וסקולריזציה יעילה של אורגנואידים בכליות באמצעות השתלה אינטרסלומית בעוברי תרנגולות

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להשתלת אורגנואידים בכליות בחלל הצלומי של עוברי תרנגולות. שיטה זו גורמת לכלי דם ולהבשלה משופרת של האורגנואידים תוך 8 ימים וניתן להשתמש בה כדי ללמוד תהליכים אלה בצורה יעילה.

Abstract

אורגנואידים בכליות שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם מכילים מבנים דמויי נפרון הדומים במידה מסוימת לאלה שבכליה הבוגרת. למרבה הצער, היישום הקליני שלהם נפגע על ידי היעדר כלי דם תפקודי וכתוצאה מכך הבשלה מוגבלת במבחנה. השתלת אורגנואידים בכליות בחלל הצלומי של עוברי תרנגולות גורמת לכלי דם מחוררים, כולל היווצרות נימים גלומרולריים, ומשפרת את התבגרותם. טכניקה זו יעילה מאוד, ומאפשרת השתלה וניתוח של מספר רב של אורגנואידים. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט להשתלה אטרקלומית של אורגנואידים בכליות בעוברי תרנגולות, ואחריו הזרקת לקטין מסומן פלואורסצנטית כדי להכתים את כלי הדם המחוררים, ואיסוף אורגנואידים מושתלים לניתוח הדמיה. שיטה זו יכולה לשמש כדי לגרום ולחקור כלי דם אורגנואידים והתבגרות כדי למצוא רמזים לשיפור תהליכים אלה במבחנה ולשפר מודלים של מחלות.

Introduction

אורגנואידים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC) הוכחו כבעלי פוטנציאל למחקרים התפתחותיים 1,2,3,4, בדיקת רעילות ^5,6 ומידול מחלות^{5,7,8,9,10,11,12,13}. עם זאת, תחולתם למטרות השתלה קלינית אלה ובסופו של דבר מוגבלת על ידי היעדר רשת כלי דם. במהלך התפתחות הכליות העובריות, פודוציטים, תאים מזנגיאליים ותאי אנדותל וסקולריים (ECs) מתקשרים כדי ליצור את המבנה המורכב של הגלומרולוס. ללא אינטראקציה זו, מחסום הסינון הגלומרולרי, המורכב מפודוציטים, קרום המרתף הגלומרולרי (GBM) ו- ECs, אינו יכול להתפתח כראוי^14,15,16. למרות שאורגנואידים במבחנה בכליות מכילים כמה ECs, אלה אינם מצליחים ליצור רשת כלי דם תקינה ופוחתים עם הזמן¹⁷. לכן אין זה מפתיע שהאורגנואידים נותרים לא בשלים. השתלה בעכברים גורמת לכלי דם ולהבשלה של אורגנואידי הכליה 18,19,20,21. למרבה הצער, זהו תהליך עתיר עבודה שאינו מתאים לניתוח של מספר רב של אורגנואידים.

עוברי תרנגולות שימשו לחקר כלי דם והתפתחות במשך יותר ממאה שנה^22. הם נגישים בקלות, דורשים תחזוקה נמוכה, חסרים מערכת חיסונית מתפקדת במלואה, ויכולים להתפתח באופן תקין לאחר פתיחת קליפת הביצה ^23,24,25,26. השתלת אורגנואידים על הממברנה הכוריואלנטית שלהם (CAM) הוכחה כמובילה לכלי דם²⁷. עם זאת, משך ההשתלה על CAM, כמו גם את רמת ההבשלה של השתל, מוגבלים על ידי היווצרות CAM, אשר לוקח עד יום 7 העוברי כדי להשלים. לכן, פותחה לאחרונה שיטה לכלי דם יעילים ולהבשיל אורגנואידים בכליה באמצעות השתלה אטרסלומית בעוברי תרנגולות²⁸. החלל הצלומי של עוברי תרנגולות ידוע מאז שנות השלושים כסביבה נוחה להתמיינות רקמות עובריות^29,30. ניתן לגשת אליו בשלב מוקדם של ההתפתחות העוברית ומאפשר הרחבה בלתי מוגבלת יחסית של השתל לכל הכיוונים.

