פלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה לתרבית והדמיה תלת-ממדית של אורגנואידים

Summary

מאמר זה מציג פרוטוקול ייצור לסוג חדש של מצע תרבית עם מאות מיקרו-מיכלים למ"מ², שבו ניתן לגדל אורגנואידים בתרבית ולצפות בהם באמצעות מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. פרוטוקולי זריעת התאים ומערכת החיסון מפורטים גם הם.

Abstract

אפיון מספר רב של תרביות אורגנוטיפיות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) בסקאלות רזולוציה שונות מוגבל כיום על ידי גישות הדמיה סטנדרטיות. פרוטוקול זה מתאר דרך להכין שבבי תרבית אורגנואידים מיקרו-מפוברקים, המאפשרים הדמיה חיה תלת-ממדית בקנה מידה רב-ממדי במכשיר ידידותי למשתמש הדורש מניפולציות מינימליות ומסוגל לתפוקת הדמיה של עד 300 אורגנואידים/שעה. שבבי תרבית אלה תואמים הן למטרות אוויר והן למטרות טבילה (אוויר, מים, שמן וסיליקון) ולמגוון רחב של מיקרוסקופים נפוצים (למשל, דיסק מסתובב, סורק נקודתי קונפוקלי, שדה רחב ושדה בהיר). יתר על כן, ניתן להשתמש בהם עם שיטות גיליון אור כגון טכנולוגיית מיקרוסקופ הארה חד-אובייקטיבי וחד-מישורי (SPIM) (soSPIM).

הפרוטוקול המתואר כאן נותן צעדים מפורטים להכנת שבבי התרבית המיקרו-מפוברקים ולתרבית והצביעה של אורגנואידים. רק פרק זמן קצר נדרש כדי להכיר, וניתן למצוא בקלות חומרים מתכלים וציוד במעבדות ביולוגיות רגילות. כאן, יכולות ההדמיה התלת-ממדית יודגמו רק באמצעות מיקרוסקופים סטנדרטיים מסחריים (למשל, דיסק מסתובב לשחזור תלת-ממדי ומיקרוסקופ שדה רחב לניטור שגרתי).

Introduction

בתרביות תאים תלת-ממדיות אורגנוטיפיות, המכונות להלן אורגנואידים, תאי גזע מתמיינים ומתארגנים בעצמם למבנים מרחביים החולקים דמיון מורפולוגי ותפקודי חזק עם איברים אמיתיים. אורגנואידים מציעים מודלים יקרי ערך לחקר הביולוגיה האנושית והתפתחות מחוץ לגוף ^1,2,3. מספר גדל והולך של מודלים מפותחים המחקים את הכבד, המוח, הכליות, הריאות ואיברים רבים אחרים ^2,4,5. התמיינות באורגנואידים מכוונת על ידי תוספת של גורמי גדילה מסיסים ומטריצת חוץ תאיים ברצף זמן מדויק. עם זאת, בניגוד בולט לאיברים, התפתחות אורגנואידים היא הטרוגנית למדי.

מעבר לאתגרים ביולוגיים רבים^6,7, תרביות אורגנואידים מציבות אתגרים טכנולוגיים גם מבחינת שיטות תרביות תאים^, אפיון שעתוק והדמיה. התפתחות איברים In vivo מתרחשת בסביבה ביולוגית הגורמת לארגון עצמי סטריאוטיפי ביותר של סידורי תאים. כל שינוי פנוטיפי יכול לשמש כפרוקסי לאבחון מצב חולה. לעומת זאת, אורגנואידים מתפתחים במבחנה במיקרו-סביבות מבוקרות מינימליות התואמות לתנאי תרבית תאים, וכתוצאה מכך נוצרת שונות גדולה בנתיב ההתפתחות ובהיווצרות הצורה עבור כל אורגנואיד בודד.

