Chiarire il metabolismo del 2,4-dibromofenolo nelle piante

Riepilogo

Il presente protocollo descrive un metodo semplice ed efficace per l'identificazione dei metaboliti del 2,4-dibromofenolo nelle piante.

Abstract

Le colture possono essere ampiamente esposte a inquinanti organici, poiché il suolo è un importante pozzo di assorbimento per gli inquinanti scartati nell'ambiente. Ciò crea una potenziale esposizione umana attraverso il consumo di alimenti inquinanti accumulati. Chiarire l'assorbimento e il metabolismo degli xenobiotici nelle colture è essenziale per la valutazione del rischio di esposizione alimentare nell'uomo. Tuttavia, per tali esperimenti, l'uso di piante intatte richiede esperimenti a lungo termine e complessi protocolli di preparazione dei campioni che possono essere influenzati da vari fattori. Le colture di callo delle piante combinate con la spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS) possono fornire una soluzione per l'identificazione accurata e rapida dei metaboliti degli xenobiotici nelle piante, in quanto possono evitare interferenze dal microambiente microbico o fungino, ridurre la durata del trattamento e semplificare l'effetto matrice delle piante intatte. Il 2,4-dibromofenolo, un tipico ritardante di fiamma e interferente endocrino, è stato scelto come sostanza modello a causa della sua presenza diffusa nel suolo e del suo potenziale di assorbimento da parte delle piante. In questo caso, il callo della pianta è stato generato da semi di asepsi ed esposto a terreno di coltura sterile contenente 2,4-dibromofenolo. I risultati hanno mostrato che otto metaboliti del 2,4-dibromofenolo sono stati identificati nei tessuti del callo della pianta dopo 120 ore di incubazione. Ciò indica che il 2,4-dibromofenolo è stato rapidamente metabolizzato nei tessuti callosi della pianta. Pertanto, la piattaforma di coltura del callo vegetale è un metodo efficace per valutare l'assorbimento e il metabolismo degli xenobiotici nelle piante.

Introduzione

Un numero crescente di inquinanti organici è stato scartato nell'ambiente a causa delle attività antropiche^1,2 e il suolo è considerato un importante pozzo di assorbimento per questi contaminanti ^3,4. I contaminanti presenti nel suolo possono essere assorbiti dalle piante e potenzialmente trasferiti a organismi di livello trofico superiore lungo le catene alimentari, entrando direttamente nel corpo umano attraverso il consumo delle colture, portando di conseguenza a un'esposizione involontaria ^5,6. Le piante utilizzano diversi percorsi per metabolizzare gli xenobiotici per la disintossicazione⁷; Chiarire il metabolismo degli xenobiotici è importante, in quanto controlla il destino effettivo dei contaminanti nelle piante. Poiché i metaboliti possono essere escreti dalle foglie (nell'atmosfera) o dalle radici, la determinazione dei metaboliti nelle primissime fasi di esposizione offre quindi la possibilità di testare un numero esteso di metaboliti⁸. Tuttavia, gli studi che utilizzano piante intatte richiedono esperimenti a lungo termine e complessi protocolli di preparazione dei campioni che possono essere influenzati da vari fattori.

Le colture di callo delle piante, quindi, sono una buona alternativa per studiare il metabolismo degli xenobiotici nelle piante, in quanto possono ridurre notevolmente i tempi di trattamento. Queste colture escludono l'interferenza microbica e la degradazione fotochimica, semplificano l'effetto matrice delle piante intatte, standardizzano le condizioni di coltivazione e richiedono meno sforzo sperimentale. Le colture di callo vegetale sono state applicate con successo come approccio alternativo negli studi metabolici di triclosan⁹, nonilfenolo¹⁰ e tebuconazolo⁸. Questi studi hanno dimostrato che i modelli metabolici nelle colture di calli erano simili a quelli delle piante intatte. Questo studio propone un metodo per l'identificazione efficiente e accurata dei metaboliti degli xenobiotici nelle piante senza protocolli complessi e dispendiosi in termini di tempo. Qui, utilizziamo colture di calli vegetali in combinazione con spettrometria di massa ad alta risoluzione per l'analisi di metaboliti con segnali a bassa intensità^11,12.

