Высокопроизводительная платформа для культуры и 3D-визуализации органоидов

Резюме

В этой статье представлен протокол изготовления нового типа культуральной подложки с сотнями микроконтейнеров на^мм2, в котором органоиды можно культивировать и наблюдать с помощью микроскопии высокого разрешения. Протоколы посева клеток и иммуноокрашивания также детализированы.

Аннотация

Характеристика большого количества трехмерных (3D) оловоорганических культур (органоидов) в различных масштабах разрешения в настоящее время ограничена стандартными подходами к визуализации. Этот протокол описывает способ подготовки микрофабрикированных чипов органоидных культур, которые обеспечивают многомасштабную 3D-визуализацию в реальном времени на удобном для пользователя инструменте, требующем минимальных манипуляций и способном к пропускной способности до 300 органоидов в час. Эти микросхемы культуры совместимы как с воздушными, так и с погружными объективами (воздух, вода, масло и силикон) и широким спектром распространенных микроскопов (например, вращающийся диск, конфокальный точечный сканер, широкое поле и яркое поле). Кроме того, они могут использоваться с модальностями светового листа, такими как технология однообъективной одноплоскостной микроскопии освещения (SPIM) (soSPIM).

Протокол, описанный здесь, дает подробные этапы для приготовления микрофабрикированных чипов культуры, а также культивирования и окрашивания органоидов. Для ознакомления требуется лишь небольшой промежуток времени, а расходные материалы и оборудование можно легко найти в обычных биолабораториях. Здесь возможности 3D-визуализации будут продемонстрированы только с помощью коммерческих стандартных микроскопов (например, вращающийся диск для 3D-реконструкции и широкоугольная микроскопия для рутинного мониторинга).

Введение

В органотипических 3D-клеточных культурах, далее называемых органоидами, стволовые клетки дифференцируются и самоорганизуются в пространственные структуры, которые имеют сильное морфологическое и функциональное сходство с реальными органами. Органоиды предлагают ценные модели для изучения биологии человека и развития вне организма ^1,2,3. Все большее число моделей разрабатывается, которые имитируют печень, мозг, почки, легкие и многие другие органы ^2,4,5. Дифференцировка в органоидах направляется добавлением растворимых факторов роста и внеклеточного матрикса в точной временной последовательности. Однако в отличие от органов, развитие органоидов довольно неоднородно.

Помимо многочисленных биологических проблем ^6,7, органоидные культуры также создают технологические проблемы с точки зрения методов культивирования клеток, характеристики транскриптомики и визуализации. Развитие органов in vivo происходит в биологической среде, что приводит к крайне стереотипной самоорганизации клеточных устройств. Любое фенотипическое изменение может быть использовано в качестве прокси для диагностики болезненного состояния. Напротив, органоиды развиваются in vitro в минимально контролируемых микросредах, совместимых с условиями клеточной культуры, что приводит к большой изменчивости пути развития и формирования формы для каждого отдельного органоида.

Недавнее исследование⁸ показало, что количественная визуализация органоидной формы (дескрипторы фенотипа) в сочетании с оценкой нескольких генетических маркеров позволяет определить фенотипические ландшафты развития. Можно утверждать, что способность соотносить разнообразие геномной экспрессии в органоидах с их фенотипическим поведением является важным шагом на пути к раскрытию всего потенциала органотипических культур. Таким образом, это требует разработки специализированных подходов к визуализации с высоким содержанием, позволяющих характеризовать органоидные особенности в субклеточных, многоклеточных и цельноорганоидных масштабах в 3D ^9,10.

Мы разработали универсальную платформу скрининга с высоким содержанием (HCS), позволяющую оптимизировать органоидную культуру (от изолированных эмбриональных стволовых клеток человека [hESCs], индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток [hIPSC] или первичных клеток до 3D, многоклеточных, дифференцированных органоидов) и быструю, неинвазивную 3D-визуализацию. Он интегрирует миниатюрное устройство 3D-культуры клеток следующего поколения, называемое чипом JeWells ( чип ниже), которое содержит тысячи хорошо расположенных микролунок, окруженных зеркалами 45°, которые позволяют быстро получать 3D-изображения с высоким разрешением с помощью однообъективной световой листовой микроскопии¹¹. Совместимая с любым стандартным, коммерческим, инвертированным микроскопом, эта система позволяет визуализировать 300 органоидов в 3D с субклеточным разрешением за <1 ч.

