JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Mevcut protokol, bitkilerde 2,4-dibromofenol metabolitlerinin tanımlanması için basit ve etkili bir yöntemi açıklamaktadır.

Özet

Toprak, çevreye atılan kirleticiler için önemli bir yutak olduğundan, mahsuller organik kirleticilere yoğun bir şekilde maruz kalabilir. Bu, kirletici birikmiş gıdaların tüketimi yoluyla potansiyel insan maruziyeti yaratır. Bitkilerde ksenobiyotiklerin alımını ve metabolizmasını aydınlatmak, insanlarda diyete maruz kalma riskinin değerlendirilmesi için gereklidir. Bununla birlikte, bu tür deneyler için, bozulmamış bitkilerin kullanımı, çeşitli faktörlerden etkilenebilecek uzun vadeli deneyler ve karmaşık numune hazırlama protokolleri gerektirir. Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi (HRMS) ile birleştirilmiş bitki kallus kültürleri, mikrobiyal veya fungal mikro ortamdan kaynaklanan parazitleri önleyebildiğinden, tedavi süresini kısaltabildiğinden ve bozulmamış bitkilerin matris etkisini basitleştirebildiğinden, bitkilerde ksenobiyotiklerin metabolitlerinin doğru ve zaman kazandıran tanımlanması için bir çözüm sağlayabilir. Tipik bir alev geciktirici ve endokrin bozucu olan 2,4-dibromofenol, toprakta yaygın olarak bulunması ve bitkiler tarafından alım potansiyeli nedeniyle model madde olarak seçilmiştir. Burada, asepsi tohumlarından bitki kallusu üretildi ve steril 2,4-dibromofenol içeren kültür ortamına maruz bırakıldı. Sonuçlar, 120 saatlik inkübasyondan sonra bitki kallus dokularında sekiz 2,4-dibromofenol metabolitinin tanımlandığını gösterdi. Bu, 2,4-dibromofenolün bitki kallus dokularında hızla metabolize olduğunu gösterir. Bu nedenle, bitki kallus kültürü platformu, bitkilerde ksenobiyotiklerin alımını ve metabolizmasını değerlendirmek için etkili bir yöntemdir.

Giriş

Antropojenik faaliyetler 1,2 nedeniyle artan sayıda organik kirletici çevreye atılmıştırve toprak bu kirleticiler için önemli bir yutak olarak kabul edilmektedir 3,4. Topraktaki kirleticiler bitkiler tarafından alınabilir ve mahsul tüketimi yoluyla doğrudan insan vücuduna girerek gıda zincirleri boyunca potansiyel olarak daha yüksek trofik seviyeli organizmalara aktarılabilir ve sonuç olarak istenmeyen maruziyete yol açabilir 5,6. Bitkiler, detoksifikasyon için ksenobiyotikleri metabolize etmek için farklı yollar kullanır7; Ksenobiyotiklerin metabolizmasını aydınlatmak, bitkilerdeki kirleticilerin gerçek kaderini kontrol ettiği için önemlidir. Metabolitler yapraklar (atmosfere) veya kökler tarafından atılabildiğinden, maruziyetin çok erken aşamalarında metabolitlerin belirlenmesi, bu nedenle çok sayıda metaboliti test etme imkanı sağlar8. Bununla birlikte, bozulmamış bitkiler kullanılarak yapılan çalışmalar, çeşitli faktörlerden etkilenebilecek uzun süreli deneyler ve karmaşık numune hazırlama protokolleri gerektirir.

Bu nedenle bitki kallus kültürleri, tedavi süresini büyük ölçüde kısaltabildikleri için plantadaki ksenobiyotiklerin metabolizmasını incelemek için iyi bir alternatiftir. Bu kültürler mikrobiyal girişimi ve fotokimyasal bozunmayı dışlar, bozulmamış bitkilerin matris etkisini basitleştirir, yetiştirme koşullarını standartlaştırır ve daha az deneysel çaba gerektirir. Bitki kallus kültürleri, triklosan9, nonilfenol10 ve tebukonazol8'in metabolik çalışmalarında alternatif bir yaklaşım olarak başarıyla uygulanmıştır. Bu çalışmalar, kallus kültürlerindeki metabolik modellerin bozulmamış bitkilerdekilere benzer olduğunu göstermiştir. Bu çalışma, karmaşık ve zaman alıcı protokoller olmadan bitkilerde ksenobiyotiklerin metabolitlerinin verimli ve doğru bir şekilde tanımlanması için bir yöntem önermektedir. Burada, düşük yoğunluklu sinyallere sahip metabolitlerin analizi için yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi ile birlikte bitki kallus kültürlerinikullanıyoruz 11,12.

