הבהרת חילוף החומרים של 2,4-דיברומופנול בצמחים

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה ויעילה לזיהוי מטבוליטים של 2,4-דיברומופנול בצמחים.

Abstract

גידולים חקלאיים עלולים להיחשף באופן נרחב למזהמים אורגניים, שכן הקרקע מהווה שקע מרכזי למזהמים המושלכים לסביבה. כך נוצרת חשיפה פוטנציאלית של בני אדם באמצעות צריכת מזונות שהצטברו במזהמים. הבהרת הספיגה והמטבוליזם של קסנוביוטיקה בגידולים חיונית להערכת הסיכון לחשיפה תזונתית בבני אדם. עם זאת, עבור ניסויים כאלה, השימוש בצמחים שלמים דורש ניסויים ארוכי טווח ופרוטוקולים מורכבים להכנת דגימות שיכולים להיות מושפעים מגורמים שונים. תרביות יבלות צמחיות בשילוב עם ספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה (HRMS) עשויות לספק פתרון לזיהוי מדויק וחוסך זמן של מטבוליטים של קסנוביוטיקה בצמחים, שכן הן יכולות למנוע הפרעה מהמיקרו-סביבה המיקרוביאלית או הפטרייתית, לקצר את משך הטיפול ולפשט את אפקט המטריצה של צמחים שלמים. 2,4-dibromophenol, מעכב בעירה טיפוסי ומשבש אנדוקריני, נבחר כחומר המודל בשל הופעתו הנפוצה בקרקע ופוטנציאל ספיגתו על ידי צמחים. כאן, יבלת צמחית הופקה מזרעי אספסיס ונחשף למדיום תרבית סטרילי המכיל 2,4-דיברומופנול. התוצאות הראו כי שמונה מטבוליטים של 2,4-dibromophenol זוהו ברקמות יבלת הצמח לאחר 120 שעות של דגירה. זה מצביע על כך 2,4-dibromophenol היה מטבוליזם במהירות ברקמות יבלת הצמח. לפיכך, פלטפורמת תרבית יבלת הצמחים היא שיטה יעילה להערכת ספיגה ומטבוליזם של קסנוביוטיקה בצמחים.

Introduction

מספר גדל והולך של מזהמים אורגניים הושלכו לסביבה עקב פעילות אנתרופוגנית^1,2, והקרקע נחשבת לכיור עיקרי עבור מזהמים אלה ^3,4. המזהמים בקרקע יכולים להיקלט על ידי צמחים ולהיות מועברים פוטנציאלית לאורגניזמים ברמה טרופית גבוהה יותר לאורך שרשראות מזון, על ידי כניסה ישירה לגוף האדם באמצעות צריכת יבולים, וכתוצאה מכך להוביל לחשיפה לא מכוונת ^5,6. צמחים משתמשים במסלולים שונים כדי לעכל קסנוביוטיקה לניקוי רעלים⁷; הבהרת חילוף החומרים של קסנוביוטיקה חשובה, שכן היא שולטת בגורלם האמיתי של מזהמים בצמחים. מכיוון שהמטבוליטים יכולים להיות מופרשים על ידי עלים (לאטמוספירה) או שורשים, קביעת המטבוליטים בשלבים המוקדמים מאוד של החשיפה ולכן מספקת את האפשרות לבדוק מספר רב של מטבוליטים⁸. עם זאת, מחקרים המשתמשים בצמחים שלמים דורשים ניסויים ארוכי טווח ופרוטוקולי הכנת דגימות מורכבים שיכולים להיות מושפעים מגורמים שונים.

תרביות יבלות צמחיות, אם כן, הן חלופה טובה לחקר חילוף החומרים של קסנוביוטיקה בצמח, שכן הן יכולות לקצר מאוד את זמן הטיפול. תרביות אלה שוללות הפרעות מיקרוביאליות ופירוק פוטוכימי, מפשטות את אפקט המטריצה של צמחים שלמים, מתקננות את תנאי הגידול ודורשות פחות מאמץ ניסיוני. תרביות יבלות צמחיות יושמו בהצלחה כגישה חלופית במחקרים מטבוליים של טריקלוזן⁹, נונילפנול¹⁰ וטבוקונזול⁸. מחקרים אלה הראו כי הדפוסים המטבוליים בתרביות יבלות היו דומים לאלה שבצמחים שלמים. מחקר זה מציע שיטה לזיהוי יעיל ומדויק של מטבוליטים של קסנוביוטיקה בצמחים ללא פרוטוקולים מורכבים וגוזלי זמן. כאן, אנו משתמשים בתרביות יבלות צמחיות בשילוב עם ספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה לניתוח מטבוליטים עם אותות בעוצמה נמוכה^11,12.