מאמר זה מתאר פרוטוקול להשתלת אורגנואידים שמקורם בכליות hiPSC בחלל הצלומי של עוברי תרנגולות ביום 4. שיטה זו גורמת לכלי דם ולהבשלה משופרת של האורגנואידים תוך 8 ימים. הזרקת עדשה בעלת תווית פלואורסצנטית culinaris agglutinin (LCA) לפני הקרבת העוברים מאפשרת הדמיה של כלי דם מחוררים בתוך האורגנואידים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

Protocol

בהתאם לחוק ההולנדי, לא נדרש אישור של הוועדה לרווחת בעלי חיים למחקר זה.

1. הכנת אורגנואידים שמקורם בכליות hiPSC להשתלה

1. להבדיל hiPSCs לאורגנואידים בכליות באמצעות הפרוטוקול שפותח על ידי Takasato et al.4,18,31. תרבית את האורגנואידים לפי פרוטוקול זה על תוספות תרבית תאי פוליאסטר עם נקבוביות 0.4 מיקרומטר (תוספות תרבית תאים) עד ליום 7 + 12 להתמיינות. כל תוספת תרבית תאים תכיל שלושה אורגנואידים.
2. הסר את האורגנואידים מעלון תרבית התא.
   1. לעשות חור באמצע הקרום של תרבית התא להכניס עם זוג מלקחיים ניתוח. בעזרת מספריים מנתחים, לבצע שלושה חתכים בקרום מן החור באמצע לקצה של תרבית התא להחדיר, לחתוך בין אורגנואידים. התוצאה תהיה שלוש חתיכות של קרום, שלכל אחת מהן מחובר אורגנואיד אחד, שעדיין מחוברות לתרבית התא המוחדרת בקצה החיצוני שלהן.
   2. אחזו באחת מפיסות הקרום הקרובות לקצהו החיצוני בעזרת זוג מלקחיים וקרעו אותה מתרבית התא. מניחים את חתיכת הממברנה עם האורגנואיד המחובר בצלחת פטרי. הוסף כמה טיפות של מלח חוצץ פוספט של Dulbecco (DPBS) ללא סידן ומגנזיום (^DPBS-/-) לאורגנואיד כדי למנוע התייבשות. חזור על הפעולה עבור שני האורגנואידים האחרים.
3. חתכו את האורגנואידים על ידי החזקת הממברנה שלהם במקומה עם מלקחיים וחתכו אותם לשניים עם סכין גילוח מפלדת אל-חלד בעלת קצה כפול (אורגנואיד שלם גדול מכדי שהסלום יוכל להכיל בשלב זה של ההתפתחות). דוחפים בעדינות את שני חצאי האורגנואידים מהממברנה עם דיסקטור דורה. יש להשליך את הממברנה ולהשאיר את האורגנואידים ב-DPBS^-/- עד להשתלה.
   הערה: הכינו עד שלושה אורגנואידים בכל פעם להשתלה כדי למנוע לחץ על האורגנואידים לפני ההשתלה. באופן אידיאלי, אדם אחד מכין את האורגנואידים בעוד אחר מבצע את ההשתלה.