Микропроизводство устройства для культивирования клеток начинается с существующей микроструктурированной формы, которая содержит сотни микропирамид (рисунок 1А) с квадратным основанием и боковыми стенками под углом 45° по отношению к основанию. На рисунке 1С показаны изображения таких структур в электронном микроскопе (ЭМ). Сама форма изготовлена из поли(диметилсилоксана) (PDMS) и может быть изготовлена в виде реплики отливки первичной формы (не показана здесь) с соответствующими характеристиками (в виде полостей) с использованием стандартных мягко-литографических процедур. Первичная форма может быть изготовлена различными процедурами. Тот, который использовался для этого протокола, был сделан с использованием кремниевого влажного травления, как сообщалось в Galland et al. ¹¹; процедура изготовления первичной формы не является критической для этого протокола. Пирамиды расположены в квадратном массиве, с одинаковым шагом для направлений X и Y (в этом случае шаг составляет 350 мкм).

В качестве иллюстрации были опубликованы экспериментальные эксперименты¹² , чтобы продемонстрировать, что чип допускает долгосрочную культуру (месяцы) и протоколы дифференцировки, точно определяя количество начальных ячеек в скважинах. Индивидуальное развитие большого количества органоидов может автоматически контролироваться в режиме реального времени с помощью стандартных ярко-полевых и 3D-флуоресцентных микроскопов. Кроме того, органоиды могут быть извлечены для выполнения дальнейших биологических исследований (например, транскриптомного анализа). В этой статье описываются подробные протоколы изготовления покровных пластинок клеточной культуры, процедура посева и окрашивания для флуоресцентной микроскопии, а также извлечение органоидов.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: В первой части этого протокола подробно описывается микропроизводство устройства для культивирования клеток. Оригинальная первичная форма с пирамидальными полостями может быть изготовлена собственными силами, если имеются микроизготовительные установки, или передана на аутсорсинг внешним компаниям. Первичная пресс-форма, используемая в этой работе, производится собственными силами, а этапы процесса изготовления описаны в другом месте^11,13. Базовый протокол микрофабрикации пресс-формы доступен в дополнительном файле 1. КРИТИЧЕСКИЙ: Операции на этапах с 1 по 6 должны проводиться в свободной от пыли среде. Предпочтительнее ламинарный вытяжка или чистая комната, если таковая имеется. На всех этих этапах необходимо использовать средства индивидуальной защиты (СИЗ), такие как перчатки, лабораторный халат и защитные очки.

1. Нарезка пресс-формы PDMS

1. Отрежьте небольшие участки формы PDMS до размера, необходимого для конечного устройства (например, 1 см x 1 см [Рисунок 1B]). Вырежьте их параллельно направлениям XY массива.
   КРИТИЧЕСКИЙ: При резке формы PDMS на кубики размером 1 см х 1 см выполняйте разрезы в один этап; используя односторонний бритвенный клинок, примените давление и прорежьте PDMS за один шаг. Это делается для предотвращения образования мелких частиц PDMS, которые могут оседать на поверхности пресс-формы и влиять на качество стадий реплики (этап 3).

2. Подготовка плоских подложек PDMS

1. Взвесьте ~15-20 г базовой смолы PDMS и 1,5-2 г ее сетчатого агента (т.е. соотношение 10:1), тщательно перемешайте их и дегазируйте в вакуумной банке в течение ~20 мин.
2. Медленно вылейте дегазированную PDMS на пластиковую чашку Петри шириной 15 см (диаметром).
3. Вылечите PDMS, храня чашку Петри в духовке при температуре 65°C в течение 2 ч. После ожидания завершения отверждения плоская пленка PDMS толщиной ~1,5 мм (содержащаяся в чашке Петри) готова к использованию (рисунок 2A).
4. С помощью острого лезвия вырежьте из PDMS куски размером 2 см х 2 см (рисунок 2B-D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Точная толщина этого листа PDMS не является критической; ~1-2 мм является подходящим диапазоном. Размер для разреза должен быть больше, чем текстурированная форма, но не намного больше, что приведет к потере материала.

