Injeção intra-cardíaca de células humanas de câncer de próstata para criar um modelo de xenoenxerto de metástase óssea em camundongos

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para a injeção intracardíaca de células humanas de câncer de próstata para gerar um modelo de camundongo com lesões de metástase óssea.

Resumo

Como malignidade masculina mais comum, o câncer de próstata (PC) ocupa o segundo lugar em mortalidade, principalmente devido a uma taxa de metástases ósseas de 65%-75%. Portanto, é essencial compreender o processo e os mecanismos relacionados da metástase óssea do câncer de próstata para o desenvolvimento de novas terapêuticas. Para isso, um modelo animal de metástase óssea é uma ferramenta essencial. Aqui, relatamos procedimentos detalhados para gerar um modelo de metástase óssea em camundongos via injeção intracardíaca de células de câncer de próstata. Um sistema de imagem por bioluminescência pode determinar se as células do câncer de próstata foram injetadas com precisão no coração e monitorar a metástase das células cancerosas, uma vez que tem grandes vantagens no monitoramento do desenvolvimento de lesões metastáticas. Este modelo replica o desenvolvimento natural de células cancerosas disseminadas para formar micrometástases no osso e imita o processo patológico da metástase óssea do câncer de próstata. Ele fornece uma ferramenta eficaz para uma maior exploração dos mecanismos moleculares e dos efeitos terapêuticos in vivo desta doença.

Introdução

O câncer de próstata é o câncer mais frequente em homens em 112 países e ocupa o segundo lugar em mortalidade em países com maior índice de desenvolvimento humano ^1,2. A maioria das mortes em pacientes com câncer de próstata é causada por metástase, e cerca de 65%-75% dos casos desenvolverão metástase^óssea3,4. Portanto, a prevenção e o tratamento das metástases ósseas do câncer de próstata são urgentemente necessários para melhorar a evolução clínica dos pacientes com câncer de próstata. O modelo animal de metástase óssea é uma ferramenta indispensável para explorar o processo em múltiplos estágios e os mecanismos moleculares envolvidos em cada estágio da metástase óssea do câncer de próstata, identificando alvos terapêuticos e desenvolvendo novas^{terapêuticas5}.

Os métodos mais comuns para gerar modelos animais experimentais de metástase óssea de câncer de próstata incluem a injeção ortotópica, intra-diafise (como intra-tibial) e intra-cardíaca de células de câncer de próstata. O modelo de metástase óssea com injeção ortotópica é gerado pela injeção direta de células do câncer de próstata na próstata de^{camundongos6,7}. Este modelo experimental animal apresenta características clínicas muito semelhantes às metástases ósseas do câncer de próstata. No entanto, as metástases ocorrem principalmente no linfonodo axilar e no pulmão e não no osso ^8,9. O modelo de injeção intra-tibial para câncer de próstata injeta diretamente células do câncer de próstata na tíbia com alta taxa de formação de tumor no osso (tíbia)^10,11; no entanto, o córtex ósseo e a cavidade da medula óssea são facilmente danificados. Além disso, o método de injeção tibial não pode estimular o processo patológico de metástase óssea do câncer de próstata em que as células cancerosas colonizam o osso através da circulação. Para investigar a circulação, o extravasamento vascular e as metástases à distância com maior taxa de metástases ósseas de células cancerosas, uma técnica de injeção intracardíaca foi desenvolvida injetando diretamente células do câncer de próstata no ventrículo esquerdo do camundongo8,12,13. Isso o torna um modelo animal valioso para a pesquisa de metástases^ósseas8. O método de injeção intracardíaca apresenta uma taxa de metástases ósseas de cerca de 75%^9,14, muito superior ao método de injeção ortotópica. Portanto, a injeção intracardíaca é um método ideal para gerar um modelo animal com metástase óssea de câncer de próstata.

Este trabalho tem como objetivo descrever o processo de estabelecimento de um modelo murino de metástases ósseas para câncer de próstata, permitindo ao leitor visualizar o estabelecimento do modelo. O presente trabalho fornece processos detalhados, precauções e imagens ilustrativas para gerar um modelo de xenoenxerto de metástase óssea via injeção intracardíaca de células humanas de câncer de próstata em camundongos atímicos. Este método fornece uma ferramenta eficaz para explorar ainda mais os mecanismos moleculares e os efeitos terapêuticos in vivo da metástase óssea do câncer de próstata.