לשם כך, תרחיפים של יבלת גזר (Daucus carota var. sativus) נחשפו ל-100 מיקרוגרם/ליטר של 2,4-דיברומופנול במשך 120 שעות בשייקר ב-130 סל"ד וב-26 מעלות צלזיוס. 2,4-דיברומופנול נבחר בשל פעילותו האנדוקרינית המשבשת¹³ והופעתו הנרחבת בקרקע¹⁴. המטבוליטים חולצו ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה. הפרוטוקול המוצע כאן יכול לחקור את חילוף החומרים בצמח של סוגים אחרים של תרכובות אורגניות שניתן ליונן.

Protocol

1. הבחנה של יבלת גזר

הערה: Autoclave כל הציוד המשמש כאן ולבצע את כל הפעולות בשולחן עבודה מעוקר UV אולטרה נקי.

1. ורנליזציה של הזרעים על ידי טבילת זרעי גזר אחידים (Daucus carota var. sativus) לתוך מים deionized ב 4 ° C במשך 16 שעות.
2. יש לעקר את הזרעים הוורנליים עם 75% אתנול למשך 20 דקות, ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים במים סטריליים שעברו דה-יוניזציה בתנאים אספטיים.
3. עוד לעקר את הזרעים עם 20% H 2 O₂במשך 20 דקות, ולשטוף אותם עם מים מעוקרים deionized שש פעמים בתנאים אספטיים.
4. להנביט את הזרעים על ידי זריעתם על מדיום טרשת נפוצה נטול הורמונים (pH 5.8, autoclaved ב 121 ° C במשך 20 דקות) המכיל 1% אגר-ג'ל, ולדגור ב 26 ° C עם photoperiod 16 שעות (350 μmol / m²s) במשך 15 ימים.
5. להשיג את explants על ידי חיתוך hypocotyl ו cotyledon של שתילים לחתיכות קטנות (0.5 ס"מ).
6. הפכו את הצמחים לצלחות פטרי (שניים עד ארבעה צמחים בכל מנה) המכילות 15-20 מ"ל של מדיום טרשת נפוצה אספטית בתוספת אוקסימון (2,4-dichlorophenoxyacetic acid; 1 מ"ג/ליטר) ופיטוקינין (6-בנזילאמינופורין; 0.5 מ"ג/ליטר) בתנאים אספטיים.
7. לדגור את explants בחושך ב 26 מעלות צלזיוס במשך 3-4 שבועות כדי לגרום את היבלת.
8. מפרידים את רקמות היבלות (בקוטר של כ-1 ס"מ) שנוצרו מהצמחים הראשוניים באמצעות אזמל סטרילי ומלקחיים.
   הערה: רקמות היבלת החדשות שנוצרו הן בצבע לבן עד צהוב שמנת ומתחברות באופן רופף לצמחים הראשוניים.

2. טיפול 2,4-דיברומופנול

1. להמיס 1 מיקרוגרם של 2,4-dibromophenol ב 10 מ"ל של נוזל אספטי MS בינוני (הריכוז הסופי של 2,4-dibromophenol הוא 100 ppb, pH 5.6-7.0).
2. הוסף 3 גרם של יבלת גזר טרי (שלב 1.8) לתוך צלוחיות זכוכית המכילות את תמיסת 2,4-dibromophenol מוכן (משלב 2.1) בתנאים אספטיים. שקול את זה כמו טיפול 2,4-dibromophenol.
   הערה: צלוחיות הזכוכית היו אוטוקלאביות ואטומות באמצעות סרט פרפין.
3. כלול בקרה בינונית המכילה את תמיסת 2,4-dibromophenol בלבד (שהוכנה בשלב 2.1) כדי להעריך את הפירוק האביוטי של 2,4-dibromophenol.
4. כלול בקרה ריקה המכילה את יבלת הגזר בלבד (ללא תמיסת 2,4-דיברומופנול) כדי לבדוק אם יש זיהום פוטנציאלי.
   1. הכינו את הבקרה הריקה המכילה גזר על ידי הוספת 3 גרם של יבלת גזר טרייה שנאספה רק לתוך 10 מ"ל של מדיום MS סטרילי.
5. לדגור על הטיפול 2,4-dibromophenol ואת הפקדים בינוני וריק ב 130 סל"ד ו 26 ° C בחושך באינקובטור במשך 120 שעות.
6. הסר את צלוחיות הזכוכית מהאינקובטור כדי לאסוף את הדגימות מהטיפול והבקרה של 2,4-dibromophenol לאחר 120 שעות של דגירה.
   הערה: כל הדגימות הוכנו במשולש.