A tal fine, le sospensioni di callo di carota (Daucus carota var. sativus) sono state esposte a 100 μg/L di 2,4-dibromofenolo per 120 ore in uno shaker a 130 giri/min e 26 °C. Il 2,4-dibromofenolo è stato scelto a causa della sua attività endocrina dirompente¹³ e della sua presenza diffusa nel suolo¹⁴. I metaboliti sono stati estratti e analizzati mediante spettrometria di massa ad alta risoluzione. Il protocollo qui proposto può indagare il metabolismo in pianta di altri tipi di composti organici che possono essere ionizzati.

Protocollo

1. Differenziazione del callo della carota

NOTA: Autoclavare tutte le apparecchiature utilizzate qui ed eseguire tutte le operazioni in un banco da lavoro ultra-pulito sterilizzato ai raggi UV.

1. Vernalizzare i semi immergendo i semi di carota uniforme (Daucus carota var. sativus) in acqua deionizzata a 4 °C per 16 ore.
2. Sterilizzare in superficie i semi vernalizzati con etanolo al 75% per 20 minuti, quindi risciacquare tre volte con acqua deionizzata sterile in condizioni asettiche.
3. Sterilizzare ulteriormente i semi con il 20%di H 2 O₂ per 20 minuti e lavarli con acqua deionizzata sterilizzata sei volte in condizioni asettiche.
4. germinare asetticamente i semi seminandoli su terreno MS privo di ormoni (pH 5,8, autoclavato a 121 °C per 20 min) contenente l'1% di gel di agar, e incubando a 26 °C con fotoperiodo di 16 h (350 μmol/m²s) per 15 giorni.
5. Ottenere gli espianti tagliando l'ipocotile e il cotiledone delle piantine in piccoli pezzi (0,5 cm).
6. Trasformare gli espianti in piastre di Petri (da due a quattro espianti per capanna) contenenti 15-20 mL di terreno MS asettico integrato con auximone (acido 2,4-diclorofenossiacetico; 1 mg/L) e fitochinina (6-benzilaminopurina; 0,5 mg/L) in condizioni asettiche.
7. Incubare gli espianti al buio a 26 °C per 3-4 settimane per indurre il callo.
8. Separare i tessuti calli (circa 1 cm di diametro) formati dagli espianti iniziali utilizzando un bisturi sterile e una pinza.
   NOTA: I tessuti del callo appena formati sono di colore da bianco a giallo crema e si attaccano liberamente agli espianti iniziali.

2. Trattamento con 2,4-dibromofenolo

1. Sciogliere 1 μg di 2,4-dibromofenolo in 10 mL di terreno MS liquido asettico (la concentrazione finale di 2,4-dibromofenolo è 100 ppb, pH 5,6-7,0).
2. Aggiungere 3 g di callo di carota fresco (fase 1.8) in matracci di vetro contenenti la soluzione preparata di 2,4-dibromofenolo (fase 2.1) in condizioni asettiche. Consideralo come il trattamento con 2,4-dibromofenolo.
   NOTA: I palloni di vetro sono stati sterilizzati in autoclave e sigillati con pellicola di paraffina.
3. Includere un mezzo di controllo contenente solo la soluzione di 2,4-dibromofenolo (preparata nella fase 2.1) per valutare la degradazione abiotica del 2,4-dibromofenolo.
4. Includere un controllo in bianco contenente solo il callo della carota (nessuna soluzione di 2,4-dibromofenolo) per verificare l'eventuale presenza di eventuali contaminazioni.
   1. Preparare il bianco di controllo contenente la carota aggiungendo 3 g di callo di carota appena raccolto in 10 ml di terreno MS sterile.
5. Incubare il trattamento con 2,4-dibromofenolo e i controlli in bianco e in bianco a 130 giri/min e 26 °C al buio in un incubatore per 120 ore.
6. Rimuovere i matracci di vetro dall'incubatore per raccogliere i campioni del trattamento con 2,4-dibromofenolo e dei controlli dopo 120 ore di incubazione.
   NOTA: Tutti i campioni sono stati preparati in triplice copia.