Protocolo

Camundongos machos BALB/c com seis a oito semanas de idade (n = 10) foram alojados em gaiolas de camundongos ventilados individualmente (5 camundongos/gaiola) em um biotério específico livre de patógenos (FPS) sob condições de ciclo claro/escuro de 12 h, com livre acesso à ração FPS e água estéril. Os camundongos foram alimentados adaptativamente por uma semana antes dos experimentos. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo comitê de bem-estar animal da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai.

1. Preparação celular

1. No dia da injeção de células de câncer de próstata, lavar 80%-90% de células PC-3 marcadas com luciferase confluente (PC-3-luciferase) cultivadas em uma placa de cultura de células de 10 cm com PBS estéril pré-frio (pH 7,4) duas vezes. Tripsinizar por 3 min com 1,5 mL de tripsina a 0,25% e coletar as células em um tubo centrífugo de 15 mL após a supressão da tripsina com 6 mL de meio F-12 contendo 10% de soro.
   NOTA: A linhagem celular PC-3-luciferase é derivada da linhagem PC-3 após ser transfectada com o vetor pLV-luciferase¹⁵.
2. Use um contador automático de células e calcule a concentração celular transferindo 20 μL da suspensão celular para a placa de contagem de células (ver Tabela de Materiais).
3. Centrifugar as células a 800 x g à temperatura ambiente (TR) durante 5 min.
4. Use uma pipeta para descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet de célula em meio F-12 (ver Tabela de Materiais) para uma densidade celular final de 1 x 10⁷ células/mL.
5. Mantenha as células sempre congeladas até a injeção.
6. Levar as células para a sala de cirurgia e terminar a injeção de células dentro de 2 h.
   NOTA: Prepare suspensões de células adicionais (geralmente volumes duplicados conforme necessário) para garantir doses de injeção precisas (por exemplo, para evitar os espaços mortos dentro das seringas).

2. Cirurgia para injeção intra-cardíaca das células humanas do câncer de próstata

OBS: O aparato cirúrgico utilizado para injeção intracardíaca é uma seringa de 1 mL (Figura 1). Fornecer suporte térmico durante todo o procedimento até a recuperação do animal da anestesia.