מחקר⁸ שנערך לאחרונה הראה כי הדמיה כמותית של צורת אורגנואידים (מתארי פנוטיפ) בשילוב עם הערכה של כמה סמנים גנטיים מאפשרים הגדרה של נופי התפתחות פנוטיפיים. ניתן לטעון כי היכולת לקשר בין מגוון הביטוי הגנומי באורגנואידים לבין התנהגותם הפנוטיפית היא צעד חשוב לקראת שחרור מלוא הפוטנציאל של תרבויות אורגנוטיפיות. לפיכך, היא מבקשת לפתח גישות הדמיה ייעודיות בעלות תוכן גבוה המאפשרות אפיון תכונות אורגנואידים בקנה מידה תת-תאי, רב-תאי ואורגנואיד שלם בתלת-ממד ^9,10.

פיתחנו פלטפורמה רב-תכליתית לסינון תוכן גבוה (HCS) המאפשרת תרבית אורגנואידים יעילה (החל מתאי גזע עובריים אנושיים מבודדים [hESCs], תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם [hIPSCs], או תאים ראשוניים ועד אורגנואידים תלת-ממדיים, רב-תאיים ומובחנים) והדמיה תלת-ממדית מהירה ולא פולשנית. הוא משלב מכשיר תרבית תאים תלת-ממדי ממוזער מהדור הבא, הנקרא שבב JeWells ( השבב להלן), המכיל אלפי מיקרו-בארות ערוכות היטב ומשני צדיהן מראות 45° המאפשרות הדמיה מהירה, תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ אור¹¹ חד-אובייקטיבי. מערכת זו, התואמת לכל מיקרוסקופ הפוך מסחרי סטנדרטי, מאפשרת הדמיה של 300 אורגנואידים בתלת-ממד ברזולוציה תת-תאית תוך <1 שעות.

המיקרו-ייצור של התקן תרבית התאים מתחיל מתבנית מיקרו-מובנית קיימת, שמכילה מאות מיקרו-פירמידות (איור 1A) עם בסיס מרובע ודפנות צדדיות ב-45° ביחס לבסיס. איור 1C מראה תמונות של מבנים כאלה במיקרוסקופ אלקטרונים (EM). התבנית עצמה עשויה פולי(דימתילסילוקסן) (PDMS) וניתן ליצור אותה כהעתק של תבנית ראשונית (לא מוצגת כאן) עם תכונות מתאימות (כחללים) באמצעות הליכים ליתוגרפיים רכים סטנדרטיים. התבנית העיקרית יכולה להיות מיוצרת על ידי הליכים שונים. זה ששימש לפרוטוקול זה נעשה באמצעות תחריט רטוב סיליקון כפי שדווח Galland et al. ¹¹; הליך ייצור התבנית הראשונית אינו קריטי לפרוטוקול זה. הפירמידות מסודרות במערך בריבוע, עם אותו גובה עבור כיווני X ו- Y (במקרה זה המגרש הוא 350 מיקרומטר).

לשם המחשה, פורסמו ניסויי הוכחת היתכנות¹² כדי להדגים כי השבב מאפשר תרבית ארוכת טווח (חודשים) ופרוטוקולי התמיינות תוך הגדרה מדויקת של מספר התאים הראשוניים בבארות. פיתוח אישי של מספר רב של אורגנואידים יכול להיות מנוטר באופן אוטומטי בשידור חי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי של שדה בהיר וגיליון אור תלת-ממדי. יתר על כן, ניתן לאחזר אורגנואידים כדי לבצע חקירות ביולוגיות נוספות (למשל, אנליזה תעתיקית). מאמר זה מתאר פרוטוקולים מפורטים לייצור כיסויי תרבית תאים, הליך הזריעה והצביעה במיקרוסקופ פלואורסצנטי, כמו גם שליפת האורגנואידים.