3. Производство текстурированного слоя из УФ-отверждаемого клея

1. Поместите один кубик формы PDMS (подготовленный на этапе 1) лицевой стороной вниз поверх плоского разреза PDMS (как подготовлено на этапе 2) (рисунок 3A, B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что пирамидальные выступы в пресс-форме ориентированы на плоскую подложку PDMS и что только верхняя поверхность усеченных пирамид находится в контакте. Оцените правильное размещение с помощью оптического микроскопа (рисунок 3C,D).
2. На одну сторону формы, используя пипетку, опустите небольшое количество (две капли, примерно 0,1-0,2 мл) УФ-отверждаемого клея (рисунок 4А).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Когда жидкость вступает в контакт с краем формы, капиллярность будет заставлять жидкость заполнять полость между самой формой и плоским срезом PDMS, используемым в качестве подложки.
   1. Проследите за прогрессированием жидкости внутри полости, например, с помощью перевернутого оптического микроскопа с 10-кратным увеличением объектива (рисунок 4B, C).
3. Подвергайте УФ-отверждаемый клей воздействию ультрафиолетового света, чтобы вылечить его. Отрегулируйте время воздействия в зависимости от плотности мощности используемого УФ-источника (например, УФ-светодиодная коробка с плотностью мощности 35 мВт/^см2; 2 мин при 50% мощности в этом протоколе для полного отверждения клея).
4. Используя избыточное количество клея на одном краю, удерживайте отвержденный клей на плоской подложке PDMS, осторожно надавливая пальцем (рисунок 5A,B). Между тем, используйте пинцет, чтобы зажать один угол формы рядом с тем же краем, который удерживается, и медленно отклеить его, убедившись, что текстурированная пленка также не поднимается вверх.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 5C показан результат правильной процедуры удаления плесени; На рисунке 5E-G показана неправильная процедура.
5. Обрежьте избыток клея и избыточную подложку PDMS с помощью лезвия бритвы, чтобы оставить отвержденный, текстурированный, клеевой слой плоским на PDMS с избытком PDMS только на одном краю (рисунок 5D), что потребуется на этапе 5.

4. Подготовка покровного субстрата

ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве подложки для конечного устройства используются стандартные закругленные крышки 1,5Н диаметром 25 мм. Прежде чем их можно будет использовать, их необходимо очистить, чтобы удалить пыль и / или органический остаток с их поверхности.

1. Очистка крышки
   1. Погрузите крышки в мыльную воду на 5 мин во время применения ультразвука (40 кГц, звуковая мощность 110 Вт).
   2. Промойте крышки в чистой деионизированной (DI) воде, сначала погружением и, наконец, проточной водой DI из-под крана. Высушите крышки_{газовым} выдувным пистолетом N2.
   3. Погрузите крышки в ацетоновую ванну на 5 мин; сразу же перейти к 2-пропанольной (IPA) ванне еще на 5 мин.
   4. Промойте крышки чистым IPA с помощью бутылочки для выжимания. Высушите крышки газовым выдувным пистолетом N₂ .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чехлы, очищенные с помощью этой процедуры, можно хранить в закрытом контейнере до тех пор, пока это не понадобится. Храните их в сухом шкафу, чтобы избежать осаждения влаги на их поверхности.
2. Когда он будет готов к использованию, обработайте чистый покров коротким плазменным процессом O₂ для улучшения его гидрофильности: O₂ 20 sccm, давление 3 мбар, 60 Вт в радиочастотном генераторе и продолжительность 60 с.
3. Сразу после плазменной активации приступайте к спин-покрытию тонкого слоя УФ-отверждаемого клея, помещая крышку на вакуумный патрон стандартного спин-коатера и заливая небольшую каплю клея в центр обтекателя (рисунок 6). Запустите процесс спин-покрытия: разбрасывание в течение 5 с при 500 об/мин, покрытие при 3000 об/мин в течение 45 с (с ускорением и замедлением на уровне 100 об/с).
   1. Если спин-покрытие недоступно, используйте следующий альтернативный способ получения тонкой пленки УФ-клея на крышках:
      1. На чистый покров капли ~0,1 мл УФ-отверждаемого клея с помощью пипетки (рисунок 7А).
      2. Возьмите второй обшивочный лист и поместите его поверх первого, чтобы жидкий клей равномерно распределился между двумя крышками (рисунок 7B-D).
      3. Как только растекающийся клей достигнет краев чехлов, аккуратно разделите их, скользя один над другим. После разделения оба обтекателя полностью покрываются тонким слоем жидкого клея (рисунок 7E).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытие может быть неравномерным и гладким только в том случае, если разделение не осуществляется плавным и непрерывным движением.
4. Предварительное отверждение УФ-отверждаемого клея
   1. После спин-покрытия предварительно нанесите клей под воздействием ультрафиолета. Отрегулируйте время экспозиции в зависимости от плотности мощности используемого УФ-источника (здесь в течение 1 мин при 50% мощности использовалась УФ-светодиодная коробка плотностью мощности 35 мВт/^см2 ).
      КРИТИЧЕСКИЙ: Клей, используемый здесь, является оптическим клеем. Смотрите обсуждение ключевых моментов, связанных с энергетическими дозами для его лечения.