Bu amaçla, havuç (Daucus carota var. sativus) kallus süspansiyonları, 130 rpm ve 26 °C'de bir çalkalayıcıda 120 saat boyunca 100 μg/L 2,4-dibromofenole maruz bırakıldı. 2,4-dibromofenol, yıkıcı endokrin aktivitesi13 ve toprakta yaygın olarak görülmesinedeniyle seçilmiştir 14. Metabolitler ekstrakte edildi ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi ile analiz edildi. Burada önerilen protokol, iyonize olabilen diğer organik bileşik türlerinin bitki metabolizmasını araştırabilir.

Protokol

1. Havuç nasırının farklılaşması

NOT: Burada kullanılan tüm ekipmanları otoklavlayın ve tüm işlemleri UV ile sterilize edilmiş ultra temiz bir tezgahta gerçekleştirin.

  1. Tek tip havuç tohumlarını (Daucus carota var. sativus) 4 °C'de 16 saat boyunca deiyonize suya batırarak tohumları vernalize edin.
  2. Vernalize tohumları 20 dakika boyunca %75 etanol ile yüzey sterilize edin ve ardından aseptik koşullar altında steril deiyonize su ile üç kez durulayın.
  3. Tohumları 20 dakika boyunca% 20H2O2ile sterilize edin ve aseptik koşullar altında altı kez sterilize deiyonize su ile yıkayın.
  4. Tohumları% 1 agar-jel içeren hormonsuz MS ortamına (pH 5.8, 121 ° C'de 20 dakika otoklavlanmış) ekerek ve 26 ° C'de 16 saatlik bir fotoperiyot (350 μmol / m2s) ile 15 gün boyunca inkübe ederek aseptik olarak çimlendirin.
  5. Fidelerin hipokotil ve kotiledonunu küçük parçalara (0,5 cm) keserek eksplantları elde edin.
  6. Eksplantları, aseptik koşullar altında oksimon (2,4-diklorofenoksiasetik asit; 1 mg/L) ve fitokinin (6-benzilaminopurin; 0.5 mg/L) ile takviye edilmiş 15-20 mL aseptik MS ortamı içeren Petri kaplarına (tabak başına iki ila dört eksplant) dönüştürün.
  7. Nasırı indüklemek için eksplantları karanlıkta 26 °C'de 3-4 hafta inkübe edin.
  8. Steril bir neşter ve forseps kullanarak ilk eksplantlardan oluşan kallus dokularını (yaklaşık 1 cm çapında) ayırın.
    NOT: Yeni oluşan kallus dokuları beyaz ila kremsi sarı renktedir ve ilk eksplantlara gevşek bir şekilde bağlanır.

2. 2,4-dibromofenol tedavisi

  1. 1 μg 2,4-dibromofenolü 10 mL aseptik sıvı MS ortamında çözün (2,4-dibromofenolün nihai konsantrasyonu 100 ppb, pH 5.6-7.0'dır).
  2. Aseptik koşullar altında hazırlanan 2,4-dibromofenol çözeltisini (adım 2.1'den itibaren) içeren cam şişelere 3 g taze havuç kallus (adım 1.8) ekleyin. Bunu 2,4-dibromofenol tedavisi olarak düşünün.
    NOT: Cam şişeler otoklavlandı ve parafin film kullanılarak kapatıldı.
  3. 2,4-dibromofenolün abiyotik bozunmasını değerlendirmek için yalnızca 2,4-dibromofenol çözeltisini (adım 2.1'de hazırlanan) içeren bir ortam kontrolü ekleyin.
  4. Herhangi bir potansiyel kontaminasyonu kontrol etmek için yalnızca havuç nasırını (2,4-dibromofenol çözeltisi yok) içeren boş bir kontrol ekleyin.
    1. 10 mL steril MS ortamına sadece 3 g taze toplanmış havuç nasır ekleyerek havuç içeren boş kontrolü hazırlayın.
  5. 2,4-dibromofenol tedavisini ve ortam ve boş kontrolleri 130 rpm ve 26 ° C'de karanlıkta 120 saat boyunca bir inkübatörde inkübe edin.
  6. 120 saatlik inkübasyondan sonra 2,4-dibromofenol tedavisinden ve kontrollerden numuneleri toplamak için cam şişeleri inkübatörden çıkarın.
    NOT: Tüm örnekler üç nüsha halinde hazırlanmıştır.