Protocol

הערה: החלק הראשון של פרוטוקול זה מפרט את המיקרו-פבריקציה של התקן תרבית התא. עובש ראשוני מקורי עם חללים פירמידליים יכול להיות מיוצר בבית - אם מתקני מיקרו ייצור זמינים - או במיקור חוץ לחברות חיצוניות. התבנית העיקרית המשמשת בעבודה זו מיוצרת בתוך הבית, עם שלבי תהליך הייצור המתוארים במקום אחר^11,13. פרוטוקול בסיסי למיקרו-פבריקציה של התבנית זמין בקובץ משלים 1. קריטי: הפעולות בשלבים 1 עד 6 צריכות להתבצע בסביבה נטולת אבק. עדיף מכסה מנוע זרימה למינרי או חדר נקי, אם יש. לאורך כל השלבים הללו, יש להשתמש בציוד מגן אישי (PPE), כגון כפפות, מעיל מעבדה ומשקפי בטיחות.

1. חיתוך תבנית PDMS

1. חתכו חלקים קטנים של תבנית PDMS לממד הדרוש להתקן הסופי (למשל, 1 ס"מ x 1 ס"מ [איור 1B]). חותכים אותם במקביל לכיווני XY של המערך.
   קריטי: בעת חיתוך תבנית PDMS בקוביות בגודל 1 ס"מ x 1 ס"מ, בצע את החתכים בצעדים בודדים; באמצעות סכין גילוח חד-צדדי, הפעילו לחץ וחתכו את ה-PDMS בצעד אחד. זאת כדי למנוע היווצרות של חלקיקים קטנים של PDMS, אשר יכולים להפקיד על פני השטח של התבנית ולהשפיע על איכות שלבי העתק (שלב 3).

2. הכנת מצעי PDMS שטוחים

1. שוקלים ~ 15-20 גרם של שרף בסיס PDMS ו 1.5-2 גרם של סוכן reticulation שלה (כלומר, יחס של 10: 1), לערבב אותם בזהירות, ו degas בצנצנת ואקום במשך ~ 20 דקות.
2. שפכו באיטיות את ה-PDMS נטול הגז על צלחת פטרי מפלסטיק ברוחב 15 ס"מ (קוטר).
3. לרפא את PDMS על ידי שמירת צלחת פטרי בתנור להגדיר על 65 מעלות צלזיוס במשך 2 שעות. לאחר המתנה להשלמת הריפוי, סרט PDMS שטוח בעובי ~1.5 מ"מ (הכלול בצלחת פטרי) מוכן לשימוש (איור 2A).
4. בעזרת להב חד, חתכו חתיכות בגודל 2X2 ס"מ מתוך ה-PDMS (איור 2B-D).
   הערה: העובי המדויק של יריעת PDMS זו אינו קריטי; ~ 1-2 מ"מ הוא טווח מתאים. ממד החיתוך צריך להיות גדול יותר מהתבנית בעלת הטקסטורה אך לא גדול בהרבה, מה שיגרום לבזבוז חומר.

