozul veya 130 μm nozul ile 12 psi kullanın. Sıralama kapılarını aşağıdaki adım 2.4'te açıklandığı gibi ayarlayın.
    2. Toplama tamponunu hazırlayın: PBS'ye% 20 fetal sığır serumu ekleyin.
    3. Sıralanmış popülasyonların saflıklarını denetlemek için, adım 1.12.5.2'de açıklandığı gibi, DAPI içeren bir arabellekte her sıralanmış popülasyondan küçük bir aliquot'u yeniden çalıştırın.
      NOT: Tipik olarak, toplam 10 fareden (yaklaşık 1 x 109 hücre) elde edilen BM, yaklaşık% 70'lik bir canlılığa sahip P1-hi, P1-low ve P2 popülasyonlarının her biri için en az 50.000-100.000 hücre verir.
  4. Sıralama kapılarını çözümlemek veya ayarlamak için Şekil 3'te gösterilen geçit stratejisini kullanın.
    1. Büyüklüğüne bağlı olarak kalıntıları kaldırmak için ileri saçılma (FSC) parametresini kullanın. Hücre toplamlarını dışlamak ve tek hücreleri seçmek için FSC yüksekliği ve FSC alanı histogramını kullanın; yan dağılım (SSC)-yüksekliği ve SSC-alan histogramı ile tekrarlayın.
    2. Canlı hücrelerin geçirimsiz olduğu DNA boyası DAPI için pozitif olan hücreleri kapatarak ölü hücreleri hariç tutun.
    3. Lin-Ter119-Kit+ hücrelerini seçin ve bunlardan CD55'i ifade eden bir alt popülasyon seçin.
    4. Lin-Ter119-Kit + CD55 + hücrelerini, CD49f ve CD105 ekspresyonuna dayanarak P6 ve P7 olmak üzere iki ana popülasyona bölün.
    5. CD150 ve CD41 ekspresyonuna dayanarak, P6'yı P3 (bazofil veya mast hücre progenitörleri), P4 (megakaryositik progenitörler) ve P5 (EBMP ve eritroid önyargılı MPP) olarak alt bölümlere ayırın.
    6. CD150 ve CD71'in ifadesine dayanarak, P7'yi P2 (BFU-e), erken CFU-e (P1-düşük) ve geç CFU-e (P1-hi) olarak alt bölümlere ayırın.

Sonuçlar

Protokol, taze hasat edilmiş kemik iliği ve dalak hücrelerinde BFU-es ve CFU-es'yi tanımlamak için akış sitometrik bir yaklaşımı açıklar. Taze BM ve dalağın farelerden toplanması ve dokunun hemen buzun üzerine yerleştirilmesiyle başlar. Tüm prosedürler hücre canlılığını korumak için soğukta gerçekleştirilir. Hücreler, farklılaşmış kan soylarının belirteçlerini ifade eden tüm hücrelerin dışlanmasına izin veren bir "soy" antikor kokteyli ile etiketlenir (FITC-Lin kokteyli, Tablo <...

Tartışmalar

BFU-e ve CFU-e progenitörlerini doğrudan yüksek saflıkta taze dokudan prospektif olarak izole etme yeteneği daha önce araştırmacılardan kaçınmıştı. ScRNAseq ve hücre kaderi tahlilleri 1,27 kullanılarak doğrulanan yeni yaklaşımımız, şimdi bunu yapmak için araçlar sunuyor.

Hem sıralamayı hem de analitik protokolleri başarıyla yürütmek için bir dizi kilit nokta vardır. İlk olarak, düşük yoğunluklu hüc...

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma NIH hibeleri R01DK130498, R01DK120639 ve R01HL141402 tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTA, pH 8.0Life Technologies15575020
1000 µL large orifice tipsUSA sceintific1011-9000
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) AntibodyBioLegend131806
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) AntibodyBioLegend105826
Biotin-CD11bBD Biosciences557395M1/70 (clone)
Biotin-CD19BD Biosciences5537841D3 (clone)
Biotin-CD4BD BiosciencesBDB553045RM4-5 (clone)
Biotin-CD8aBD BiosciencesBDB55302953-6.7 (clone)
Biotin-F4/80Biolegend123106BM8 (clone)
Biotin-Ly-6G and Ly-6CBD Biosciences553125RB6-8C5 (clone)
Biotin-TER-119BD Biosciences553672TER-119 (clone)
Bovine Serum AlbuminSigma aldritchA1470
Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f AntibodyBioLegend313624
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 AntibodyBioLegend133921
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) AntibodyBioLegend115931
BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid CellsBD Biosciences563827
ChromPure Rabbit IgG, whole moleculeJackson ImmunoResearch Laboratories011-000-003
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Life TechnologiesD1306
Digital DIVA hardware and software for LSR IIBD Biosciences
FITC anti-mouse F4/80 AntibodyBioLegend123108
FITC Rat Anti-CD11bBD Biosciences557396
FITC Rat Anti-Mouse CD19BD Biosciences553785
FITC Rat Anti-Mouse CD4BD Biosciences553047
FITC Rat Anti-Mouse CD8aBD Biosciences553031
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6CBD Biosciences553127
FlowJo software FlowJoversion 10Flow cytometer analysis software
LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzerBD BiosciencesFlow cytometer 
NewlineNY Stainless Steel Hand Masher & Bowl, Mortar and Pestle SetAmazon
Normal rat serumStem Cell Technologies13551
PE anti-mouse CD105 AntibodyBioLegend120408
PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 AntibodyBioLegend113812
Phosphate Buffered Saline, 10x SolutionFisher scientificBP3994
Streptavidin NanobeadsBioLegend480016Magnetic beads

