הזרקה תוך לבבית של תאי סרטן ערמונית אנושיים ליצירת גרורות עצם מודל עכבר Xenograft

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להזרקה תוך לבבית של תאי סרטן ערמונית אנושיים כדי ליצור מודל עכבר עם נגעים גרורות בעצמות.

Abstract

כממאירות הגברית הנפוצה ביותר, סרטן הערמונית (PC) מדורג במקום השני בתמותה, בעיקר בשל שיעור גרורות בעצמות של 65%-75%. לכן, חיוני להבין את התהליך ואת המנגנונים הקשורים של גרורות עצם סרטן הערמונית לפיתוח טיפולים חדשים. לשם כך, מודל בעלי חיים של גרורות עצם הוא כלי חיוני. כאן, אנו מדווחים על הליכים מפורטים ליצירת מודל עכבר גרורות עצם באמצעות הזרקה תוך לבבית של תאי סרטן הערמונית. מערכת הדמיה ביולומינסנטית יכולה לקבוע אם תאי סרטן הערמונית הוזרקו במדויק ללב ולנטר גרורות של תאים סרטניים, שכן יש לה יתרונות גדולים במעקב אחר התפתחות נגעים גרורתיים. מודל זה משכפל את ההתפתחות הטבעית של תאי סרטן מופצים ליצירת מיקרו-גרורות בעצם ומחקה את התהליך הפתולוגי של גרורות בעצמות סרטן הערמונית. הוא מספק כלי יעיל לחקירה נוספת של המנגנונים המולקולריים ואת ההשפעות הטיפוליות in vivo של מחלה זו.

Introduction

סרטן הערמונית הוא הסרטן השכיח ביותר בקרב גברים ב -112 מדינות ומדורג במקום השני בתמותה במדינות מדד התפתחות אנושי גבוה יותר ^1,2. רוב מקרי המוות בחולי סרטן הערמונית נגרמים מגרורות, וכ-65%-75% מהמקרים יפתחו גרורות בעצמות ^3,4. לכן, יש צורך דחוף במניעה וטיפול בגרורות עצם של סרטן הערמונית כדי לשפר את התוצאה הקלינית של חולי סרטן הערמונית. המודל החייתי של גרורות עצם הוא כלי חיוני לחקר התהליך הרב-שלבי והמנגנונים המולקולריים המעורבים בכל שלב של גרורות עצם של סרטן הערמונית, ובכך לזהות מטרות טיפוליות ולפתח טיפולים חדשניים⁵.

השיטות הנפוצות ביותר ליצירת מודלים ניסיוניים של בעלי חיים של גרורות בעצמות סרטן הערמונית כוללות את האורתוטופיה, תוך דיאפיזה (כגון תוך טיביאלית) והזרקה תוך לבבית של תאי סרטן הערמונית. מודל גרורות העצם עם הזרקה אורתוטופית נוצר על ידי הזרקה ישירה של תאי סרטן הערמונית לתוך הערמונית של עכבר ^6,7. למודל ניסיוני זה של בעלי חיים יש מאפיינים קליניים דומים מאוד לגרורות בעצמות סרטן הערמונית. עם זאת, הגרורות מתרחשות בעיקר בבלוטת הלימפה בבית השחי ובריאה ולא בעצם ^8,9. מודל ההזרקה התוך טיביאלית לסרטן הערמונית מזריק ישירות תאי סרטן ערמונית לעצם השוקה עם שיעור היווצרות גידול גבוה בעצם (טיביה)^10,11; עם זאת, קליפת העצם וחלל מח העצם ניזוקים בקלות. בנוסף, שיטת ההזרקה הטיביאלית אינה יכולה לעורר את התהליך הפתולוגי של גרורות עצם סרטן הערמונית שבו התאים הסרטניים מאכלסים את העצם דרך מחזור הדם. כדי לחקור את מחזור הדם, אקסטרווסציה וסקולרית וגרורות מרוחקות עם שיעור גרורות עצם גבוה יותר של תאים סרטניים, פותחה טכניקת הזרקה תוך לבבית על ידי הזרקה ישירה של תאי סרטן הערמונית לחדר השמאלי של העכבר 8,12,13. זה הופך אותו למודל בעל ערך בבעלי חיים לחקר גרורות בעצמות⁸. בשיטת ההזרקה התוך-לבבית שיעור גרורות בעצמות עומד על כ-75%^9,14, גבוה בהרבה משיטת ההזרקה האורתוטופית. לכן, הזרקה תוך לבבית היא שיטה אידיאלית ליצור מודל בעלי חיים עם גרורות עצם סרטן הערמונית.