2. הכנת עוברי תרנגולות להשתלה

1. לדגור על ביצי לגורן לבנות מופרות. התחל את הדגירה של הביציות ביום התמיינות אורגנואידים בכליות יום 7 + 8 כדי להבטיח את העיתוי הנכון של ההשתלה.
   1. הניחו את ביצי הרגל הלבנות המופרות (Gallus domesticus) בצורה אופקית על מחזיק (איור 1A; יום 0), סימון אמצע הצד הפונה כלפי מעלה בעיפרון.
      הערה: מחזיקי פלסטיק בהתאמה אישית או קרטוני ביצים יכולים לשמש כמחזיקים כדי לדגור על הביצים.
   2. הניחו את המחזיק עם הביצים באינקובטור לח בטמפרטורה של 38 ± 1 מעלות צלזיוס (איור 1A; יום 0).
   3. דוגרים על הביצים במשך 3 ימים, תוך שמירה על אגן המים באינקובטור מלא.
2. צרו חלון בקליפת הביצה ביום השלישי של הדגירה.
   1. ביום השלישי של הדגירה, מניחים חתיכה קטנה (~ 1 ס"מ x 0.5 ס"מ) של סרט שקוף על הקצה המחודד של הביצה (קצה קטן). צור חור קטן בקליפת הביצה באמצע הסרט השקוף על ידי הקשה עליו עם הקצה החד של זוג מספריים מנתחים.
   2. הכניסו מחט 19 גרם על מזרק 5 מ"ל לתוך החור בזווית של 45 מעלות, כדי למנוע נזק לשק החלמון, ושאפו 2-3 מ"ל אלבומן מהביצה כדי להוריד את העובר בתוך הביצית. אטמו את החור בחתיכה שנייה (~ 1 ס"מ x 0.5 ס"מ) של סרט שקוף.
   3. מניחים חתיכה גדולה (~ 5 ס"מ x 5 ס"מ) של סרט שקוף על הצד המסומן בעיפרון ופונה כלפי מעלה של הביצה. צרו חור בקליפת הביצה במרכז הסרט השקוף על-ידי הקשה עליו עם הקצה החד של זוג מספריים מנתחים (איור 1A; יום 3).
   4. מתחילים מהחור הזה, חותכים חלון עגול קטן בקליפת הביצה באמצעות מספריים מנתחים מעוקלים. הסתכלו דרך החלון הזה כדי לאתר את העובר, ואז הגדילו את החלון כדי למטב את הגישה לעובר (איור 1A; יום 3).
   5. הסר חתיכות גדולות של קליפת ביצה שאולי נפלו על גבי העובר באמצעות מלקחיים. הסר חתיכות קטנות יותר על ידי הנחת כמה טיפות של DPBS עם סידן ומגנזיום (^DPBS+/+) על העובר עם פיפטה העברת פלסטיק, ולאחר מכן שאיפה DPBS^+/+ עם קליפת הביצה לתוך פיפטה.
   6. הוסף שלוש טיפות של ^DPBS+/+ בתוספת 0.5% פניצילין/סטרפטומיצין לביצה באמצעות פיפטה להעברת פלסטיק.
   7. אטמו בזהירות את החלון עם חתיכה גדולה (~ 5 ס"מ x 5 ס"מ) של סרט שקוף לפני החזרת הביצית לאינקובטור עד ליום 4 של הדגירה, כאשר העובר נמצא בשלב המבורגר-המילטון 23-24 (HH 23-24)³².
      הערה: איטום החלון חשוב מאוד כדי למנוע התייבשות ומוות של העובר.
   8. בדוק את העוברים מדי יום עבור קיימא על ידי הסתכלות עליהם דרך הסרט (לא להסיר את הסרט כדי למנוע התייבשות). במהלך הימים הראשונים של הדגירה, צבע חלמון הביצה משתנה מצהוב בהיר לצהוב מט עם מות העובר. השליכו עוברים שנפטרו.
   9. שמור על אגן המים באינקובטור מלא.