3. ייצור שכבת מרקם העשויה מדבק הניתן לריפוי UV

1. הניחו קוביית תבנית PDMS אחת (כפי שהוכנה בשלב 1) עם הפנים כלפי מטה על גבי חתך PDMS שטוח (כפי שהוכן בשלב 2) (איור 3A,B).
   הערה: ודא שהבליטות הפירמידליות בתבנית מכוונות לכיוון מצע PDMS השטוח ושרק המשטח העליון של הפירמידות הקטועות נמצא במגע. העריכו את המיקום הנכון בעזרת מיקרוסקופ אופטי (איור 3C,D).
2. לצד אחד של התבנית, באמצעות פיפטה, שחררו כמות קטנה (שתי טיפות, בערך 0.1-0.2 מ"ל) של דבק הניתן לריפוי UV (איור 4A).
   הערה: כאשר הנוזל בא במגע עם קצה התבנית, הנימיות תניע את הנוזל למלא את החלל שבין התבנית עצמה לבין החתך השטוח של PDMS המשמש כמצע.
   1. עקבו אחר התקדמות הנוזל בתוך החלל, לדוגמה, באמצעות מיקרוסקופ אופטי הפוך עם יעד הגדלה פי 10 (איור 4B,C).
3. חשוף את הדבק הניתן לריפוי UV לאור UV כדי לרפא אותו. התאם את זמן החשיפה בהתאם לצפיפות ההספק של מקור ה- UV המשמש (למשל, קופסת UV-LED עם צפיפות הספק של 35 mW / cm 2;² דקות בהספק של 50% בפרוטוקול זה כדי לרפא את הדבק לחלוטין).
4. בעזרת הכמות העודפת של הדבק בקצה אחד, החזיקו את הדבק שנרפא על מצע PDMS השטוח על-ידי לחיצה עדינה עם אצבע (איור 5A,B). בינתיים, השתמשו בפינצטה כדי לצבוט פינה אחת של התבנית ליד אותו קצה שמוחזק כלפי מטה ולקלף אותה לאט תוך כדי שאתם מוודאים שהסרט בעל המרקם לא מורם גם כן.
   הערה: איור 5C מציג את התוצאה של הליך הסרת עובש תקין; איור 5E-G מראה הליך שגוי.
5. חתכו את עודפי הדבק ואת מצע ה-PDMS העודף באמצעות סכין גילוח כדי להשאיר את שכבת הדבק המרוסנת, בעלת המרקם והדבק שטוחה על ה-PDMS עם עודפי PDMS בקצה אחד בלבד (איור 5D), שיהיה צורך בשלב 5.

4. הכנת מצע כיסוי

הערה: כמצע למכשיר הסופי, נעשה שימוש בכיסויי 1.5H מעוגלים סטנדרטיים בקוטר 25 מ"מ. לפני שניתן להשתמש בהם, יש לנקות אותם כדי להסיר אבק ו / או שאריות אורגניות מפני השטח שלהם.

1. ניקוי שפתיים בכיסויים
   1. יש לטבול את הכיסויים במי סבון למשך 5 דקות בזמן הפעלת האולטרסאונד (40 קילוהרץ, הספק קולי של 110 ואט).
   2. שטפו את הכיסויים במים נקיים שעברו דה-יוניזציה (DI), תחילה על ידי טבילה ולבסוף עם מי DI זורמים מברז. יבשו את הכיסויים עם אקדח ניפוח גז N₂ .
   3. לטבול את הכיסויים באמבט אצטון במשך 5 דקות; עברו מיד לאמבט עם 2 פרופנולים (IPA) למשך 5 דקות נוספות.
   4. שטפו את הכיסויים עם IPA נקי באמצעות בקבוק לחיצה. יבש את הכיסויים עם אקדח ניפוח גז N₂ .
      הערה: ניתן לאחסן כיסויים שנוקו באמצעות הליך זה במיכל סגור עד לצורך. שמור אותם בארון יבש כדי למנוע שקיעת לחות על פני השטח שלהם.
2. כאשר הוא מוכן לשימוש, טפל בכיסוי נקי בתהליך פלזמה O 2 קצר כדי לשפר את ההידרופיליות שלו: O₂ 20 sccm, לחץ 3 mbar, 60 W בגנרטור כוח RF, ומשך 60 שניות.
3. מיד לאחר הפעלת הפלזמה, המשיכו בציפוי הסחרור של השכבה הדקה של דבק הניתן לריפוי UV על-ידי הנחת המכסה על צ'אק הוואקום של ציפוי ספין סטנדרטי ושפכו טיפה קטנה של דבק במרכז הכיסוי (איור 6). הפעל את תהליך ציפוי הסחרור: התפשטות במשך 5 שניות ב-500 סל"ד, ציפוי ב-3,000 סל"ד במשך 45 שניות (כאשר התאוצה וההאטה נקבעות ל-100 סל"ד לשנייה).
   1. אם ציפוי מסתובב אינו זמין, השתמש בדרך החלופית הבאה כדי לייצר סרט דק של דבק UV על הכיסויים:
      1. על כיסוי נקי, יש לטפטף ~0.1 מ"ל של דבק הניתן לריפוי UV באמצעות פיפטה (איור 7A).
      2. קחו מכסה שני והניחו אותו על גבי הראשון כדי שהדבק הנוזלי יתפזר באופן שווה בין שני הכיסויים (איור 7B-D).
      3. לאחר שהדבק המתפשט הגיע לקצוות הכיסויים, הפרידו ביניהם בעדינות על ידי החלקה אחד על השני. לאחר ההפרדה, שתי הכיסויים מצופות במלואן בשכבה דקה של דבק נוזלי (איור 7E).
         הערה: ייתכן שהציפוי לא יהיה אחיד וחלק רק אם ההפרדה לא נעשית בתנועה חלקה ורציפה.
4. הכנה מוקדמת של דבק הניתן לריפוי UV
   1. לאחר ציפוי סחרור, יש להקדים את הדבק על ידי חשיפה לקרינת UV. התאם את זמן החשיפה בהתאם לצפיפות ההספק של מקור ה- UV המשמש (כאן, תיבת UV-LED עם צפיפות הספק של 35 mW / cm² שימשה במשך דקה אחת בהספק של 50%).
      קריטי: הדבק המשמש כאן הוא דבק אופטי. ראה בדיון נקודות מפתח הקשורות למינוני האנרגיה לריפויו.

5. העברת סרט המרקם למצע הסופי

1. קחו את אחת היריעות בעלות המרקם (שהוכנה בשלב 3) והניחו אותה במגע עם הכיסוי המצופה בדבק (שהוכן בשלב 4). יש לוודא שהמגע בין הדבק שנרפא חלקית על הכיסוי לבין הסרט בעל המרקם אחיד ככל האפשר (איור 8A-C).
   קריטי: בשלב זה, הדבק על הכיסוי צריך להיות מוצק מספיק כדי למנוע זרימה מחדש, אשר ימלא את החללים הפירמידליים של הסרט בעל המרקם כאשר הוא מונח במגע, אך גם יהיה פלסטיק ודבק מספיק כדי שניתן יהיה לייעל מגע על ידי לחיצה עדינה על הסרט בעל המרקם.
2. יש לחשוף את הכיסויים לאור UV עד לריפוי מלא של שכבת הדבק המצופה על הכיסוי. פעולה זו תאטום את היריעה בעלת המרקם על הכיסוי ותספק בידוד חסין דליפה בין חללי הפירמידה.
3. לבסוף, קלפו את המצע השטוח PDMS (איור 8D-F). בעזרת פינצטה, צבטו את ה-PDMS בפינה אחת בקצה שבו נותר חומר עודף לאחר החיתוך (שלב 3.5). בדרך זו, שכבת הסרט בעלת המרקם נשארת דבוקה לכיסוי עם גישה פתוחה בחלק העליון לזריעת תאים. קריטי: בעת קילוף PDMS שטוח, הסרט בעל המרקם צריך להישאר מחובר היטב לכיסוי. כשלים בהידבקות מאושרים בקלות אם ניתן לקלף את היריעה בעלת המרקם מהכיסוי לאחר חשיפה סופית לקרינת UV ללא כל מאמץ.

6. פסיבציה ארוכת טווח של כיסוי תרבית התא לתרבית תאים

הערה: פסיבציה מושגת על ידי יצירת ציפוי קונפורמי ורציף של קופולימר ביומימטי בעל מבנה דומה לקבוצת הפוספוליפידים הקוטבית בקרום התא. ציפוי קונפורמי זה מונע היצמדות תאים למכשיר תרבית התא

1. הכינו תמיסה עם 0.5% (w/v) של קופולימר ביומימטי מומס באתנול טהור. אחסנו את התמיסה בטמפרטורה של 4°C לשימוש עתידי.
2. הניחו את כיסוי תרבית התאים בצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ וכסו אותה במלואה בתמיסת קופולימר ביומימטית.
3. לאחר 5 דקות, הסר את כיסוי תרבית התאים מהמיכל עם תמיסת הקופולימר הביומימטי והשאר אותו להתייבש בטמפרטורת החדר בתוך הצלחת הסופית במכסה מנוע בטיחות ביולוגית (>1 שעות).
   הערה: ניתן לייצר ציפוי עבה יותר על ידי הגדלת ריכוז הקופולימר הביומימטי בתמיסת הציפוי; התוצאות של ציפוי עבה יותר נראות תחת מיקרוסקופ שדה בהיר (איור 9A).