עבודה זו נועדה לתאר את תהליך הקמת מודל העכבר של גרורות עצם סרטן הערמונית, המאפשר לקוראים לדמיין את הקמת המודל. העבודה הנוכחית מספקת תהליכים מפורטים, אמצעי זהירות ותמונות להמחשה ליצירת מודל xenograft גרורות עצם באמצעות הזרקה תוך לבבית של תאי סרטן ערמונית אנושיים בעכברים אתימיים. שיטה זו מספקת כלי יעיל לחקירה נוספת של המנגנונים המולקולריים וההשפעות הטיפוליות in vivo של גרורות בעצמות סרטן הערמונית.

Protocol

עכברי BALB/c אתימיים זכרים בני שישה עד שמונה שבועות (n = 10) שוכנו בכלובי עכברים מאווררים בנפרד (5 עכברים / כלוב) בחדר בעלי חיים ספציפי ללא פתוגן (SPF) בתנאים של מחזור אור / חושך של 12 שעות, עם גישה חופשית להזנת SPF ומים סטריליים. עכברים הוזנו באופן אדפטיבי במשך שבוע לפני הניסויים. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לרווחת בעלי חיים של אוניברסיטת שנגחאי לרפואה סינית מסורתית.

1. הכנת תאים

1. ביום הזרקת תאי סרטן הערמונית, יש לשטוף 80%-90% לוציפראז קונפלואנטי המסומן בתאי PC-3 (PC-3-luciferase) בתרבית תאים בקוטר 10 ס"מ עם PBS סטרילי טרום קר (pH 7.4) פעמיים. טריפסין במשך 3 דקות עם 1.5 מ"ל של 0.25% טריפסין, ולאסוף את התאים לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל לאחר הרוות את טריפסין עם 6 מ"ל של מדיום F-12 המכיל 10% סרום.
   הערה: קו התאים PC-3-luciferase נגזר מקו התאים PC-3 לאחר שהודבק בווקטור pLV-luciferase¹⁵.
2. השתמש במונה תאים אוטומטי וחשב את ריכוז התא על-ידי העברת 20 μL מתרחיף התא ללוח ספירת התאים (ראה טבלת חומרים).
3. צנטריפוגה את התאים ב 800 x גרם בטמפרטורת החדר (RT) במשך 5 דקות.
4. השתמש פיפטה כדי להשליך את supernatant ולהשהות מחדש את גלולת התא בתווך F-12 (ראה טבלת חומרים) לצפיפות תא סופית של 1 x 10⁷ תאים/מ"ל.
5. שמור את התאים על קרח בכל עת עד ההזרקה.
6. הביאו את התאים לחדר הניתוח וסיימו את הזרקת התאים תוך שעתיים.
   הערה: הכינו מתלי תאים נוספים (בדרך כלל נפחים כפולים לפי הצורך) כדי להבטיח מנות הזרקה מדויקות (לדוגמה, כדי למנוע את החללים המתים בתוך המזרקים).

2. ניתוח להזרקה תוך לבבית של תאי סרטן הערמונית האנושית

הערה: המנגנון הכירורגי המשמש להזרקה תוך לבבית הוא מזרק 1 מ"ל (איור 1). לספק תמיכה תרמית לאורך כל ההליך עד להחלמה של בעל החיים מההרדמה.