1. Mantenha o rato na sala de animais SPF. Realizar todos os procedimentos com aparelhos esterilizados dentro de um gabinete asséptico.
2. Anestesiar o camundongo usando isoflurano a 2% com oxigênio a 98% sob fluxo de oxigênio de 2 L/min.
   NOTA: Esfregue uma pequena quantidade de pomada oftálmica nos olhos do rato para evitar o ressecamento durante a anestesia. Realizar toda a cirurgia em uma área bem ventilada. Certifique-se de que o rato está profundamente anestesiado, beliscando os dedos dos pés do rato antes da injeção de células. Se as respostas (por exemplo, um empurrão ou contração) permanecerem, aguarde um tempo adicional para que a anestesia faça efeito.
3. Coloque o camundongo em posição de supona e imobilize ambos os membros superiores perpendicularmente esticados para longe da linha média (Figura 2A).
4. Imobilizar o camundongo do abdome para baixo com fita adesiva cirúrgica. Evitar pressionar com força e deslocar os órgãos internos (Figura 2B).
   NOTA: A manutenção da anatomia topográfica (isto é, a fixação com fita adesiva) é essencial, uma vez que a injeção intracardíaca é cega (ou seja, o local preciso da injeção no coração é invisível a olho nu).
5. Desinfete a pele do tórax com um cotonete de etanol a 70%.
6. Identificar o processo xifoide de camundongo na depressão na extremidade inferior do esterno médio palpando o meio da parede torácica anterior. Identificar a incisura jugular do rato na depressão central na borda superior do manúbrio, palpando-se a partir do meio da parede torácica anterior.
7. Marcar o ponto mais inferior do processo xifoide e a incisura jugular com caneta marcadora (Figura 2A). Faça uma terceira marca no meio desses dois pontos e ligeiramente à direita (esquerda do animal) logo acima do coração no terceiro espaço intercostal.
   NOTA: O local de injeção é 1-2 mm à esquerda da linha média, e o ponto de injeção está entre a terceira e quarta costelas do mouse (Figura 2A).
8. Carregar 200 μL da suspensão celular numa seringa de 1 ml.
   NOTA: Mantenha uma bolha de ar na seringa, como mostrado na Figura 2C, para garantir que o sangue está pulsando. A suspensão celular deve ser cuidadosamente misturada antes do carregamento.
9. Inserir verticalmente uma agulha 26 G através do local da injeção (Figura 2D).
10. Mantenha a mão segurando a seringa estável sobre a mesa, ou use a outra mão para segurá-la estável. Certifique-se de que o eixo longo da seringa é perpendicular ao local de injeção e introduza a seringa cerca de 2 mm por via subcutânea.
11. A pulsação do sangue vermelho-vivo é visível no cubo da agulha e/ou na suspensão celular quando a ponta da agulha é inserida corretamente no ventrículo esquerdo. Se a pulsação do sangue for invisível, a ponta da agulha não está no coração. Retraia e substitua a agulha (caso a coagulação do sangue dentro da agulha pare a pulsação do sangue). Insira a agulha mais uma vez.
12. Injete as células. Injete a suspensão celular (100 μL) muito lentamente ao longo de 40-60 s e mantenha a mão segurando a seringa estável o tempo todo.
    NOTA: Fique atento à suspensão celular na seringa e não injete a bolha de ar dentro da seringa no coração.
13. Aplique pressão no local da injeção com um cotonete seco por 15 s para garantir a hemostasia quando a agulha estiver retraída.
14. Devolva o rato à gaiola limpa e monitorize o animal até que recupere completamente da anestesia.
15. Imagem do rato com um sistema de bioluminescência in vivo dentro de 24 h após a injeção para garantir que as células cancerosas entraram na circulação sistémica.
    NOTA: As células cancerosas injetadas corretamente entram na circulação arterial através do ventrículo cardíaco esquerdo, que é visto pela sinalização de bioluminescência visível em todo o corpo (por exemplo, ver Figura 3A).
16. Realizar imagens de bioluminescência in vivo .
    1. Ligue o instrumento e o computador. Abra o software quando o indicador de energia no instrumento e no computador brilhar e, em seguida, abra a janela Aquisição de imagem .
    2. Identifique o sistema de imagem in vivo conectado ao computador no painel do dispositivo. Coloque o mouse a ser fotografado na câmara de imagem em posição supina. Em seguida, feche a porta da câmara de imagem.
    3. Defina os parâmetros no painel Configuração fornecido na janela Aquisição de Imagem .
       1. Defina os parâmetros com Lens > Zoom > 1x, Lens > Focus > 108 e Lens > Iris > F 2.8 para tornar as imagens claras.
       2. Defina o canal de disparo em Filter&Light: Filter&Light > Filter > Luminescence, Filter&Light > Light > OFF e Filter&Light > Light Intensity > Middle.
       3. Defina o tipo de imagem a ser tirada: Imaging > Type > Single-Frame, Imaging > Exposure Time > 500 ms, Imaging > HDR Mode > Low GainMode. Clique no botão Adquirir para adquirir a imagem.
17. Visualize o crescimento do câncer metastático com bioluminescência in vivo .
    OBSERVAÇÃO: Em cada momento da visualização, injetar intraperitonealmente 200 μL do substrato de luciferina em um camundongo de 20 g (150 mg/kg) e aguardar 15 minutos antes da anestesia (isoflurano a 2% misturado com oxigênio a 98% em uma câmara de indução). Coloque o mouse na plataforma do sistema de imagem de bioluminescência. Manter a anestesia através de máscara nasal com isoflurano a 2%.