3. Preparazione del campione

1. Separare accuratamente il callo dal mezzo MS mediante filtrazione con filtri in fibra di vetro (0,45 μm) per il trattamento con 2,4-dibromofenolo e i controlli. Raccogliere il callo dopo il lavaggio con acqua ultrapura tre volte.
2. Liofilizzare il callo raccolto con azoto liquido e successivamente omogeneizzare il callo raccolto (0,2 g) con un macinatore tissutale ad alta produttività a 70 Hz per 3 minuti.
3. Spike il callo omogeneizzato aggiungendo 50 μL di surrogato 4-n-NP-d₄ da 25 mg/L con una microsiringa di vetro e successivamente facendo vortice per 1 minuto.
4. Sonicare i campioni con 5 mL di metanolo/acqua (1:1, v/v) in un ultrasuonatore (150 W, 40 kHz) riempito con acqua ghiacciata per 30 minuti, per estrarre il 2,4-dibromofenolo e i metaboliti.
5. Centrifugare le sospensioni a 8.000 x g a 4 °C per 10 minuti e raccogliere i surnatanti mediante pipettaggio.
   1. Ripetere tre volte i processi di estrazione del campione di callo e combinare gli estratti.
6. Passare gli estratti attraverso cartucce di estrazione idrofila lipofila bilanciata in fase solida (HLB SPE) con una portata di 1 mL/min.
   NOTA: Le cartucce HLB SPE sono state pretrattate in sequenza con 6 mL di metanolo e 6 mL di acqua per rimuovere eventuali interferenze.
7. Eluire gli analiti facendo passare 6 mL di metanolo attraverso le cartucce HLB SPE. Quindi, concentrare gli eluenti ottenuti a 1 mL sotto un leggero flusso di azoto gassoso per l'analisi strumentale.
8. Iniettare 10 μL di eluenti risultanti nell'UPLC-Q-TOF-MS per l'analisi del 2,4-dibromofenolo e dei loro metaboliti¹⁵.
   1. Filtrare tutti i campioni con una membrana di nylon da 0,22 μm prima dell'analisi strumentale.

4. Analisi strumentale

NOTA: Le analisi del 2,4-dibromofenolo e dei loro metaboliti sono state eseguite su un cromatografo liquido ad alte prestazioni (UPLC) in combinazione con uno spettrometro di massa micrOTOF-QII dotato di ionizzazione elettrospray (ESI), operante in modalità ionica positiva e negativa.

1. Aprire lo sportello del riscaldatore della colonna e installare la colonna UPLC collegando l'ingresso della colonna alla valvola di iniezione e l'uscita della colonna all'ingresso dello spettrometro di massa.
   NOTA: Per la separazione degli analiti a 40 °C è stata utilizzata una colonna C18 (50 mm x 2,1 mm; dimensione delle particelle 1,7 μm).
2. Collegare la fase mobile A (acqua ultrapura) e la fase mobile B (metanolo per cromatografia) allo strumento inserendo l'estremità dei tubi del solvente A e B rispettivamente nei corrispondenti flaconi di solvente.
   1. Filtrare tutte le fasi mobili (500 mL per ciascuna) attraverso un filtro da 0,22 μm e sonicare per più di 30 minuti.
3. Nella finestra del software, fare clic su Strumento | Metodo di ingresso per modificare le condizioni del cromatogramma liquido.
   1. Impostare le condizioni di gradiente della fase mobile B come segue: una portata di 1,0 mL/min; 0-0,5 min, 5%; 0,5-3,5 minuti, dal 5% al 50%; 3,5-6,5 minuti, dal 50% al 100%; 6,5-7 minuti, 100%; 7-10 minuti, dal 100% al 5%.
   2. Impostare la velocità di iniezione dei campioni nell'UPLC-Q-TOF-MS su 0,2 mL/min.
      NOTA: L'iniezione del campione viene programmata utilizzando un campionatore completamente automatico.
4. Nella finestra del software, selezionare MS Method e quindi impostare i parametri di Q-TOF-MS: una portata del gas di essiccazione (N₂) di 8 L/min, una temperatura di 300-350 °C; una tensione capillare di 4.500 V; un'energia di collisione di 5-45 V; e un intervallo di scansione completo di 40-800 Da.
5. Posizionare le fiale dei campioni nelle posizioni corrispondenti dei vassoi dei campioni in base al numero di serie e reinserire i vassoi dei campioni nella camera del campione.
   NOTA: Tenere i vassoi dei campioni piatti e assicurarsi che lo sportello della camera dei campioni sia chiuso.
6. Nella finestra del software, selezionare File | Nuovo per creare un database. Assegnare un nome al database.
7. Caricare il programma di esempio creato in precedenza selezionando MS File | File di ingresso | Iniettare volume.
8. Salvare il database nella cartella di esempio del progetto facendo clic su File | Salva.
9. Selezionare Esegui | Iniziare dalla finestra principale del software, quindi selezionare Acquisisci dati di esempio e fare clic su OK nella finestra dell'elenco di esempio di avvio per raccogliere i dati.
   NOTA: Il cromatogramma in tempo reale può essere visualizzato facendo clic su Cromatogramma | Aggiornamento in tempo reale durante il processo di acquisizione dei dati.
10. Elaborare i dati nel software selezionando la riga dei dati di destinazione e facendo clic sulla finestra Cromatogramma per visualizzare il cromatogramma MS.
11. Nella finestra Cromatogramma , fare clic su Visualizza | TIC | ScanWaveDS | Aggiunta di traccia | OK per ottenere la figlia scansione spettri di massa.
12. Identificare i metaboliti confrontando i cromatogrammi del trattamento con 2,4-dibromofenolo e i controlli.
13. Chiarire i metaboliti candidati in base al tempo di ritenzione, alla massa e ai modelli di frammentazione^16,17.
    NOTA: L'errore di accuratezza della massa tra i valori sperimentali m/z degli ioni progenitori dei metaboliti candidati e i corrispondenti m/z teorici deve essere inferiore a 10 ppm.