3. הכנת מדגם

1. יש להפריד בזהירות את היבלת ממדיום הטרשת הנפוצה על ידי סינון עם מסנני סיבי זכוכית (0.45 מיקרומטר) לטיפול ב-2,4-דיברומופנול ולקבוצת הביקורת. לאסוף את היבלת לאחר שטיפה עם מים טהורים במיוחד שלוש פעמים.
2. יבש בהקפאה את היבלת שנאספה בחנקן נוזלי, ולאחר מכן הומוגניזציה של היבלת שנאספה (0.2 גרם) עם מטחנת רקמות בעלת תפוקה גבוהה ב -70 הרץ למשך 3 דקות.
3. ספייק את היבלת ההומוגנית על ידי הוספת 50 μL של 25 מ"ג / ליטר פונדקאית 4-n-NP-d₄ עם מיקרומזרק זכוכית ולאחר מכן מערבל במשך 1 דקות.
4. סוניק את הדגימות עם 5 מ"ל של מתנול/מים (1:1, v/v) באולטרה-סוניקטור (150 W, 40 kHz) מלא במי קרח למשך 30 דקות, כדי לחלץ 2,4-dibromophenol ואת המטבוליטים.
5. צנטריפוגו את המתלים בטמפרטורה של 8,000 x גרם ב-4°C למשך 10 דקות, ואספו את הסופרנאטנטים באמצעות פיפטציה.
   1. חזור על תהליכי המיצוי של דגימת היבלת שלוש פעמים ושלב את התמציות.
6. העבר את התמציות דרך מחסניות מיצוי שלב מוצק הידרופילי ליפופילי מאוזן (HLB SPE) עם קצב זרימה של 1 מ"ל/דקה.
   הערה: מחסניות HLB SPE טופלו מראש ברצף עם 6 מ"ל מתנול ו-6 מ"ל מים כדי להסיר הפרעות.
7. להצדיע את analytes על ידי העברת 6 מ"ל של מתנול דרך מחסניות HLB SPE. לאחר מכן, רכז את eluents המתקבל ל 1 מ"ל תחת זרם עדין של גז חנקן לניתוח אינסטרומנטלי.
8. הזריקו 10 μL של אלואנטים כתוצאה מכך לתוך UPLC-Q-TOF-MS עבור 2,4-dibromophenol וניתוח מטבוליטים שלהם¹⁵.
   1. סנן את כל הדגימות עם קרום ניילון 0.22 מיקרומטר לפני ניתוח אינסטרומנטלי.

4. ניתוח אינסטרומנטלי

הערה: 2,4-dibromophenol וניתוחי המטבוליטים שלהם בוצעו על כרומטוגרף נוזלי אולטרה-ביצועי (UPLC) בשילוב עם ספקטרומטר מסות micrOTOF-QII המצויד ביינון אלקטרוספריי (ESI), הפועל במצב יונים חיוביים ושליליים.