1. שמור את העכבר בחדר בעלי החיים SPF. בצע את כל ההליכים עם מנגנונים מעוקרים בתוך ארון אספטי.
2. מרדימים את העכבר באמצעות איזופלורן 2% עם 98% חמצן תחת קצב זרימת חמצן של 2 ליטר/דקה.
   הערה: יש למרוח כמות קטנה של משחת עיניים על עיני העכבר כדי למנוע יובש במהלך ההרדמה. בצע את כל הניתוח באזור מאוורר היטב. ודא שהעכבר מורדם עמוקות על ידי צביטת אצבעות רגלי העכבר לפני הזרקת התא. אם התגובות (למשל, אידיוט או עווית) נשארות, המתן זמן נוסף עד שההרדמה תיכנס לתוקף.
3. הניחו את העכבר בתנוחת שכיבה ושתקו את שתי הגפיים העליונות בניצב הרחק מקו האמצע (איור 2A).
4. לשתק את העכבר מהבטן ומטה עם סרט הדבקה כירורגי. הימנעו מללחוץ חזק ולהזיז את האיברים הפנימיים (איור 2B).
   הערה: שמירה על האנטומיה הטופוגרפית (כלומר, קיבוע עם סרט הדבקה) היא חיונית מכיוון שההזרקה תוך לבבית היא עיוורת (כלומר, אתר ההזרקה המדויק בלב אינו נראה לעין בלתי).
5. לחטא את עור בית החזה עם מקלון אתנול 70%.
6. זהה את תהליך הקסיפואיד של העכבר בשקע בקצה התחתון של אמצע עצם החזה על ידי מישוש באמצע דופן החזה הקדמית. זהה את החריץ הצווארי של העכבר בשקע המרכזי בגבול העליון של המנובריום על ידי מישוש מאמצע דופן החזה הקדמית.
7. תייגו את הנקודה הנחותה ביותר בתהליך הקסיפואיד ואת החריץ הג'וגולרי בעזרת עט סמן (איור 2A). סמנו סימן שלישי באמצע שני ציוני הדרך הללו ומעט ימינה (משמאל החיה) קצת מעל הלב בחלל הבין-קוסטלי השלישי.
   הערה: מקום ההזרקה נמצא 1-2 מ"מ משמאל לקו האמצע, ונקודת ההזרקה נמצאת בין הצלע השלישית והרביעית של העכבר (איור 2A).
8. טען 200 μL של תרחיף התא לתוך מזרק 1 מ"ל.
   הערה: שמרו על בועת אוויר במזרק, כפי שמוצג באיור 2C, כדי לוודא שהדם פועם. יש לערבב היטב את מתלה התא לפני הטעינה.
9. הכניסו אנכית מחט 26G דרך אתר ההזרקה (איור 2D).
10. שמור על היד המחזיקה את המזרק יציב על השולחן, או השתמש ביד השנייה כדי להחזיק אותו יציב. יש לוודא שהציר הארוך של המזרק ניצב לאתר ההזרקה, ולהכניס את המזרק כ-2 מ"מ תת עורית.
11. פעימת דם אדומה בהירה נראית במרכז המחט ו / או תרחיף התא כאשר קצה המחט מוכנס כראוי לחדר השמאלי. אם פעימת הדם אינה נראית, קצה המחט אינו בלב. יש לשלוף ולהחליף את המחט (במקרה שקרישת הדם בתוך המחט עוצרת את פעימות הדם). הכנס שוב את המחט.
12. להזריק את התאים. הזריקו את מתלה התא (100 מיקרוליטר) לאט מאוד מעל 40-60 שניות ושמרו על היד האוחזת במזרק יציבה כל הזמן.
    הערה: יש להשגיח מקרוב על תרחיף התאים במזרק, ואין להזריק את בועת האוויר בתוך המזרק לתוך הלב.
13. הפעל לחץ על אתר ההזרקה עם צמר גפן יבש במשך 15 שניות כדי להבטיח המוסטאזיס כאשר המחט נשלפת.
14. החזירו את העכבר לכלוב הנקי ועקבו אחר בעל החיים עד שיתאושש לחלוטין מההרדמה.
15. דמיינו את העכבר עם מערכת ביולומינסנציה in vivo תוך 24 שעות לאחר ההזרקה כדי להבטיח שהתאים הסרטניים נכנסו למחזור הדם.
    הערה: תאי סרטן המוזרקים כראוי נכנסים למחזור הדם העורקי דרך חדר הלב השמאלי, אשר נראה על-ידי איתות ביולומינסנציה הנראה בכל הגוף (לדוגמה, ראו איור 3A).
16. בצע הדמיה ביולומינסנציה in vivo .
    1. הפעל את המכשיר ואת המחשב. פתח את התוכנה כאשר מחוון ההפעלה במכשיר ובמחשב מתבהר, ולאחר מכן פתח את החלון Image Acquisition .
    2. זהה את מערכת ההדמיה in vivo המחוברת למחשב בחלונית ההתקן. מקם את העכבר לצילום בתא ההדמיה במצב שכיבה. לאחר מכן סגור את דלת תא ההדמיה.
    3. הגדר את הפרמטרים בחלונית ההגדרה המסופקת בחלון רכישת תמונה .
       1. הגדר את הפרמטרים עם Lens > Zoom > 1x, Lens > Focus > 108 ו - Lens > Iris > F 2.8 כדי להבהיר את התמונות.
       2. הגדר את ערוץ הצילום ב- Filter&Light: Filter&Light > Filter > Luminescence, Filter&Light > Light > OFF ו - Filter&Light > עוצמת אור > באמצע.
       3. הגדר את סוג התמונה שיש לצלם: סוג > הדמיה > מסגרת יחידה, זמן חשיפה > הדמיה > 500 אלפיות השנייה, מצב הדמיה > HDR > מצב רווח נמוך. לחץ על כפתור לרכוש כדי לרכוש את התמונה.
17. דמיינו את צמיחת הסרטן הגרורתי עם ביולומינסנציה in vivo .
    הערה: בכל נקודת זמן של ההדמיה, תוך צפקית להזריק 200 μL של מצע luciferin לתוך עכבר 20 גרם (150 מ"ג / ק"ג) ולחכות 15 דקות לפני ההרדמה (2% isoflurane מעורבב עם 98% חמצן בתא אינדוקציה). הנח את העכבר על פלטפורמת מערכת ההדמיה של ביולומינסנציה. יש לשמור על הרדמה באמצעות מסכת אף עם 2% איזופלורן.