7. זריעת תאים

1. פירוק גזים ועיקור
   1. ממש לפני זריעת תאים, יש לפזר מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS) לתוך צלחות תרבית התאים (בדרך כלל 1 מ"ל עבור צלחת פטרי 35 מ"מ). דגה את המנה עם PBS סטרילי באמצעות מכשיר קולי במשך ~ 10 דקות, ואחריו כמה סיבובים של pipetting כדי להסיר את כל הבועות.
      קריטי: אם אוויר נלכד בתוך חללי הפירמידה, הוא ימנע מהתאים להיכנס אליהם. כדי לוודא שאין אוויר כלוא בפירמידה לפני זריעת תאים, מומלץ לוודא חזותית (תחת מיקרוסקופ שדה בהיר בהגדלה של פי 10 או 20) היעדר אוויר בחללים האלה (איור 10).
   2. החליפו את PBS במדיום תרבית סטרילי ועיקרו את הצלחת באור UV למשך 30 דקות מתחת למכסה מנוע של תרבית תאים.
      הערה: משלב זה ואילך, יש להתייחס למנה כסטרילית ולמניפולציה באמצעות טכניקות סטריליות. דרך חלופית להסיר אוויר כלוא ממכשיר תרבית התאים היא להשתמש בצנצנת ואקום עם משאבת ואקום.
2. הכנת תרחיף תאים
   הערה: ניתן לזרוע תאים כאגרגטים של תאים בודדים או קטנים ולהזין את בארות הדגימה דרך הצמצם העליון. עם הזמן, התאים המוחדרים מצטברים וגדלים בתוך בארות הדגימה לכדורידים בגודל גדול מגודל הצמצם. כמודלים מאומתים של קו תאים, השתמשו בתאי סרטן HCT116 (CCL-247 ATCC) או MCF7 (HTB-22 ATCC) הנשמרים בתווך תרבית מומלץ (הנחיות ATCC).
   1. הכינו תרחיף תאים (למשל, באמצעות תהליך טריפסיניזציה בהתאם להנחיות ATCC). עקוב אחר המלצות להכנת טריפסיניזציה/תרחיף תאים עבור תאי העניין.
   2. ספרו והתאימו את ריכוז התאים ל-0.5 × 10⁶ תאים/מ"ל במדיום התרבית המומלץ.
3. חלוקת תאים
   1. הסר את מאגר PBS מצלחת תרבית התאים בקוטר 35 מ"מ ולאחר מכן הוצא 1 מ"ל של מתלה התא המותאם. ראו איור 11A לתמונה במיקרוסקופ אופטי של תהליך זריעת תאים עם צפיפות תאים והומוגניות נאותות.
   2. החזירו את צלחת תרבית התאים לאינקובטור התא (37°C, 5%_CO2 ו-100% לחות) למשך 10 דקות. כ-80-100 תאים ייכנסו לכל חלל פירמידלי.
      הערה: ניתן להגדיל את מספר התאים בכל צלחת תרבית תאים על ידי הגדלת ריכוז התא או הזמן המושקע לפני הסרת תרחיף התא. בדרך כלל, היווצרות ספרואידים אורכת מספר שעות (תלוי בסוג התא) לאחר זריעת התא וניתן לעקוב אחריה באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (מטרות 4x עד 40x; איור 11). מכאן, ניתן לשנות או להוסיף מדיום תרבית, מטריצות חוץ-תאיות וגורמי גדילה התמיינות לצלחת תרבית התאים המכילה את הספרואידים בהתאם לפרוטוקולי התמיינות אופייניים שיכולים להימשך מספר ימים, שבועות או חודשים.
   3. לאחר הדגירה של 10 דקות, לשחזר את צלחת תרבית התא מן האינקובטור ולשאוף בעדינות את התרחיף התאי כדי להסיר תאים לא לכודים. מוסיפים 1 מ"ל מדיום תרבית לצלחת בקוטר 35 מ"מ ומחזירים אותה לאינקובטור התא.
      קריטי: בשלב זה, מכיוון שהספרואידים עדיין לא נוצרו, חשוב מאוד להימנע משאיפה חזקה או ניפוק שיגרום לאובדן התאים. שליטה חזותית באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד מומלצת מאוד בשלב זה.