5. Перенос текстурированной пленки на конечную подложку

1. Возьмите одну из текстурированных пленок (подготовленную на этапе 3) и поместите ее в контакт с покрытой клеем крышкой (подготовленной на этапе 4). Убедитесь, что контакт между частично отвержденным клеем на крышке и текстурированной пленкой является как можно более однородным (рисунок 8A-C).
   КРИТИЧЕСКИЙ: На этом этапе клей на крышке должен быть достаточно твердым, чтобы избежать переплавки, которая заполнила бы пирамидальные полости текстурированной пленки при контакте, но также была бы достаточно пластичной и клейкой, чтобы контакт можно было оптимизировать, осторожно надавливая на текстурированную пленку.
2. Подвергайте крышки воздействию ультрафиолетового излучения до тех пор, пока клеевой слой, покрытый на крышке, не будет полностью отвержден. Это запечатает текстурированную пленку на крышке и обеспечит герметичную изоляцию между пирамидальными полостями.
3. Наконец, снимите плоскую подложку PDMS (рисунок 8D-F). Используя пинцет, зажмите PDMS на один угол по краю, где после обрезки остался лишний материал (шаг 3.5). Таким образом, текстурированный слой пленки остается клеевым к крышке с открытым доступом в верхней части для посева клеток. КРИТИЧЕСКИЙ: При отслаивании плоской PDMS текстурированная пленка должна хорошо прикрепляться к крышке. Отказы адгезии легко подтверждаются, если текстурированная пленка может быть отслоена от крышки после окончательного воздействия ультрафиолета без каких-либо усилий.

6. Длительная пассивация покрова клеточной культуры для клеточной культуры

ПРИМЕЧАНИЕ: Пассивация достигается путем создания конформного и непрерывного покрытия биомиметического сополимера со структурой, аналогичной полярной группе фосфолипидов в клеточной мембране. Это конформное покрытие предотвращает адгезию клеток к устройству клеточной культуры

1. Готовят раствор с 0,5% (мас./об.) биомиметического сополимера, растворенного в чистом этаноле. Храните раствор при температуре 4 °C для будущего использования.
2. Поместите покров клеточной культуры в чашку Петри 35 мм и полностью накройте ее раствором биомиметического сополимера.
3. Через 5 мин вынимают покров клеточной культуры из емкости с раствором биомиметического сополимера и оставляют сушиться при комнатной температуре внутри конечной посуды в вытяжке биобезопасности (>1 ч).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Более толстое покрытие может быть получено путем увеличения концентрации биомиметического сополимера в растворе покрытия; результаты более толстого покрытия видны под микроскопом яркого поля (рисунок 9А).