3. Numune hazırlama

  1. 2,4-dibromofenol tedavisi ve kontroller için cam elyaf filtrelerle (0.45 μm) filtrasyon yaparak nasırı MS ortamından dikkatlice ayırın. Üç kez ultra saf suyla yıkadıktan sonra nasırı toplayın.
  2. Toplanan kallusu sıvı nitrojen ile dondurarak kurutun ve ardından toplanan kallusu (0,2 g) yüksek verimli bir doku öğütücü ile 70 Hz'de 3 dakika boyunca homojenize edin.
  3. Bir cam mikroşırınga ile 50 μL 25 mg / L vekil 4-n-NP-d4 ekleyerek ve ardından 1 dakika vorteksleyerek homojenize kallusu artırın.
  4. 2,4-dibromofenol ve metabolitleri çıkarmak için 30 dakika boyunca buzlu su ile doldurulmuş bir ultrasonicator (150 W, 40 kHz) içinde 5 mL metanol / su (1: 1, v / v) ile örnekleri sonikleştirin.
  5. Süspansiyonları 8.000 x g'de 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanları pipetleyerek toplayın.
    1. Kallus örneği için ekstraksiyon işlemlerini üç kez tekrarlayın ve ekstraktları birleştirin.
  6. Ekstraktları 1 mL/dk akış hızına sahip hidrofilik lipofilik dengeli katı faz ekstraksiyonu (HLB SPE) kartuşlarından geçirin.
    NOT: HLB SPE kartuşları, herhangi bir paraziti gidermek için 6 mL metanol ve 6 mL su ile sırayla ön işleme tabi tutulmuştur.
  7. HLB SPE kartuşlarından 6 mL metanol geçirerek analitleri elute edin. Daha sonra, enstrümantal analiz için elde edilen eluentleri hafif bir nitrojen gazı akışı altında 1 mL'ye konsantre edin.
  8. 2,4-dibromofenol ve metabolitlerinin analizi için UPLC-Q-TOF-MS'ye 10 μL ortaya çıkan eluentleri enjekte edin15.
    1. Enstrümantal analizden önce tüm numuneleri 0,22 μm naylon membran ile filtreleyin.

4. Enstrümantal analiz

NOT: 2,4-dibromofenol ve metabolitlerinin analizleri, pozitif ve negatif iyon modunda çalışan bir elektrosprey iyonizasyonu (ESI) ile donatılmış bir mikro-OTOF-QII kütle spektrometresi ile kombinasyon halinde ultra performanslı bir sıvı kromatografı (UPLC) üzerinde gerçekleştirilmiştir.

  1. Kolon ısıtıcı kapısını açın ve kolon girişini enjeksiyon valfine ve kolon çıkışını kütle spektrometresinin girişine bağlayarak UPLC kolonunu takın.
    NOT: 40 °C'de analitlerin ayrılması için bir C18 kolonu (50 mm x 2,1 mm; 1,7 μm partikül boyutu) kullanılmıştır.
  2. Mobil faz A'yı (ultra saf su) ve mobil faz B'yi (kromatografi dereceli metanol), sırasıyla çözücü tüpleri A ve B'nin ucunu ilgili çözücü şişelerine sokarak cihaza bağlayın.
    1. Tüm mobil fazları (her biri için 500 mL) 0.22 μm'lik bir filtreden geçirin ve 30 dakikadan fazla sonikasyon yapın.
  3. Yazılım penceresinde, Enstrüman | Sıvı kromatogramının koşullarını düzenlemek için Giriş Yöntemi.
    1. Mobil faz B'nin gradyan koşullarını aşağıdaki gibi ayarlayın: 1.0 mL/dak'lık bir akış hızı; 0-0.5 dk,% 5; 0.5-3.5 dakika,% 5 ila% 50; 3.5-6.5 dk,% 50 ila% 100; 6.5-7 dakika, %100; 7-10 dakika, %100 ila %5.
    2. Numunelerin UPLC-Q-TOF-MS'ye enjeksiyon hızını 0,2 mL/dk olarak ayarlayın.
      NOT: Numunenin enjeksiyonu, tam otomatik bir örnekleyici kullanılarak programlanır.
  4. Yazılım penceresinde MS Metodu'nu seçin ve ardından Q-TOF-MS parametrelerini ayarlayın: 8 L/dak'lık bir kurutma gazı (N2) akış hızı, 300-350 °C'lik bir sıcaklık; 4.500 V'luk bir kılcal voltaj; 5-45 V'luk bir çarpışma enerjisi; ve 40-800 Da tam tarama aralığı.
  5. Numune şişelerini seri numarasına göre numune tepsilerinin ilgili yerlerine yerleştirin ve numune tepsilerini numune odasına yeniden yerleştirin.
    NOT: Numune tepsilerini düz tutun ve numune odasının kapısının kapalı olduğundan emin olun.
  6. Yazılım penceresinde Dosya | Veritabanı oluşturmak için yeni. Veritabanını adlandırın.
  7. MS Dosyası | Giriş dosyası | Hacim enjekte edin.
  8. Dosya | Kaydet'i tıklayın.
  9. Çalıştır'ı seçin | Yazılım ana penceresinde başlatın ve ardından Örnek Verileri Al'ı seçin ve veri toplamak için örnek listeyi başlat çalıştırma penceresinde Tamam'a tıklayın.
    NOT: Gerçek zamanlı kromatogram, Kromatogram | Veri toplama işlemi sırasında Gerçek Zamanlı Güncelleme.
  10. Hedef veri satırını seçerek ve MS tarama kromatogramını görüntülemek için Kromatogram penceresine tıklayarak yazılımdaki verileri işleyin.
  11. Kromatogram penceresinde Görüntüle | TİC | ScanWaveDS | İzleme ekle | Kızının kütle spektrumlarını taramasını sağlamak için tamam.
  12. 2,4-dibromofenol tedavisinin kromatogramlarını ve kontrolleri karşılaştırarak metabolitleri tanımlayın.
  13. Metabolit adaylarını alıkonma süresi, kütle ve parçalanma paternlerine göre açıklayın16,17.
    NOT: Metabolit adaylarının ana iyonlarının deneysel m/z değerleri ile karşılık gelen teorik m/z değerleri arasındaki kütle doğruluğu hatası 10 ppm'den az olmalıdır.