3. חקירה פתולוגית

1. ארבעה שבועות לאחר הזרקת התא, להקריב את העכבר על ידי שאיפת CO₂ ולאחר מכן נקע צוואר הרחם.
2. לשתק את העכבר במצב שכיבה. ביצוע חתך אנכי (כ-6 ס"מ) מהבטן לבית החזה בעזרת מספריים כירורגיים כדי לחשוף ולבדוק באופן גס את כל איברי הבטן ובית החזה לאיתור נגעים סרטניים ו/או שינויים פתולוגיים.
   הערה: במחקר הזרקת תאי סרטן תוך לבביים, נגעים סרטניים במדיאסטינום הסמוך ללב מצביעים על תאים סרטניים שהוזרקו שלא כהלכה (תאים שלא הוזרקו לחדר הלב השמאלי); לכן, עכברים אלה אינם נכללים באיסוף הנתונים הסופי.
3. הבלו את הגידולים גרורתיים עם מספריים. למדוד את הקטרים הארוכים (a) והקצרים (b) של הגידול באמצעות קליפרים כדי לחשב את נפח הגידול (V) באמצעות הנוסחה V = 1/2 × a × b², ולשקול את הגידול באמצעות סולם אלקטרוני.
4. תקן את רקמות הגידול בתמיסת פורמלין 10% ואחריה הטבעה בפרפין. לחלופין, הקפיאו את הגידולים בחנקן נוזלי.
5. הבלו על העצמות (גפיים אחוריות, חוליות ו/או צלעות) עם נגעים גרורתיים. תקן את הדגימה של כל עכבר בצינור 50 מ"ל המכיל 20 מ"ל של תמיסת פורמלין 10% למשך 24 שעות לאחר הסרת העור והשרירים, ולאחר מכן הסתיידות למשך 14 יום בתמיסת EDTA 10% עם שינוי חיץ תכוף (כל 3 ימים).
6. הטמע את הדגימה בפרפין וחתך את הדגימות לבדיקה היסטולוגית שגרתית¹⁶.

תוצאות

להדמיית ביולומינסנציה יתרונות עצומים במעקב אחר התפתחות הנגע הגרורתי במודל הזרקה תוך לבבי. זמן קצר לאחר הזרקת התאים הסרטניים (תוך 24 שעות), נעשה שימוש בדימות ביולומינסנציה כדי לדמיין את התאים הסרטניים נכנסים למחזור הדם הכללי (איור 3A). איתות ביולומינסנציה ברור בכל הגוף ייראה ...

Discussion

הזרקה תוך לבבית של תאי סרטן ערמונית אנושיים ליצירת גרורות בעצמות היא מודל עכבר אידיאלי לחקר הפונקציות והמנגנונים של גרורות עצם של סרטן הערמונית והערכת היעילות הטיפולית. מחקרים הראו כי נזק לעצם מתרחש ככל הנראה בשוקה הפרוקסימלית ובעצם הירך הדיסטלית¹⁷, אשר עשויה לנבוע מכלי הדם ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringes and needles	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd	20200411	The cells were injected into the ventricles of mice
Anesthesia machine	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	R500IP	Equipment for anesthetizing mice
Automatic cell counter	Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd	IC1000	For counting cells
BALB/c athymic mice	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.	Male	6-8 week old, male mice
Bioluminescence imaging system	Shanghai Baitai Technology Co., Ltd	Vieworks	For tracking the tumor growth and pulmonary metastasis if the injected cells are labeled by luciferase
Centrifuge tube (15 mL, 50 mL)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	430790, Corning
EDTA solution	Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd	G1105	For decalcification of bone tissure
F-12 medium	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	21700075, GIBCO	Cell culture medium
Formalin solution	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	BL539A	For fixing the specimen of each mouse
Isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	VETEASY	For anesthesia
Lipofectamine 2000	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	11668027, Thermo fisher	Plasmid transfection reagent
PC-3 cell line	Cell Bank of Chinese Academy of Sciences	TCHu 158	Prostate cancer cell line
Phosphate-buffered saline	Beyotime Biotechnology	ST447	Wash the human osteosarcoma cells
Trypsin (0.25%)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	25200056, Gibco	For detaching the cells
Vector (pLV-luciferase)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	VL3613	Plasmid for transfection
X-ray imaging system	Brook (Beijing) Technology Co., Ltd	FX PRO	For obtaining x-ray images to detect tumor growth
μCT80	Shenzhen Fraun Technology Service Co., Ltd	Scanco Medical AG,Switzerland	For detection of bone destruction. The mico-CT is equipped with 3DCalc, cone reconstruction,  and μCT Ray V3.4A model visualization software.