7. Посев клеток

1. Дегазация и стерилизация
   1. Непосредственно перед посевом клеток дозируйте стерильный фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) в чашки для культивирования клеток (обычно 1 мл для чашки Петри толщиной 35 мм). Дегазируйте блюдо со стерильным PBS с помощью ультразвукового устройства в течение ~ 10 минут с последующим несколькими раундами пипетки, чтобы удалить все пузырьки.
      КРИТИЧЕСКИЙ: Если воздух захвачен внутри пирамидальных полостей, это предотвратит попадание клеток в них. Чтобы убедиться, что в пирамиде нет воздуха, захваченного перед посевом клеток, рекомендуется визуально обеспечить (под настольным микроскопом Brightfield при 10-кратном или 20-кратном увеличении) отсутствие воздуха в этих полостях (рисунок 10).
   2. Замените PBS стерильной питательной средой и стерилизуйте пластину ультрафиолетовым светом в течение 30 минут под вытяжкой клеточной культуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого шага, блюдо следует рассматривать как стерильное и манипулировать с использованием стерильных методов. Альтернативным способом удаления захваченного воздуха из устройства культивирования клеток является использование вакуумной банки с вакуумным насосом.
2. Приготовление клеточной суспензии
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки могут быть засеяны как одно- или мелкоклеточные агрегаты и входить в пробные колодцы через верхнюю апертуру. Со временем вставленные клетки агрегируются и вырастают внутри пробных колодцев в сфероиды размером, превышающим размер отверстия. В качестве проверенных моделей клеточных линий используйте раковые клетки HCT116 (CCL-247 ATCC) или MCF7 (HTB-22 ATCC), хранящиеся в рекомендуемой культуральной среде (руководящие принципы ATCC).
   1. Приготовьте клеточную суспензию (например, используя процесс трипсинизации в соответствии с рекомендациями ATCC). Следуйте рекомендациям по трипсинизации/приготовлению клеточной суспензии для интересующих клеток.
   2. Подсчитайте и отрегулируйте концентрацию клеток до 0,5 × 10⁶ клеток/мл в рекомендуемой питательной среде.
3. Дозирование клеток
   1. Извлеките буфер PBS из чашки для культивирования клеток толщиной 35 мм, а затем дозируйте 1 мл скорректированной клеточной суспензии. См. рисунок 11А для изображения в оптический микроскоп процедуры посева клеток с адекватной плотностью и однородностью клеток.
   2. Поместите чашку для культивирования клеток обратно в клеточный инкубатор (37 °C, 5% CO₂ и 100% влажность) на 10 мин. Примерно 80-100 клеток войдут в каждую пирамидальную полость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно увеличить количество клеток на чашку для клеточной культуры, увеличив либо концентрацию клеток, либо время, затраченное на удаление клеточной суспензии. Как правило, формирование сфероидов занимает несколько часов (в зависимости от типа клеток) после посева клеток и может сопровождаться ярким микроскопом (от 4x до 40x объективов; Рисунок 11). Отсюда культуральная среда, внеклеточные матрицы и факторы роста дифференцировки могут быть изменены или добавлены в чашку клеточной культуры, содержащую сфероиды, в соответствии с типичными протоколами дифференцировки, которые могут длиться несколько дней, недель или месяцев.
   3. После 10-минутной инкубации извлеките чашку для культивирования клеток из инкубатора и осторожно аспирируйте клеточную суспензию, чтобы удалить непопадающие клетки. Добавьте 1 мл питательной среды в посуду диаметром 35 мм и поместите обратно в клеточный инкубатор.
      КРИТИЧЕСКИЙ: На этом этапе, поскольку сфероиды еще не сформировались, очень важно избегать сильной аспирации или дозирования, которые приведут к потере клеток. Визуальный контроль с помощью настольного микроскопа Brightfield настоятельно рекомендуется на этом этапе.

8. Иммуноокрашивание и визуализация

1. Фиксация и окрашивание
   ПРИМЕЧАНИЕ: Различные классические процедуры фиксации и иммуноокрашивания полностью совместимы с чашкой для клеточной культуры. Один типичный протокол описан здесь.
   1. Зафиксируйте органоиды/сфероиды в чашке для клеточной культуры в течение 20 мин в 4% параформальдегиде при комнатной температуре.
   2. Пермеабилизируют органоиды в течение 24 ч в 1% растворе поверхностно-активного вещества в стерильном PBS при 4 °C на орбитальном шейкере и инкубируют в течение 24 ч в блокирующем буфере (2% бычьего сывороточного альбумина [BSA] и 1% поверхностно-активного вещества в стерильном PBS) при 4 °C на орбитальном шейкере.
   3. Инкубировать образцы с первичными антителами, представляющими интерес, в разведении между 1/50 и 1/200 (или в соответствии с рекомендациями производителя) в буфере разбавления антител (2% BSA и 0,2% поверхностно-активного вещества в стерильном PBS) при 4 °C в течение 48 ч.
   4. Промыть образцы 3x с промывочным буфером на орбитальном шейкере (3% NaCl и 0,2% поверхностно-активного вещества в стерильном PBS) и инкубировать с соответствующими вторичными антителами в буфере разбавления антител (разбавление между 1/100 и 1/300 или в соответствии с рекомендациями производителя), 0,5 мкг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и 0,2 мкг/мл Alexa Fluor 647 или 488 фаллоидин при 4 °C в течение 24 ч на орбитальном шейкере, затем следуют пять шагов полоскания с помощью PBS. Опционально монтируйте образцы с помощью водорастворимого очищающего агента, предварительно расплавленного до 37 °C.
2. Отображение
   ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе органоиды в микролуночной пластине можно рассматривать как обычную культуральную чашку, содержащую фиксированные и окрашенные образцы для визуализации: любая стандартная процедура визуализации может быть использована без адаптации или модификации. Фиг.12 иллюстрирует репрезентативный результат изображений и 3D-реконструкции, полученных с помощью вращающегося дискового конфокального микроскопа, с 40-кратным воздушным объективом (числовая апертура 0,75).
   1. Используйте программное обеспечение конструктора для автоматического процесса получения изображения со следующими настройками: время экспозиции = 50 мс, с z моторизованной ступенью для получения z-стека (Z-шаг 1 мкм, для общей высоты 70 мкм).
   2. Выполняйте 3D-реконструкцию с помощью программного обеспечения для анализа изображений.