8. אימונוסטיין והדמיה

1. קיבוע והכתמה
   הערה: הליכים קלאסיים שונים של קיבוע ו immunostaining תואמים לחלוטין את צלחת תרבית התא. פרוטוקול טיפוסי אחד מתואר כאן.
   1. מקבעים את האורגנואידים/ספרואידים בצלחת תרבית התאים למשך 20 דקות בפרפורמלדהיד 4% בטמפרטורת החדר.
   2. חדרו את האורגנואידים למשך 24 שעות בתמיסת 1% פעילי שטח ב-PBS סטרילי ב-4°C בשייקר אורביטלי ודגרו במשך 24 שעות בחיץ חוסם (אלבומין בסרום בקר 2% [BSA] ו-1% פעילי שטח ב-PBS סטרילי) ב-4°C בשייקר מסלולי.
   3. יש לדגור על הדגימות עם נוגדנים ראשוניים בעלי עניין בדילול בין 1/50 ל-1/200 (או לפי המלצות היצרן) במאגר דילול נוגדנים (2% BSA ו-0.2% חומרים פעילי שטח ב-PBS סטרילי) בטמפרטורה של 4°C למשך 48 שעות.
   4. יש לשטוף את הדגימות 3x עם חיץ כביסה על שייקר אורביטלי (3% NaCl ו-0.2% פעילי שטח ב-PBS סטרילי) ולדגור עם נוגדנים משניים מתאימים במאגר דילול נוגדנים (דילול בין 1/100 ל-1/300 או לפי המלצות היצרן), 0.5 מיקרוגרם/מ"ל 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI), ו-0.2 מיקרוגרם/מ"ל אלקסה פלואור 647 או 488 פלואידין ב-4°C למשך 24 שעות על שייקר מסלולי, ולאחר מכן חמישה שלבי שטיפה עם PBS. לחלופין, הרכיבו את הדגימות באמצעות חומר ניקוי מסיס במים שחומם מראש ל-37°C.
2. דימות
   הערה: בשלב זה, האורגנואידים בצלחת המיקרווול יכולים להיחשב כצלחת תרבית רגילה המכילה דגימות קבועות ומוכתמות להדמיה: ניתן להשתמש בכל הליך הדמיה סטנדרטי ללא צורך בהתאמה או שינוי. איור 12 מדגים תוצאה מייצגת של תמונות ושחזור תלת-ממדי שהתקבלו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב, עם מטרת אוויר של פי 40 (צמצם מספרי 0.75).
   1. השתמש בתוכנת בנאי לתהליך אוטומטי של רכישת תמונה עם ההגדרות הבאות: זמן חשיפה = 50 אלפיות השנייה, עם שלב ממונע Z לקבלת מחסנית Z (1 מיקרומטר Z-step, לגובה כולל של 70 מיקרומטר).
   2. בצע שחזור תלת מימד באמצעות תוכנת ניתוח תמונה.

9. שחרור ואיסוף של אורגנואידים

הערה: ניתן לנתק את שכבת ההדבקה בעלת המרקם של צלחת תרבית התא מתלוש הכיסוי כדי לשחרר את הספרואידים/אורגנואידים החיים (לפני הקיבוע) הכלולים בתוך החללים הפירמידליים לצורך ניתוח התאים עם הליכים אחרים כגון ריצוף RNA, גישות אומיות, ניסויים במבחנה והשתלת in vivo .

1. כאשר הדגימה עדיין בצלחת הפטרי ובמכסה מנוע בטיחות ביולוגית, השתמש בלהב כגון אזמל כדי לחתוך פינה של שכבת הדבק בעלת המרקם.
2. בעזרת פינצטה, צבטו את שכבת הדבק בעלת המרקם בקצה החתוך וקילפו אותה בעדינות מכיסוי הזכוכית, אך השאירו אותה שקועה בתווך (ייתכן שחלק מהאורגנואידים נשארים עם שכבת הדבק, איור 13).
3. יש לשטוף 3 פעמים במדיום תרבית ולאסוף את האורגנואידים על ידי פיפט.

תוצאות

איור 8F מראה את ההיבט הטיפוסי של כיסוי תרבית תאים לאחר ייצור מוצלח. שכבת הדבק הניתנת לריפוי UV נראית שטוחה ונדבקת היטב לכיסוי. העברת שכבת הדבק על תלוש הכיסוי עלולה להיכשל אם השכבה שעל הכיסוי מרומרת יתר על המידה, או אם הסרת מצע ה-PDMS השטוח נעשית באופן שגוי (כפי שמוצג ב...

Discussion

ההליך לייצור צלחת תרבית המיקרווול, המאפשרת תרבית אורגנואידים בצפיפות גבוהה והתמיינות, תואר במאמר זה. בשל הגיאומטריה והסידור של המיקרו-חללים, אלפי ספרואידים ניתנים לתרבית ולהכתמה בצלחת אחת לפרקי זמן ארוכים (מספר שבועות או יותר) כמעט ללא אובדן חומר. לשם השוואה, שטח של 4 מ"מ x 2 מ"מ על צלחת תרבית...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol	Thermofisher scientific	AA19397K7
Acetone	Thermofisher scientific	AA19392K7
BC43 Benchtop Confocal Microscope	Andor Technology		spinning disk confocal microscope
bovine serum albumin	Thermofisher scientific	37525
Buffered oxide etching solution	Merck	901621-1L
CEE Spin Coater	Brewer Science	200X
DAPI	Thermofisher scientific	62248
Developer AZ400K	Merck	18441223164
DI Milliq water	Millipore
Fetal Bovine Serum (FBS)	Invitrogen	10082147
Glass coverslips	Marienfled	117650	1.5H, round 25 mm diameter
Hepes	Invitrogen	15630080
Imaris software	BitPlane		image analysis software
Inverted Transmission optical microscope	Nikon	TSF100-F
Labsonic M	Sartorius Stedium Biotech		Ultrasonic homogenizer
Lipidure	NOF America	CM5206	bio-mimetic copolymer
NOA73	Norland Products	17-345	UV curable adhesive
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15070063
Phalloidin	Thermofisher scientific	A12379	Alexa Fluor
Phosphate Buffer Solution	Thermofisher scientific	10010023
Photo Resist AZ5214E	Merck	14744719710
Pico Plasma tool	Diener Electronic GmbH + Co. KG	Pico Plasma	For O2 plasma treatment
RapiClear 1.52	Sunjin lab	RC 152001	water-soluble clearing agent
RCT Hot Plate/Stirrer	IKA (MY)
Reactive Ion Etching tool	Samco Inc. (JPN)	RIE-10NR
RPMI 1640	Invitrogen	11875093	culture medium for HCT116 cells
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	4019862	Polydimethylsiloxane or in short, PDMS
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma Aldrich	448931-10G
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284	surfactant
Trypsin EDTA	Thermofisher scientific	15400054
Ultrasonic Cleaner	Bransonic	CPX2800
UV-KUB 2	KLOE		UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density
UV mask aligner	SUSS Microtec Semiconductor (DE)	MJB4