Sonuçlar

Protokolün adımları Şekil 1'de gösterilmiştir. Protokolü takiben, 2,4-dibromofenol tedavisinden elde edilen havuç kallus ekstraktının kromatogramını kontrollerle karşılaştırdık ve 2,4-dibromofenol tedavisinde bulunan ancak kontrollerde bulunmayan sekiz farklı pik bulduk (Şekil 2). Bu, 2,4-dibromofenol ile muamele edilmiş havuç kallusunda toplam sekiz 2,4-dibromofenol metabolitinin (M562, M545, M661, M413, M339, M380, M424 ve M187) başarıyl...

Tartışmalar

Bu protokol, bitkilerde ksenobiyotiklerin biyodönüşümünü verimli bir şekilde tanımlamak için geliştirilmiştir. Bu protokolün kritik adımı, bitki kallusunun kültürüdür. En zor kısım bitki nasırının farklılaşması ve bakımıdır, çünkü bitki nasırı kolayca enfekte olur ve bitki dokularına gelişir. Bu nedenle, kullanılan tüm ekipmanların otoklavlandığından ve tüm işlemlerin aseptik koşullar altında yapıldığından emin olmak önemlidir. Ototrofik büyüme ve aşırı gelişmeyi ?...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (21976160) ve Zhejiang Eyaleti Kamu Refahı Teknolojisi Uygulama Araştırma Projesi (LGF21B070006) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
2,4-dichlorophenoxyacetic acidWAKO1 mg/L
20% H2O2Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.10011218-500ML
4-n-NP, >99%Dr. Ehrenstorfer GmbH
4-n-NP-d4Pointe-Claire
6-benzylaminopurineWAKO0.5 mg/L
75% ethanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.1269101-500ML
7890A-5975 gas chromatographyAgilent
ACQULTY ultra-performance liquid chromatographyWaters
Amber glass vialsWaters
Artificial climate incubatorNingbo DongNan Lab Equipment Co.,LTDRDN-1000A-4
AutoclavesSTIKMJ-Series
C18 columnACQUITY UPLC BEH
CentrifugeThermo Fisher
DB-5MS capillary columnAgilent
DichloromethaneSigma-Aldrich40071190-4L
Freeze dryerSCIENTZ 
High-throughput tissue grinderSCIENTZ 
MethanolSigma-Aldrich
MicrOTOF-QII mass spectrometerBruker Daltonics
Milli-Q systemMilliporeMS1922801-4L
Murashige & Skoog mediumHOPEBIOHB8469-7
N-hexaneSigma-AldrichH109658-4L
Nitrogen blowing instrument AOSHENGMD200-2
NP isomers, >99%Dr. Ehrenstorfer GmbH
Oasis HLB cartridgesWaters60 mg/3 mL
Research plusEppendorf100-1000 µL
Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus) Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Shaking IncubatorsShanghai bluepard instruments Co.,ltd.THZ-98AB
Solid phase extractorAUTO SCIENCE
Ultrasound machineZKIUC-6
UV-sterilized ultra-clean workbenchAIRTECH