Referanslar

  1. Tusi, B. K., et al. Population snapshots predict early haematopoietic and erythroid hierarchies. Nature. 555 (7694), 54-60 (2018).
  2. Socolovsky, M. The role of specialized cell cycles during erythroid lineage development: Insights from single-cell RNA sequencing. International Journal of Hematology. 116 (2), 163-173 (2022).
  3. Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2021).
  4. Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M., Heath, D. S., Robinson, W. A. Properties of Cells that Produce Erythrocytic Colonies In Vitro. Hemopoiesis in Culture. , (1974).
  5. Heath, D. S., Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M. Separation of the erythropoietin-responsive progenitors BFU-E and CFU-E in mouse bone marrow by unit gravity sedimentation. Blood. 47 (5), 777-792 (1976).
  6. Iscove, N. N., Sieber, F. Erythroid progenitors in mouse bone marrow detected by macroscopic colony formation in culture. Experimental Hematology. 3 (1), 32-43 (1975).
  7. Gregory, C. J., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: State of differentiation. Journal of Cell Physiology. 81 (3), 411-420 (1973).
  8. Gregory, C. J., Tepperman, A. D., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: Response of normal and genetically anemic W-W-V mice to manipulations of the erythron. Journal of Cell Physiology. 84 (1), 1-12 (1974).
  9. Gregory, C. J. Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in the hemopoietic system: studies of three erythropoietic colony responses in culture. Journal of Cell Physiology. 89 (2), 289-301 (1976).
  10. Pop, R., et al. A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression. PLoS Biology. 8 (9), 1000484 (2010).
  11. Koulnis, M., et al. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. Journal of Visualized Experiments. (54), e2809 (2011).
  12. Liu, Y., et al. Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in vivo. Blood. 108 (1), 123-133 (2006).
  13. Socolovsky, M., et al. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).
  14. Chen, K., et al. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17413-17418 (2009).
  15. Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2020).
  16. Hidalgo, D., et al. EpoR stimulates rapid cycling and larger red cells during mouse and human erythropoiesis. Nature Communications. 12 (1), 7334 (2021).
  17. Porpiglia, E., Hidalgo, D., Koulnis, M., Tzafriri, A. R., Socolovsky, M. Stat5 signaling specifies basal versus stress erythropoietic responses through distinct binary and graded dynamic modalities. PLoS Biology. 10 (8), 1001383 (2012).
  18. Koulnis, M., et al. Contrasting dynamic responses in vivo of the Bcl-xL and Bim erythropoietic survival pathways. Blood. 119 (5), 1228-1239 (2012).
  19. Shearstone, J. R., et al. Global DNA demethylation during mouse erythropoiesis in vivo. Science. 334 (6057), 799-802 (2011).
  20. Koulnis, M., Liu, Y., Hallstrom, K., Socolovsky, M. Negative autoregulation by Fas stabilizes adult erythropoiesis and accelerates its stress response. PLoS One. 6 (7), 21192 (2011).
  21. Pronk, C. J., et al. Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy. Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).
  22. Dolznig, H., et al. Expansion and differentiation of immature mouse and human hematopoietic progenitors. Methods in Molecular Medicine. 105, 323-344 (2005).
  23. Li, J., et al. Isolation and transcriptome analyses of human erythroid progenitors: BFU-E and CFU-E. Blood. 124 (24), 3636-3645 (2014).
  24. Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: Functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).
  25. Flygare, J., Rayon Estrada, V., Shin, C., Gupta, S., Lodish, H. F. HIF1alpha synergizes with glucocorticoids to promote BFU-E progenitor self-renewal. Blood. 117 (12), 3435-3444 (2011).
  26. Pronk, C. J., Attema, J., Rossi, D. J., Sigvardsson, M., Bryder, D. Deciphering developmental stages of adult myelopoiesis. Cell Cycle. 7 (6), 706-713 (2008).
  27. Khoramian Tusi, B., Socolovsky, M. High-throughput single-cell fate potential assay of murine hematopoietic progenitors in vitro. Experimental Hematology. 60, 21-29 (2018).
  28. Erslev, A. J., Caro, J. Erythropoietin titers in response to anemia or hypoxia. Blood Cells. 13 (1-2), 207-216 (1987).
  29. Koury, M. J., Bondurant, M. C. The molecular mechanism of erythropoietin action. European Journal of Biochemistry. 210 (3), 649-663 (1992).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli im BiyolojisiSay 189Eritropoezak m sitometrisiFACSCFU eBFU eeritroid progenit rler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır