オルガノイドの培養および3Dイメージングのためのハイスループットプラットフォーム

要約

この論文は、オルガノイドを培養し、高解像度顕微鏡を使用して観察できる、^mm2あたり数百のマイクロコンテナを備えた新しいタイプの培養基質の製造プロトコルを提示します。細胞播種および免疫染色プロトコルも詳述されています。

要約

さまざまな解像度スケールでの多数の3次元(3D)器官型培養物(オルガノイド)の特性評価は、現在、標準的なイメージングアプローチによって制限されています。このプロトコルは、微細加工されたオルガノイド培養チップを調製する方法を説明しており、最小限の操作を必要とし、最大300オルガノイド/hのイメージングスループットが可能なユーザーフレンドリーな装置でマルチスケールの3Dライブイメージングを可能にします。これらの培養チップは、空気対物レンズと液浸対物レンズ(空気、水、油、シリコーン)の両方、および幅広い一般的な顕微鏡(スピニングディスク、ポイントスキャナー共焦点、広視野、明視野など)と互換性があります。さらに、単一対物レンズ、単一平面照明顕微鏡(SPIM)技術(soSPIM)などのライトシートモダリティで使用できます。

ここで説明するプロトコルは、微細加工された培養チップの調製、およびオルガノイドの培養と染色のための詳細な手順を示しています。慣れるのに必要な時間は短く、消耗品や機器は通常のバイオラボで簡単に見つけることができます。ここでは、3Dイメージング機能は、市販の標準顕微鏡(3D再構成用のスピニングディスクやルーチンモニタリング用の広視野顕微鏡など)でのみ実証されます。

概要

オルガノイドと呼ばれるオルガノタイプ3D細胞培養では、幹細胞は分化し、実際の臓器と強い形態学的および機能的類似性を共有する空間構造に自己組織化します。オルガノイドは、ヒトの生物学と体外での発生を研究するための貴重なモデルを提供します^1,2,3。肝臓、脳、腎臓、肺、および他の多くの臓器を模倣するモデルが増えています^2,4,5。オルガノイドの分化は、可溶性成長因子と細胞外マトリックスを正確な時系列で添加することによって指示されます。しかしながら、臓器とは著しく対照的に、オルガノイドの発達は非常に不均一である。

多くの生物学的課題^6,7に加えて、オルガノイド培養は、細胞培養方法、トランスクリプトミクスの特性評価、およびイメージングの面でも技術的な課題をもたらします。in vivo器官の発達は生物学的環境で起こり、その結果、細胞配置の非常にステレオタイプの自己組織化がもたらされます。任意の表現型の変化は、罹患状態を診断するための代理として使用することができる。対照的に、オルガノイドは、細胞培養条件に適合する最小限の制御された微小環境でin vitroで発達するため、個々のオルガノイドの発生経路と形状形成に大きなばらつきが生じます。

最近の研究⁸では、いくつかの遺伝子マーカーの評価と組み合わせたオルガノイド形状(表現型記述子)の定量的イメージングにより、表現型発生ランドスケープの定義が可能になることが実証されました。おそらく、オルガノイドのゲノム発現の多様性を表現型挙動と関連付ける能力は、オルガノイド培養の可能性を最大限に引き出すための大きな一歩です。したがって、細胞下、多細胞、および全オルガノイドスケールでのオルガノイドの特徴を3D ^9,10で特徴付けることを可能にする、専用のハイコンテントイメージングアプローチの開発が求められています。

当社は、合理化されたオルガノイド培養(単離されたヒト胚性幹細胞[hESC]、ヒト人工多能性幹細胞[hIPSC]、または初代細胞から3D、多細胞、分化型オルガノイドまで)と高速で非侵襲的な3Dイメージングを可能にする汎用性の高いハイコンテントスクリーニング(HCS)プラットフォームを開発しました。これは、JeWellsチップ(以下、 チップ )と呼ばれる次世代の小型3D細胞培養装置を統合しており、45°ミラーに隣接する何千ものウェルアレイマイクロウェルを含み、単一対物レンズライトシート顕微鏡による高速3D高解像度イメージングを可能にします¹¹。標準的な市販の倒立顕微鏡と互換性のあるこのシステムは、300種類のオルガノイドを3Dでイメージングし、細胞内分解能を<1時間で行うことができます。

細胞培養デバイスの微細加工は、正方形のベースとベースに対して45°の側壁を持つ数百のマイクロピラミッド(図1A)を含む既存の微細構造モールドから始まります。 図1C は、このような構造の電子顕微鏡(EM)像を示す。モールド自体はポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)でできており、標準的なソフトリソグラフィー手順を使用して、対応する機能(キャビティとして)を備えた一次モールド(ここには示されていません)のレプリカキャストとして作成できます。一次金型は、さまざまな手順で製造できます。このプロトコルに使用されたものは、Gallandらで報告されているように、シリコンウェットエッチングを使用して作成されました。¹¹;一次金型の製造手順は、このプロトコルにとって重要ではありません。ピラミッドは、X方向とY方向で同じピッチで正方形の配列に配置されます(この場合、ピッチは350μmです)。

実例として、チップがウェル内の初期細胞数を正確に定義しながら、長期培養(月)および分化プロトコルを可能にすることを実証するために、概念実証実験¹² が公開された。多数のオルガノイドの個々の発達は、標準的な明視野および3Dライトシート蛍光顕微鏡を使用してライブで自動的に監視できます。さらに、オルガノイドを取り出して、さらなる生物学的調査(例えば、トランスクリプトミクス解析)を実行することができる。この論文では、細胞培養カバーガラスの作製、蛍光顕微鏡のシードおよび染色手順、およびオルガノイドの検索に関する詳細なプロトコルについて概説します。

プロトコル

注:このプロトコルの最初の部分では、細胞培養デバイスの微細加工について詳しく説明しています。ピラミッド型の空洞を持つオリジナルの一次金型は、微細加工設備があれば社内で製作することも、外部企業に外注することもできます。この作業で使用される一次金型は社内で製造され、製造プロセスのステップは他の場所に記載されています^11、13。金型の微細加工のための基本的なプロトコルは、 補足ファイル1で入手できます。重要:手順1〜6の操作は、ほこりのない環境で実行する必要があります。層流フードまたはクリーンルーム(利用可能な場合)が好ましい。これらの手順を通じて、手袋、白衣、安全メガネなどの個人用保護具(PPE)を使用する必要があります。

1. PDMS金型のダイシング

1. PDMSモールドのごく一部を最終デバイスに必要な寸法(1 cm x 1 cmなど)にカットします[図1B])。配列のXY方向に平行にカットします。
   重要:PDMS金型を1 cm x 1 cmのサイコロに切断する場合は、1つのステップで切断を実行します。片面かみそりの刃を使用して、圧力を加え、1つのステップでPDMSを切断します。これは、金型の表面に堆積し、レプリカステップの品質に影響を与える可能性のあるPDMSの小さな粒子の形成を防ぐためです(ステップ3)。

2. フラットPDMS基板の作製

1. PDMSベースレジン15-20gとその網状化剤1.5-2g(10:1の比率)を量り、慎重に混合し、真空ジャーで~20分間脱気します。
2. 脱気したPDMSを幅15cm(直径)のプラスチック製のペトリ皿にゆっくりと注ぎます。
3. ペトリ皿を65°Cに設定されたオーブンに2時間保持することにより、PDMSを硬化させます。硬化が完了するのを待った後、厚さ~1.5 mmの平らなPDMSフィルム(ペトリ皿に含まれています)を使用できるようになります(図2A)。
4. 鋭利な刃を使用して、PDMSから2 cm x 2 cmの断片を切り取ります(図2B-D)。
   注:このPDMSシートの正確な厚さは重要ではありません。~1-2 mmが適切な範囲です。カットの寸法は、テクスチャモールドよりも大きくする必要がありますが、それほど大きくないため、材料の無駄になります。

3. 紫外線硬化型接着剤によるテクスチャ層の製造

1. 平らなPDMSカット(ステップ2で準備)の上に、PDMSモールドダイス(ステップ1で準備)を裏向きに置きます(図3A、B)。
   注記: 金型内のピラミッド状の突起が平らなPDMS基板に向けられており、ピラミッドの切頭台の上面のみが接触していることを確認してください。光学顕微鏡で正しい配置を評価します(図3C、D)。
2. 金型の片側に、ピペットを使用して、少量(2滴、約0.1〜0.2 mL)のUV硬化型接着剤を滴下します(図4A)。
   注:液体が金型の端に接触すると、毛細管現象によって液体が駆動され、金型自体と基板として使用されるPDMSのフラットカットとの間の空洞が充填されます。
   1. たとえば、10倍の倍率対物レンズを備えた倒立光学顕微鏡を使用して、キャビティ内の液体の進行を追跡します(図4B、C)。
3. UV硬化型接着剤をUV光にさらして硬化させます。使用するUV光源のパワー密度に応じて露光時間を調整します(たとえば、パワー密度が35 mW / cm 2のUV-LEDボックス、このプロトコルでは50%のパワーで²分間接着剤を完全に硬化させます)。
4. 一方の端に過剰量の接着剤を使用して、指で軽く押して、硬化した接着剤を平らなPDMS基板上に保持します(図5A、B)。その間、ピンセットを使用して、押さえられている同じエッジの横にある金型の片隅をつまみ、テクスチャフィルムも持ち上げられないようにしながらゆっくりと剥がします。
   注意: 図5Cは、適切なカビ除去手順の結果を示しています。図 5E-G は、間違った手順を示しています。
5. かみそりの刃を使用して余分な接着剤と余分なPDMS基板をトリミングし、硬化したテクスチャ加工された接着剤層をPDMS上に平らにし、ステップ5で必要になる片方の端だけに余分なPDMSを付けます(図5D)。

4.カバーガラス基板の準備

注:最終デバイスの基板として、直径25mmの標準の丸みを帯びた1.5Hカバーガラスが使用されます。使用する前に、表面からほこりや有機残留物を取り除くために洗浄する必要があります。

1. カバーガラス洗浄
   1. 超音波が適用されている間、カバーガラスを石鹸水に5分間浸します(40 kHz、110 W音響パワー)。
   2. カバーガラスをきれいな脱イオン(DI)水で、最初に浸漬し、最後に蛇口からDI水を流して洗浄します。カバーガラスをN₂ ガスブローガンで乾かします。
   3. カバーガラスをアセトン浴に5分間浸します。すぐに2-プロパノール(IPA)浴にさらに5分間移動します。
   4. スクイーズボトルを使用して、カバーガラスをきれいなIPAですすいでください。N₂ ガスブローガンでカバーガラスを乾かします。
      注意: この手順を使用してクリーニングされたカバーガラスは、必要になるまで密閉容器に保管できます。表面に湿気が付着しないように、乾いたキャビネットに保管してください。
2. 使用する準備ができたら、きれいなカバーガラスを短いO 2プラズマプロセスで処理して親水性を改善します:O₂ 20 sccm、3 mbarの圧力、RF発電機で60 W、および60秒の持続時間。
3. プラズマ活性化の直後に、標準的なスピンコーターの真空チャックにカバーガラスを置き、カバーガラスの中央に接着剤を少量注ぐことにより、UV硬化型接着剤の薄層をスピンコーティングします(図6)。スピンコーティングプロセスを実行します:500rpmで5秒間拡散し、3,000rpmで45秒間コーティングします(加速と減速を100rpm / sに設定)。
   1. スピンコーティングが利用できない場合は、次の別の方法を使用して、カバーガラスにUV接着剤の薄膜を作成します。
      1. 清潔なカバーガラスの上に、ピペットを使用して~0.1 mLのUV硬化型接着剤を滴下します(図7A)。
      2. 2番目のカバーガラスを取り、最初のカバーガラスの上に置き、液体接着剤を2つのカバーガラスの間に均等に広げます(図7B-D)。
      3. 拡散接着剤がカバーガラスの端に到達したら、カバーガラスをスライドさせてゆっくりと分離します。分離されると、両方のカバーガラスは液体接着剤の薄層で完全にコーティングされます(図7E)。
         注意: コーティングは、分離が滑らかで連続的な動きで行われない場合にのみ、均一で滑らかではない可能性があります。
4. 紫外線硬化型接着剤の予備硬化
   1. スピンコーティング後、UVにさらして接着剤をプリキュアします。使用するUV光源のパワー密度に応じて露光時間を調整してください(ここでは、パワー密度35mW / cm² のUV-LEDボックスを50%のパワーで1分間使用しました)。
      クリティカル:ここで使用される接着剤は光学接着剤です。その硬化のためのエネルギー線量に関連する重要なポイントについては、議論を参照してください。

5.テクスチャフィルムの最終基板への転写

1. テクスチャフィルム(手順3で準備)の1つを取り、接着剤でコーティングされたカバーガラス(手順4で準備)に接触させます。カバーガラス上の部分的に硬化した接着剤とテクスチャフィルムとの接触が可能な限り均一であることを確認してください(図8A-C)。
   重要:この段階では、カバーガラスの接着剤は、接触したときにテクスチャフィルムのピラミッド空洞を埋めるリフローを回避するのに十分な固体である必要がありますが、テクスチャフィルムを軽く押すことで接触を最適化できるほどプラスチックで接着性も必要です。
2. カバーガラスにコーティングされた接着剤層が完全に硬化するまで、カバーガラスをUV光にさらします。これにより、カバーガラスのテクスチャフィルムがシールされ、ピラミッド型の空洞間の漏れ防止の分離が提供されます。
3. 最後に、PDMSフラット基板をはがします(図8D-F)。ピンセットを使用して、トリミング後に余分な材料が残ったエッジの一方のコーナーでPDMSをつまみます(ステップ3.5)。このようにして、テクスチャードフィルム層は、細胞播種のために上部にオープンアクセスを備えたカバーガラスに接着されたままになります。重要:平らなPDMSを剥がすとき、テクスチャフィルムはカバーガラスにしっかりと付着したままである必要があります。UVに最後にさらした後、テクスチャフィルムをカバーガラスから簡単に剥がすことができれば、接着不良を簡単に確認できます。

6.細胞培養用カバーガラスの長期パッシベーション

注:パッシベーションは、細胞膜中のリン脂質の極性基と同様の構造を有する生体模倣コポリマーのコンフォーマルで連続的なコーティングを生成することによって達成されます。このコンフォーマルコーティングにより、細胞培養デバイスへの細胞の接着を防ぎます

1. 純粋なエタノールに溶解した0.5%(w / v)の生体模倣コポリマーを含む溶液を調製します。将来の使用のために溶液を4°Cで保管してください。
2. 細胞培養カバーガラスを35 mmのペトリ皿に入れ、生体模倣コポリマー溶液で完全に覆います。
3. 5分後、生体模倣コポリマー溶液の入った容器から細胞培養カバーガラスを取り出し、バイオセーフティフード内の最終皿内で室温で乾燥させます(>1時間)。
   注:コーティング溶液中の生体模倣コポリマーの濃度を上げることにより、より厚いコーティングを生成できます。より厚いコーティングの結果は、明視野顕微鏡で見ることができます(図9A)。

7.細胞播種

1. 脱気と滅菌
   1. 細胞播種の直前に、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を細胞培養ディッシュ(通常、35 mmペトリ皿の場合は1 mL)に分注します。超音波装置を使用して滅菌PBSで皿を~10分間脱気し、その後、すべての気泡を除去するためにピペッティングを数回行います。
      クリティカル:空気がピラミッド空洞内に閉じ込められている場合、細胞がそれらに入るのを防ぎます。細胞播種前にピラミッドに空気が閉じ込められていないことを確認するために、これらの空洞内に空気がないことを視覚的に確認することをお勧めします(10倍または20倍の倍率のベンチトップ明視野顕微鏡の下で)。
   2. PBSを滅菌培地と交換し、細胞培養フードの下でプレートをUV光で30分間滅菌します。
      注意: このステップ以降、皿は無菌と見なされ、無菌技術を使用して操作する必要があります。細胞培養装置から閉じ込められた空気を除去する別の方法は、真空ポンプを備えた真空ジャーを使用することです。
2. 細胞懸濁液の調製
   注:細胞は単一または小さな細胞凝集体として播種し、上部開口部からサンプルウェルに入ることができます。時間が経つにつれて、挿入された細胞は凝集し、サンプルウェル内でアパーチャのサイズよりも大きいサイズのスフェロイドに成長します。検証済みの細胞株モデルとして、推奨培地(ATCCガイドライン)で維持されているHCT116(CCL-247 ATCC)またはMCF7(HTB-22 ATCC)がん細胞を使用してください。
   1. 細胞懸濁液を調製する(例えば、ATCCガイドラインに従ったトリプシン処理を用いる)。目的の細胞に対するトリプシン処理/細胞懸濁液調製の推奨事項に従ってください。
   2. 推奨培地で細胞濃度をカウントし、0.5×10⁶ 細胞/mLに調整します。
3. セル分注
   1. 35 mm細胞培養皿からPBSバッファーを除去し、調整した細胞懸濁液1 mLを分注します。適切な細胞密度と均質性を備えた細胞播種手順の光学顕微鏡画像については 、図11A を参照してください。
   2. 細胞培養皿を細胞インキュベーター(37°C、5%_CO2、湿度100%)に10分間戻します。約80〜100個の細胞が各錐体腔に入ります。
      注:細胞濃度または細胞懸濁液除去までの時間を増やすことにより、細胞培養皿あたりの細胞数を増やすことができます。通常、スフェロイド形成は細胞播種後数時間(細胞の種類によって異なります)かかり、明視野顕微鏡(4倍から40倍の対物レンズ; 図11)。ここから、培養培地、細胞外マトリックス、および分化増殖因子は、数日、数週間、または数ヶ月続く可能性のある典型的な分化プロトコルに従って、スフェロイドを含む細胞培養皿に変更または添加することができます。
   3. 10分間のインキュベーション後、細胞培養皿をインキュベーターから回収し、細胞懸濁液を穏やかに吸引して、閉じ込められていない細胞を除去します。1 mLの培養液を35 mmディッシュに加え、セルインキュベーターに戻します。
      クリティカル:この段階では、スフェロイドはまだ形成されていないため、細胞の損失につながる強い吸引や分注を避けることが非常に重要です。このステップでは、ベンチトップ明視野顕微鏡を使用した視覚制御を強くお勧めします。

8. 免疫染色とイメージング

1. 固定と染色
   注:固定と免疫染色の異なる古典的な手順は、細胞培養皿と完全に互換性があります。ここでは、一般的なプロトコルの 1 つについて説明します。
   1. オルガノイド/スフェロイドを細胞培養皿に4%パラホルムアルデヒド溶液中で室温で20分間固定します。
   2. オルガノイドをオービタルシェーカー上で4°Cの滅菌PBS中の1%界面活性剤溶液中で24時間透過処理し、オービタルシェーカー上で4°Cでブロッキングバッファー(2%ウシ血清アルブミン[BSA]および滅菌PBS中の1%界面活性剤)中で24時間インキュベートします。
   3. 目的の一次抗体を含むサンプルを、抗体希釈バッファー(滅菌PBS中の2%BSAおよび0.2%界面活性剤)で4°Cで48時間、1/50〜1/200の希釈(またはメーカーの推奨に従って)でインキュベートします。
   4. サンプルをオービタルシェーカー上の洗浄バッファー(滅菌PBS中の3%NaClおよび0.2%界面活性剤)で3回すすぎ、抗体希釈バッファー(1/100〜1/300またはメーカーの推奨による希釈)、0.5 μg/mL 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)、および0.2 μg/mL Alexa Fluor 647または488ファロイジンをオービタルシェーカー上で4°Cで24時間インキュベートします。 その後、PBSで5回のすすぎステップを行います。オプションで、37°Cに予熱した水溶性透明化剤を使用してサンプルをマウントします。
2. イメージング
   注:この段階では、マイクロウェルプレート内のオルガノイドは、イメージング用の固定および染色サンプルを含む通常の培養皿と見なすことができます:適応や変更を必要とせずに、標準的なイメージング手順を使用できます。 図12 は、スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて得られた画像と3D再構成の代表的な結果を示しており、40倍の空気対物レンズ(開口数0.75)を有する。
   1. 自動画像取得プロセスには、露光時間=50ms、z電動ステージでzスタック(1μmのZステップ、全高70μm)を取得できる設定でコンストラクタソフトウェアを使用します。
   2. 画像解析ソフトで3D再構成を行います。

9. オルガノイドの放出と回収

注:細胞培養皿のテクスチャード加工された接着剤層をカバーガラスから剥離して、錐体腔内に含まれる生きたスフェロイド/オルガノイド(固定前)を放出し、RNAシーケンシング、オミクスアプローチ、in vitro 実験、 in vivo 移植などの他の手順で細胞を分析することができます。

1. サンプルをペトリ皿とバイオセーフティフードに入れたまま、メスなどの刃を使用して、テクスチャード加工された接着剤層の角を切り取ります。
2. ピンセットを使用して、切り口のテクスチャード加工された接着剤層をつまみ、ガラスカバーガラスからそっと剥がしますが、培地に浸したままにします(一部のオルガノイドが接着剤層に残っている場合があります、 図13)。
3. 培養液で3回すすぎ、ピペッティングでオルガノイドを回収します。

結果

図8F は、作製が成功した後の細胞培養カバーガラスの典型的な側面を示す。UV硬化型接着剤層は平らに見え、カバーガラスによく接着します。カバーガラス上の層が過剰に硬化している場合、または平らなPDMS基板の除去が正しく行われていない場合( 図8G、Hに示すように)、カバーガラス上の接着剤層の転写が失敗する可能性がありま?...

ディスカッション

高密度オルガノイド培養と分化を可能にするマイクロウェル培養皿の作製手順は、この論文に記載されています。微小空洞の形状と配置により、数千のスフェロイドを1枚のプレートで長期間(数週間以上)培養および染色することができ、材料の損失はほとんどありません。比較として、細胞培養プレート上の4 mm x 2 mmの領域には、12 cm x 8 cmの面積を持つ単一の384ウェルプレートと同じ数のス?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol	Thermofisher scientific	AA19397K7
Acetone	Thermofisher scientific	AA19392K7
BC43 Benchtop Confocal Microscope	Andor Technology		spinning disk confocal microscope
bovine serum albumin	Thermofisher scientific	37525
Buffered oxide etching solution	Merck	901621-1L
CEE Spin Coater	Brewer Science	200X
DAPI	Thermofisher scientific	62248
Developer AZ400K	Merck	18441223164
DI Milliq water	Millipore
Fetal Bovine Serum (FBS)	Invitrogen	10082147
Glass coverslips	Marienfled	117650	1.5H, round 25 mm diameter
Hepes	Invitrogen	15630080
Imaris software	BitPlane		image analysis software
Inverted Transmission optical microscope	Nikon	TSF100-F
Labsonic M	Sartorius Stedium Biotech		Ultrasonic homogenizer
Lipidure	NOF America	CM5206	bio-mimetic copolymer
NOA73	Norland Products	17-345	UV curable adhesive
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15070063
Phalloidin	Thermofisher scientific	A12379	Alexa Fluor
Phosphate Buffer Solution	Thermofisher scientific	10010023
Photo Resist AZ5214E	Merck	14744719710
Pico Plasma tool	Diener Electronic GmbH + Co. KG	Pico Plasma	For O2 plasma treatment
RapiClear 1.52	Sunjin lab	RC 152001	water-soluble clearing agent
RCT Hot Plate/Stirrer	IKA (MY)
Reactive Ion Etching tool	Samco Inc. (JPN)	RIE-10NR
RPMI 1640	Invitrogen	11875093	culture medium for HCT116 cells
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	4019862	Polydimethylsiloxane or in short, PDMS
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma Aldrich	448931-10G
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284	surfactant
Trypsin EDTA	Thermofisher scientific	15400054
Ultrasonic Cleaner	Bransonic	CPX2800
UV-KUB 2	KLOE		UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density
UV mask aligner	SUSS Microtec Semiconductor (DE)	MJB4