9. Высвобождение и сбор органоидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Текстурированный адгезивный слой чашки для клеточной культуры может быть отделен от покровного листа для высвобождения живых сфероидов / органоидов (до фиксации), содержащихся внутри пирамидных полостей, для анализа клеток с помощью других процедур, таких как секвенирование РНК, -омические подходы, эксперименты in vitro и трансплантация in vivo .

1. Когда образец все еще находится в чашке Петри и в вытяжке биобезопасности, используйте лезвие, такое как скальпель, чтобы срезать угол текстурированного слоя клея.
2. Пинцетом зажмите текстурированный клейкий слой на срезанном крае и аккуратно отклейте его от стеклянной крышки, но держите его погруженным в среду (некоторые органоиды могут оставаться с клеевым слоем, рисунок 13).
3. Промыть 3 раза питательной средой и собрать органоиды путем пипетки.

Результаты

На рисунке 8F показан типичный аспект покрова клеточной культуры после успешного изготовления. УФ-отверждаемый клейкий слой выглядит плоским и хорошо прилипает к крышке. Перенос клеевого слоя на крышке может завершиться, если слой на крышке затвердел или если удаление ?...

Обсуждение

В данной работе описана процедура изготовления чашки для микроскважинной культуры, которая позволяет культивировать и дифференцировать органоиды высокой плотности. Благодаря геометрии и расположению микрополот, тысячи сфероидов могут быть культивированы и окрашены в одну пластину ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol	Thermofisher scientific	AA19397K7
Acetone	Thermofisher scientific	AA19392K7
BC43 Benchtop Confocal Microscope	Andor Technology		spinning disk confocal microscope
bovine serum albumin	Thermofisher scientific	37525
Buffered oxide etching solution	Merck	901621-1L
CEE Spin Coater	Brewer Science	200X
DAPI	Thermofisher scientific	62248
Developer AZ400K	Merck	18441223164
DI Milliq water	Millipore
Fetal Bovine Serum (FBS)	Invitrogen	10082147
Glass coverslips	Marienfled	117650	1.5H, round 25 mm diameter
Hepes	Invitrogen	15630080
Imaris software	BitPlane		image analysis software
Inverted Transmission optical microscope	Nikon	TSF100-F
Labsonic M	Sartorius Stedium Biotech		Ultrasonic homogenizer
Lipidure	NOF America	CM5206	bio-mimetic copolymer
NOA73	Norland Products	17-345	UV curable adhesive
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15070063
Phalloidin	Thermofisher scientific	A12379	Alexa Fluor
Phosphate Buffer Solution	Thermofisher scientific	10010023
Photo Resist AZ5214E	Merck	14744719710
Pico Plasma tool	Diener Electronic GmbH + Co. KG	Pico Plasma	For O2 plasma treatment
RapiClear 1.52	Sunjin lab	RC 152001	water-soluble clearing agent
RCT Hot Plate/Stirrer	IKA (MY)
Reactive Ion Etching tool	Samco Inc. (JPN)	RIE-10NR
RPMI 1640	Invitrogen	11875093	culture medium for HCT116 cells
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	4019862	Polydimethylsiloxane or in short, PDMS
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma Aldrich	448931-10G
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284	surfactant
Trypsin EDTA	Thermofisher scientific	15400054
Ultrasonic Cleaner	Bransonic	CPX2800
UV-KUB 2	KLOE		UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density
UV mask aligner	SUSS Microtec Semiconductor (DE)	MJB4