3. השתלה Intracelomic ביום 4 של הדגירה

1. קבלת גישה לחלל הצלומי
   1. גזור את הקלטת מהחלון עם מספריים ניתוח מעוקל.
   2. מניחים את הביצה תחת מיקרוסקופ נתיחה על מחזיק גומי או קרטון ביצים.
   3. עובר התרנגולת נמצא כעת ב-HH 23-24 ושוכב על צדו השמאלי, כשצדו הימני פונה אל הצופה (איור 1A; יום 4). אתר את הכנף הימנית ואת ניצן הרגל של העובר, כמו celom יהיה נגיש בין שני ניצני הגפיים האלה. באזור שבין הכנף הימנית לניצן הרגל, יוצרים פתח רציף בקרום הוויטליין, בכוריון ובמי השפיר, על ידי החזקתם בשני זוגות מלקחיים מנתחים ומשיכה עדינה שלהם לכיוונים מנוגדים.
      הערה: קרום ויטלין הוא הקרום הראשון שנתקלים בו לאחר פתיחת הביצית, ובמקרים מסוימים, כבר ניזוק לאחר ביצוע החלון ביום השלישי. אם מסובבים את העובר, שוכבים על צדו הימני כשצדו השמאלי פונה אל הצופה (איור 1A; יום 4), יש צורך להפוך אותו כדי לאפשר השתלה. כדי לעשות זאת, לעשות פתח גדול בקרום vitelline ו chorion, ולאחר מכן בזהירות להפוך את העובר סביב באמצעות מלקחיים.
   4. בדקו אם יש גישה ללא הפרעה לחלל הצלומי: אחזו בעדינות בקצה דופן הגוף שבין הכנף לניצן הגפה בעזרת זוג מלקחיים מנתחים ומשכו אותו מעט לכיוון הצופה. החלל הצלומי חייב להיות גלוי בבירור. הכניסו בזהירות מכשיר קהה אך דק (למשל, חוט טונגסטן קהה במחזיק מיקרואזמל) לתוך חלל הצלומי.
      הערה: אם החדרת המכשיר הקהה לחלל הצלומי אינה אפשרית, פירוש הדבר שאחד או יותר מהקרומים לא נפתחו כראוי.
2. השתלת
   1. מניחים חצי אורגנואיד בתוך הביצה על גבי האלנטואי באמצעות דיסקטור דורה.
   2. בעזרת מלקחיים מנתחים, אחזו בזהירות בקצה דופן הגוף ומשכו אותו מעט לכיוון הצופה כדי להפוך את הפתח לסלום לגלוי.
      הערה: יש להימנע מפגיעה בכלי הדם בדופן הגוף.
   3. העבירו בעדינות את האורגנואיד לכיוון ודרך הפתח בדופן הגוף לתוך הסלום בעזרת חוט טונגסטן קהה במחזיק מיקרו-אזמל. דחפו את האורגנואיד מעט בצורה גולגולתית כדי לתקוע אותו בתוך הצלום. כעת הוא נראה ממש מאחורי ניצן הכנף (איור 1A; יום 4).
   4. הוסיפו שלוש טיפות של ^DPBS+/+ לביצה באמצעות פיפטת העברה מפלסטיק.
   5. אטמו בזהירות את החלון עם חתיכה גדולה (~ 5 ס"מ x 5 ס"מ) של סרט שקוף לפני החזרת הביצה לאינקובטור עד ליום 12 של הדגירה (8 ימים לאחר ההשתלה).
   6. המשך לבדוק את העוברים מדי יום לקיום על ידי התבוננות בהם דרך הקלטת (אל תסיר את הסרט כדי למנוע התייבשות). השליכו עוברים שנפטרו.
      הערה: ככל שהעוברים והקרומים הכוריאואלנטיים שלהם גדלים, הם הופכים גלויים יותר דרך הקלטת. חוסר תנועה של העובר וכלי דם שקרסו או דלילים הם סימן למוות של העובר.
   7. בדוק את אגן המים באינקובטור מדי יום ושמור אותו מלא.

4. הזרקה של לקטין מסומן פלואורסצנטית

1. הכנה להזרקה
   1. הפוך מחטי מיקרו-הזרקה מזכוכית על ידי משיכת מיקרו-נימי זכוכית במושך מיקרופיפטה עם ההגדרות הבאות: חום 533, משיכה 60, מהירות 150, זמן 200. תוך כדי התבוננות דרך המיקרוסקופ המנתח, שברו בזהירות את קצות מחטי המיקרו-הזרקה באמצעות מלקחיים מנתחים ליצירת פתח.
      הערה: ההגדרות הנדרשות עבור מושך מיקרופיפטה עשויות להשתנות בהתאם להתקן.
   2. להרכיב את מערכת ההזרקה. קחו שתי חתיכות של צינורות סיליקון בקוטר 38 ס"מ וחברו אותן זו לזו על ידי הצבת מסנן של 0.2 מיקרומטר ביניהן. הכנס פיה לקצה הצינור המחובר לשקע המסנן (צינור סיליקון 1), ומחבר לקצה הצינור המחובר לכניסת המסנן (צינור סיליקון 2). לבסוף, הכניסו את מחט המיקרו-הזרקה למחבר (איור 1B).
   3. לדלל את העדשה culinaris agglutinin (LCA) עם תווית פלואורסצנטית עם ^DPBS-/ - לריכוז של 2.5 מ"ג ^mL-1 בצינור 0.5 מ"ל ולהסתובב למטה במשך ~ 30 שניות במיקרוצנטריפוגה כדי להזיז את האגרגטים לתחתית הצינור.
   4. פיפטה 20 μL של LCA על חתיכת parafilm.
   5. שאפו את 20 μL של LCA מן parafilm לתוך מחט microcapillary של מערכת ההזרקה התאספו.
2. זריקה
   1. גזור את הקלטת מהחלון עם מספריים ניתוח מעוקל. מניחים את הביצה תחת מיקרוסקופ ניתוח במחזיק גומי.
   2. העריכו את כלי הדם ואתרו את הוורידים, שניתן להבדיל בינם לבין העורקים על-ידי צבעם האדום הבהיר מעט יותר (איור 1A; יום 12). כדי לשפר את הגישה לכלי הדם, הגדל בזהירות את החלון על ידי חיתוך עם מספריים ניתוח מעוקל. בחר וריד להזרקה על סמך נגישות וגודל.
   3. הכנס את קצה המחט המיקרוקפילרית לווריד שנבחר בזווית של 0°-20º. ודא שהמחט נמצאת בווריד על ידי הזזת הקצה בעדינות מצד לצד. נשפו בעדינות ובהתמדה לתוך מערכת ההזרקה כדי להזריק את ה-LCA (איור 1A; יום 12).
      הערה: אם המחט בווריד נמצאת במיקום הנכון, היא צריכה להישאר בגבולות הווריד.
   4. מחזירים את הביצה לאינקובטור למשך 10 דקות כדי לאפשר ל-LCA לזרום.
      הערה: אין צורך לאטום את הביצה עם סרט במהלך תקופה זו.

5. איסוף אורגנואידים מושתלים ביום ה-12 לדגירה

1. הקרבת עובר התרנגולת
   1. מניחים את הביצה במחזיק גומי על הספסל. גזור את הקלטת מהחלון עם מספריים ניתוח מעוקל. לאחר מכן, חותכים דרך הקרומים המקיפים את העובר עם מספריים מנתחים מעוקלים.
      הערה: מיקרוסקופ מנתח אינו נדרש לשלב זה.
   2. גרפו את העובר מהביצית עם כף מחוררת ומיד ערפו את ראשו של העובר באמצעות מספריים. מניחים את גוף העובר בצלוחית פטרי מתחת למיקרוסקופ הדיסקציה.
2. איתור ואיסוף אורגנואידים
   1. הניחו את העובר על גבו בצלוחית הפטרי ופרשו את איבריו.
   2. פתח בזהירות את דופן הבטן של העובר לאורך ציר האורך באמצעות מלקחיים.
   3. אתר את האורגנואיד בתוך העובר. האורגנואיד נקשר לרוב לאונה הימנית של הכבד, בקצה הקאודלי או ממש מתחת לכלוב הצלעות (איור 1A; יום 12). לכן מומלץ להתחיל בחיפוש במקומות אלה.
   4. ברגע שהאורגנואיד מאותר, הוציאו אותו מהעובר על ידי חיתוך סביבו עם מספריים מיקרו. הניחו את האורגנואיד ואת רקמת העוף המחוברת אליו באופן בלתי נמנע בצלוחית פטרי מתחת למיקרוסקופ המנתח. הסר כמה שיותר רקמת עוף עם סכין גילוח מפלדת אל-חלד בעלת קצה כפול.
   5. עבד את האורגנואיד בהתאם לניתוח הרצוי.

6. צביעה אימונופלואורסצנטית בהר שלם

1. מניחים אורגנואיד מושתל בצלחת של 24 בארות ומקבעים ב-500 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-4°C למשך 24 שעות. לשטוף 3x עם ^DPBS-/-.
2. חדרו וחסמו את האורגנואיד ב-300 מיקרוליטר של תמיסה חוסמת (0.3% טריטון-X ב-DPBS^-/- המכיל 10% נסיוב חמורים) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
3. הכינו את תערובת הנוגדנים הראשונית: עבור אורגנואיד אחד, לדלל נוגדנים ראשוניים NPHS1 (כבש-α-אדם, דילול של 1:100), CD31 (עכבר-α-אדם, דילול של 1:100), ו-LTL (ביוטין-מצומד, דילול של 1:300) ב-300 מיקרוליטר של תמיסה חוסמת. מוסיפים את תערובת הנוגדנים לאורגנואיד ודגרים במשך 72 שעות ב-4°C.
4. יש לשטוף 3x עם 0.3% TritonX ^ב-DPBS-/-.
5. הכינו את תערובת הנוגדנים המשנית: עבור אורגנואיד אחד, לדלל נוגדנים משניים חמור-α-כבש Alexa Fluor 647 (דילול של 1:500), חמור-α-עכבר Alexa Fluor 488 (דילול של 1:500), ו streptavidin Alexa Fluor 405 (דילול של 1:200) ב 300 μL של פתרון חוסם. מוסיפים את תערובת הנוגדנים המשנית לאורגנואיד ודגרים במשך 2-4 שעות בטמפרטורת החדר. יש לכסות ברדיד אלומיניום כדי למנוע חשיפה של הנוגדנים המשניים לאור.
6. לשטוף 3x עם ^DPBS-/-.
7. הטמע את האורגנואיד ב~30 μL של אמצעי הרכבה בצלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ ואפשר להתייבש לילה בטמפרטורת החדר, מכוסה ברדיד אלומיניום. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
8. תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

תוצאות

השיטה וציר הזמן להבחנה של hiPSCs לאורגנואידים בכליות, דגירה של ביצי תרנגולות מופרות, השתלת אורגנואידים בכליות, הזרקת LCA ואיסוף האורגנואידים מסוכמים באיור 1A. חשוב לתאם את עיתוי התמיינות האורגנואידים והדגירה של ביצי תרנגולת, ולהתחיל את ההתמיינות 15 יום לפני הדגירה. הפעולות ביו?...

Discussion

בכתב יד זה מודגם פרוטוקול להשתלה אינטרטלומית של אורגנואידים שמקורם ב-hiPSC בעוברי תרנגולות. עם ההשתלה, אורגנואידים הם כלי דם על ידי כלי דם מחוררים המורכבים משילוב של ECs שמקורם באורגנואידים אנושיים ומקורם בעוף. אלה מפוזרים ברחבי האורגנואיד ופולשים למבנים הגלומרולריים, ומאפשרים אינטראקציה ב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm	Whatman	10462200
35 mm glass bottom dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes	Sigma-Aldrich	A5177-5EA	Contains silicone tubes, mouth piece and connector
Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope	Leica	TCS SP8
Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips	Hammacher Karl	HAMMHTC091-10
Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips	Hammacher Karl	HAMMHTC090-11
Dissecting microscope	Wild Heerbrugg	355110
Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp	Hammacher Karl	HAMMHSB391-10
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663
Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-212-02	dilution 1:500
Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647	ThermoFisher Scientific	A-21448	dilution 1:500
Double edged stainless steel razor blades	Electron Microsopy Sciences	72000
DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-)	ThermoFisher Scientific	14040133
DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+)	ThermoFisher Scientific	14190094
Egg cartons or custom made egg holders	NA	NA
Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus)	Drost Loosdrecht B.V.	NA
Incubator	Elbanton BV	ET-3 combi
Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated	Vector Laboratories	B-1325	dilution 1:300
Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm	Hammacher Karl	HAMMHSB500-09
Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament	World Precision Instruments	TW150F-3
Micropipette puller	Sutter Instrument Company	Model P-97	We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200
Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws.	Euronexia	L-120
Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher Scientific	P36930
Olivecrona dura dissector 18 cm	Reda	41146-18
Parafilm	Heathrow Scientific	HS234526B
Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL	ThermoFisher Scientific	15070063
Perforated spoon	Euronexia	S-20-P
Petri dish 60 x 15 mm	CELLSTAR	628160
Plastic transfer pipettes	ThermoFisher Scientific	PP89SB
Purified mouse anti-human CD31 antibody	BD Biosciences	555444	dilution 1:100
Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA)	Vector Laboratories	RL-1042	This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5)
Sheep anti-human NPHS1 antibody	R&D systems	AF4269	dilution 1:100
Sterile hypodermic needles, 19 G	BD microlance	301500
Streptavidin Alexa Fluor 405	ThermoFisher Scientific	S32351	dilution 1:200
Syringe 5 mL	BD Emerald	307731
Transparent tape	Tesa	4124	Available at most hardware stores
Triton X	Sigma-Aldrich	T9284
Tungsten wire, 0.25 mm dia	ThermoFisher Scientific	010404.H2