3. Investigação patológica

1. Quatro semanas após a injeção celular, sacrificar o camundongo por inalação de CO₂ e, em seguida, luxação cervical.
2. Imobilizar o rato em decúbito dorsal. Faça uma incisão vertical (cerca de 6 cm) do abdome ao tórax com tesoura cirúrgica para expor e examinar grosseiramente todos os órgãos do abdome e tórax em busca de lesões cancerígenas e/ou alterações patológicas.
   NOTA: Para um estudo de injeção de células cancerosas intracardíacas, lesões cancerígenas no mediastino adjacente ao coração sugerem células cancerosas injetadas incorretamente (células não injetadas no ventrículo cardíaco esquerdo); portanto, esses camundongos não são incluídos na coleta final de dados.
3. Excisar os tumores metastáticos com tesoura. Medir os diâmetros longos (a) e curtos (b) do tumor usando paquímetros para calcular o volume tumoral (V) usando a fórmula V = 1/2 × a × b², e pesar o tumor usando uma balança eletrônica.
4. Fixar os tecidos tumorais em solução de formalina a 10% seguida de inclusão em parafina. Alternativamente, congelar os tumores em nitrogênio líquido.
5. Excisar os ossos (membros posteriores, vértebras e/ou costelas) com lesões metastáticas. Fixar o espécime de cada camundongo em um tubo de 50 mL contendo 20 mL de solução de formalina a 10% por 24 h após a remoção da pele e dos músculos, seguido de descalcificação por 14 dias em solução de EDTA a 10% com troca frequente de tampão (a cada 3 dias).
6. Incluir o espécime em parafina e seccionar as amostras para exame histológico de rotina¹⁶.

Resultados

A imagem por bioluminescência oferece enormes vantagens no monitoramento do desenvolvimento da lesão metastática para um modelo de injeção intracardíaca. Logo após a injeção das células cancerosas (dentro de 24 h), imagens de bioluminescência foram usadas para visualizar as células cancerosas entrando na circulação geral (Figura 3A). A sinalização de bioluminescência óbvia em todo o corpo será vista quando as células cancerosas são injetadas na circulação arterial corr...

Discussão

A injeção intracardíaca de células humanas de câncer de próstata para gerar metástase óssea é um modelo de camundongo ideal para explorar as funções e mecanismos da metástase óssea do câncer de próstata e avaliar a eficácia terapêutica. Estudos têm demonstrado que o dano ósseo provavelmente ocorre na tíbia proximal e no fêmur^distal17, o que pode ser devido à sua alta vascularização e atividade metabólica.

Como a metástase óssea é uma lesão m...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringes and needles	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd	20200411	The cells were injected into the ventricles of mice
Anesthesia machine	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	R500IP	Equipment for anesthetizing mice
Automatic cell counter	Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd	IC1000	For counting cells
BALB/c athymic mice	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.	Male	6-8 week old, male mice
Bioluminescence imaging system	Shanghai Baitai Technology Co., Ltd	Vieworks	For tracking the tumor growth and pulmonary metastasis if the injected cells are labeled by luciferase
Centrifuge tube (15 mL, 50 mL)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	430790, Corning
EDTA solution	Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd	G1105	For decalcification of bone tissure
F-12 medium	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	21700075, GIBCO	Cell culture medium
Formalin solution	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	BL539A	For fixing the specimen of each mouse
Isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	VETEASY	For anesthesia
Lipofectamine 2000	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	11668027, Thermo fisher	Plasmid transfection reagent
PC-3 cell line	Cell Bank of Chinese Academy of Sciences	TCHu 158	Prostate cancer cell line
Phosphate-buffered saline	Beyotime Biotechnology	ST447	Wash the human osteosarcoma cells
Trypsin (0.25%)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	25200056, Gibco	For detaching the cells
Vector (pLV-luciferase)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	VL3613	Plasmid for transfection
X-ray imaging system	Brook (Beijing) Technology Co., Ltd	FX PRO	For obtaining x-ray images to detect tumor growth
μCT80	Shenzhen Fraun Technology Service Co., Ltd	Scanco Medical AG,Switzerland	For detection of bone destruction. The mico-CT is equipped with 3DCalc, cone reconstruction,  and μCT Ray V3.4A model visualization software.