1. פתח את דלת מחמם העמודים והתקן את עמוד UPLC על ידי חיבור כניסת העמוד לשסתום ההזרקה ויציאת העמוד לכניסת ספקטרומטר המסות.
   הערה: עמוד C18 (50 מ"מ x 2.1 מ"מ; גודל חלקיקים 1.7 מיקרומטר) שימש להפרדת אנליטים ב- 40 ° C.
2. חבר את פאזה A ניידת (מים טהורים במיוחד) ופאזה B ניידת (מתנול ברמת כרומטוגרפיה) למכשיר על ידי הכנסת קצה צינורות הממס A ו- B לבקבוקי הממס המתאימים, בהתאמה.
   1. סנן את כל השלבים הניידים (500 מ"ל עבור כל אחד) דרך מסנן 0.22 מיקרומטר, ובצע סוניזציה במשך יותר מ- 30 דקות.
3. בחלון התוכנה, לחץ על Instrument | שיטת כניסה לעריכת התנאים עבור הכרומטוגרמה הנוזלית.
   1. הגדר את תנאי השיפוע של שלב B הנייד באופן הבא: קצב זרימה של 1.0 מ"ל/דקה; 0-0.5 דקות, 5%; 0.5-3.5 דקות, 5% עד 50%; 3.5-6.5 דקות, 50% עד 100%; 6.5-7 דקות, 100%; 7-10 דקות, 100% עד 5%.
   2. הגדר את קצב ההזרקה של הדגימות לתוך UPLC-Q-TOF-MS כ- 0.2 מ"ל/דקה.
      הערה: הזרקת הדגימה מתוכנתת באמצעות דוגם אוטומטי לחלוטין.
4. בחלון התוכנה, בחר MS Method ולאחר מכן הגדר את הפרמטרים של Q-TOF-MS: קצב זרימה של גז ייבוש (N₂) של 8 ליטר לדקה, טמפרטורה של 300-350 מעלות צלזיוס; מתח נימי של 4,500 וולט; אנרגיית התנגשות של 5-45 וולט; וטווח סריקה מלא של 40-800 Da.
5. מקם את בקבוקוני הדגימה במיקומים המתאימים של מגשי הדגימה לפי מספר סידורי, והכנס מחדש את מגשי הדגימה לתא הדגימה.
   הערה: שמור על מגשי הדגימה שטוחים וודא שדלת תא הדגימה סגורה.
6. בחלון התוכנה, בחר קובץ | חדש כדי ליצור מסד נתונים. תן שם למסד הנתונים.
7. טען את התוכנית לדוגמה שנוצרה לעיל על-ידי בחירת קובץ MS | קובץ כניסה | הזרקת נפח.
8. שמור את מסד הנתונים בתיקיה לדוגמה של הפרויקט על-ידי לחיצה על קובץ | שמור.
9. בחר הפעל | התחל בחלון הראשי של התוכנה ולאחר מכן בחר רכוש נתונים לדוגמה ולחץ על אישור בחלון של הפעלת הרשימה לדוגמה התחל כדי לאסוף נתונים.
   הערה: ניתן להציג את הכרומטוגרמה בזמן אמת על-ידי לחיצה על כרומטוגרמה | עדכון בזמן אמת במהלך תהליך רכישת הנתונים.
10. עבד את הנתונים בתוכנה על ידי בחירת שורת נתוני היעד ולחיצה על חלון הכרומטוגרמה כדי להציג את כרומטוגרמה הסריקה של MS.
11. בחלון הכרומטוגרמה , לחץ על תצוגה | טיק | ScanWaveDS | הוספת מעקב | אישור לגרום לבת לסרוק ספקטרום מסה.
12. זהה את המטבוליטים על ידי השוואת הכרומטוגרמות של הטיפול 2,4-dibromophenol ואת הבקרות.
13. להבהיר את המועמדים למטבוליט לפי זמן השמירה, המסה ודפוסי הפיצול^16,17.
    הערה: השגיאה של דיוק המסה בין ערכי m/z ניסיוניים של יוני האב של המועמדים למטבוליט לבין m/z התיאורטי המתאים להם צריכה להיות קטנה מ- 10 ppm.

תוצאות

שלבי הפרוטוקול מתוארים באיור 1. בעקבות הפרוטוקול, השווינו את הכרומטוגרמה של תמצית יבלת הגזר מהטיפול ב-2,4-דיברומופנול לקבוצת הביקורת, ומצאנו שמונה פסגות ברורות שנמצאות בטיפול ב-2,4-דיברומופנול אך נעדרות בקבוצת הביקורת (איור 2). זה מצביע על כך שבסך הכל שמונה מטב...

Discussion

פרוטוקול זה פותח כדי לזהות ביעילות את הביוטרנספורמציה של קסנוביוטיקה בצמחים. השלב הקריטי של פרוטוקול זה הוא התרבות של יבלת הצמח. החלק הקשה ביותר הוא התמיינות ותחזוקה של יבלת הצמח, מכיוון שהיבלת הצמחית נגועה בקלות ומתפתחת לרקמות הצמח. לכן, חשוב לוודא כי כל הציוד המשמש הוא autoclaved, וכל הפעולות...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-dichlorophenoxyacetic acid	WAKO	1 mg/L
20% H2O2	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10011218-500ML
4-n-NP, >99%	Dr. Ehrenstorfer GmbH
4-n-NP-d4	Pointe-Claire
6-benzylaminopurine	WAKO	0.5 mg/L
75% ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	1269101-500ML
7890A-5975 gas chromatography	Agilent
ACQULTY ultra-performance liquid chromatography	Waters
Amber glass vials	Waters
Artificial climate incubator	Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD	RDN-1000A-4
Autoclaves	STIK	MJ-Series
C18 column	ACQUITY UPLC BEH
Centrifuge	Thermo Fisher
DB-5MS capillary column	Agilent
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	40071190-4L
Freeze dryer	SCIENTZ
High-throughput tissue grinder	SCIENTZ
Methanol	Sigma-Aldrich
MicrOTOF-QII mass spectrometer	Bruker Daltonics
Milli-Q system	Millipore	MS1922801-4L
Murashige & Skoog medium	HOPEBIO	HB8469-7
N-hexane	Sigma-Aldrich	H109658-4L
Nitrogen blowing instrument	AOSHENG	MD200-2
NP isomers, >99%	Dr. Ehrenstorfer GmbH
Oasis HLB cartridges	Waters	60 mg/3 mL
Research plus	Eppendorf		100-1000 µL
Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus)	Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Shaking Incubators	Shanghai bluepard instruments Co.,ltd.	THZ-98AB
Solid phase extractor	AUTO SCIENCE
Ultrasound machine	ZKI	UC-6
UV-sterilized ultra-clean workbench	AIRTECH