Risultati

I passaggi del protocollo sono illustrati nella Figura 1. Seguendo il protocollo, abbiamo confrontato il cromatogramma dell'estratto di callo di carota dal trattamento con 2,4-dibromofenolo ai controlli e abbiamo trovato otto picchi distinti che sono presenti nel trattamento con 2,4-dibromofenolo ma assenti nei controlli (Figura 2). Ciò indica che un totale di otto metaboliti del 2,4-dibromofenolo (M562, M545, M661, M413, M339, M380, M424 e M187) sono stati ril...

Discussione

Questo protocollo è stato sviluppato per identificare in modo efficiente la biotrasformazione degli xenobiotici nelle piante. La fase critica di questo protocollo è la coltura del callo della pianta. La parte più difficile è la differenziazione e il mantenimento del callo della pianta, perché il callo della pianta si infetta facilmente e si sviluppa nei tessuti vegetali. Pertanto, è importante assicurarsi che tutte le apparecchiature utilizzate siano sterilizzate in autoclave e che tutte le operazioni vengano esegu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-dichlorophenoxyacetic acid	WAKO	1 mg/L
20% H2O2	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10011218-500ML
4-n-NP, >99%	Dr. Ehrenstorfer GmbH
4-n-NP-d4	Pointe-Claire
6-benzylaminopurine	WAKO	0.5 mg/L
75% ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	1269101-500ML
7890A-5975 gas chromatography	Agilent
ACQULTY ultra-performance liquid chromatography	Waters
Amber glass vials	Waters
Artificial climate incubator	Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD	RDN-1000A-4
Autoclaves	STIK	MJ-Series
C18 column	ACQUITY UPLC BEH
Centrifuge	Thermo Fisher
DB-5MS capillary column	Agilent
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	40071190-4L
Freeze dryer	SCIENTZ
High-throughput tissue grinder	SCIENTZ
Methanol	Sigma-Aldrich
MicrOTOF-QII mass spectrometer	Bruker Daltonics
Milli-Q system	Millipore	MS1922801-4L
Murashige & Skoog medium	HOPEBIO	HB8469-7
N-hexane	Sigma-Aldrich	H109658-4L
Nitrogen blowing instrument	AOSHENG	MD200-2
NP isomers, >99%	Dr. Ehrenstorfer GmbH
Oasis HLB cartridges	Waters	60 mg/3 mL
Research plus	Eppendorf		100-1000 µL
Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus)	Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Shaking Incubators	Shanghai bluepard instruments Co.,ltd.	THZ-98AB
Solid phase extractor	AUTO SCIENCE
Ultrasound machine	ZKI	UC-6
UV-sterilized ultra-clean workbench	AIRTECH