Referanslar

  1. Chakraborty, P., et al. Baseline investigation on plasticizers, bisphenol A, polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in the surface soil of the informal electronic waste recycling workshops and nearby open dumpsites in Indian metropolitan cities. Environmental Pollution. 248, 1036-1045 (2019).
  2. Abril, C., Santos, J. L., Martin, J., Aparicio, I., Alonso, E. Occurrence, fate and environmental risk of anionic surfactants, bisphenol A, perfluorinated compounds and personal care products in sludge stabilization treatments. Science of the Total Environment. 711, 135048 (2020).
  3. Xu, Y. W., et al. Determination and occurrence of bisphenol A and thirteen structural analogs in soil. Chemosphere. 277, 130232 (2021).
  4. Cai, Q. Y., et al. Occurrence of nonylphenol and nonylphenol monoethoxylate in soil and vegetables from vegetable farms in the Pearl River Delta, South China. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 63 (1), 22-28 (2012).
  5. Wang, S. Y., et al. et al Migration and health risks of nonylphenol and bisphenol a in soil-winter wheat systems with long-term reclaimed water irrigation. Ecotoxicology and Environmental Safety. 158, 28-36 (2018).
  6. Gunther, K., Racker, T., Bohme, R. An isomer-specific approach to endocrine-disrupting nonylphenol in infant food. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (6), 1247-1254 (2017).
  7. Van Eerd, L. L., Hoagland, R. E., Zablotowicz, R. M., Hall, J. C. Pesticide metabolism in plants and microorganisms. Weed Science. 51 (4), 472-495 (2003).
  8. Hillebrands, L., Lamshoeft, M., Lagojda, A., Stork, A., Kayser, O. Evaluation of callus cultures to elucidate the metabolism of tebuconazole, flurtamone, fenhexamid, and metalaxyl-M in Brassica napus L., Glycine max (L.) Merr., Zea mays L., and Triticum aestivum L. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (48), 14123-14134 (2020).
  9. Macherius, A., et al. Metabolization of the bacteriostatic agent triclosan in edible plants and its consequences for plant uptake assessment. Environmental Science & Technology. 46 (19), 10797-10804 (2012).
  10. Sun, J. Q., et al. Uptake and metabolism of nonylphenol in plants: Isomer selectivity involved with direct conjugation. Environmental Pollution. 270, 116064 (2021).
  11. Schymanski, E. L., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental Science & Technology. 48 (4), 2097-2098 (2014).
  12. Moschet, C., Anumol, T., Lew, B. M., Bennett, D. H., Young, T. M. Household dust as a repository of chemical accumulation: new insights from a comprehensive high-resolution mass spectrometric study. Environmental Science & Technology. 52 (5), 2878-2887 (2018).
  13. Ren, Z., et al. Hydroxylated PBDEs and brominated phenolic compounds in particulate matters emitted during recycling of waste printed circuit boards in a typical e-waste workshop of South China. Environmental Pollution. 177, 71-77 (2013).
  14. de Wit, C. A. An overview of brominated flame retardants in the environment. Chemosphere. 46 (5), 583-624 (2002).
  15. Sun, J. Q., Chen, Q., Qian, Z. X., Zheng, Y., Yu, S. A., Zhang, A. P. Plant Uptake and Metabolism of e,4-Dibromophenol in Carrot: In Vitro Enzymatic Direct Conjugation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (17), 4328-4335 (2018).
  16. Chibwe, L., Titaley, I. A., Hoh, E., Simonich, S. L. M. Integrated framework for identifying toxic transformation products in complex environmental mixtures. Environmental Science & Technology Letters. 4 (2), 32-43 (2017).
  17. Hollender, J., Schymanski, E. L., Singer, H. P., Ferguson, P. L. Nontarget screening with high resolution mass spectrometry in the environment: ready to go. Environmental Science & Technology. 51 (20), 11505-11512 (2017).
  18. Nafisi, M., Fimognari, L., Sakuragi, Y. Interplays between the cell wall and phytohormones in interaction between plants and necrotrophic pathogens. Phytochemistry. 112, 63-71 (2015).
  19. Zhang, Q., et al. Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants. Environmental Science & Technology. 53 (13), 7473-7482 (2019).
  20. Hou, X., et al. Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin. Environmental Science & Technology. 53 (15), 8805-8812 (2019).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

evre BilimleriSay 192

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır