Vascolarizzazione efficiente degli organoidi renali attraverso il trapianto di intracelomica negli embrioni di pollo

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per il trapianto di organoidi renali nella cavità celomica degli embrioni di pollo. Questo metodo induce la vascolarizzazione e una maggiore maturazione degli organoidi entro 8 giorni e può essere utilizzato per studiare questi processi in modo efficiente.

Abstract

Gli organoidi renali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane contengono strutture simili a nefroni che assomigliano a quelle del rene adulto in una certa misura. Sfortunatamente, la loro applicabilità clinica è ostacolata dalla mancanza di una vascolarizzazione funzionale e di conseguenza dalla limitata maturazione in vitro. Il trapianto di organoidi renali nella cavità celomica degli embrioni di pollo induce la vascolarizzazione da parte dei vasi sanguigni perfusi, compresa la formazione di capillari glomerulari, e migliora la loro maturazione. Questa tecnica è molto efficiente, consentendo il trapianto e l'analisi di un gran numero di organoidi. Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per il trapianto tracciatomico di organoidi renali in embrioni di pollo, seguito dall'iniezione di lectina marcata con fluorescenza per colorare la vascolarizzazione perfusa e dalla raccolta di organoidi trapiantati per l'analisi di imaging. Questo metodo può essere utilizzato per indurre e studiare la vascolarizzazione e la maturazione organoide per trovare indizi per migliorare questi processi in vitro e migliorare la modellazione della malattia.

Introduzione

Gli organoidi renali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) hanno dimostrato di avere un potenziale per studi sullo sviluppo 1,2,3,4, screening di tossicità ^5,6 e modelli di malattia^{5,7,8,9,10,11,12,13}. Tuttavia, la loro applicabilità per questi e per eventuali scopi clinici di trapianto è limitata dalla mancanza di una rete vascolare. Durante lo sviluppo del rene embrionale, i podociti, le cellule mesangiali e le cellule endoteliali vascolari (ECs) interagiscono per formare l'intricata struttura del glomerulo. Senza questa interazione, la barriera di filtrazione glomerulare, costituita da podociti, membrana basale glomerulare (GBM) e CE, non può svilupparsi correttamente^14,15,16. Sebbene gli organoidi renali in vitro contengano alcune EC, queste non riescono a formare una rete vascolare adeguata e diminuiscono nel tempo¹⁷. Non sorprende quindi che gli organoidi rimangano immaturi. Il trapianto nei topi induce vascolarizzazione e maturazione degli organoidi renali 18,19,20,21. Sfortunatamente, questo è un processo ad alta intensità di lavoro che non è adatto per l'analisi di un gran numero di organoidi.

Gli embrioni di pollo sono stati utilizzati per studiare la vascolarizzazione e lo sviluppo per oltre un secolo²². Sono facilmente accessibili, richiedono poca manutenzione, mancano di un sistema immunitario completamente funzionale e possono svilupparsi normalmente dopo aver aperto il guscio d'uovo^23,24,25,26. È stato dimostrato che il trapianto di organoidi sulla loro membrana corioallantoica (CAM) porta alla vascolarizzazione²⁷. Tuttavia, la durata del trapianto sulla CAM, così come il livello di maturazione dell'innesto, sono limitati dalla formazione della CAM, che richiede fino al giorno 7 embrionale per essere completata. Pertanto, è stato recentemente sviluppato un metodo per vascolarizzare e maturare in modo efficiente gli organoidi renali attraverso il trapianto tracciatomico in embrioni di pollo²⁸. La cavità celomica degli embrioni di pollo è nota dal 1930 per essere un ambiente favorevole per la differenziazione dei tessuti embrionali^29,30. È possibile accedervi all'inizio dello sviluppo embrionale e consente un'espansione relativamente illimitata dell'innesto in tutte le direzioni.

Questo documento delinea un protocollo per il trapianto di organoidi renali derivati da hiPSC nella cavità celomica di embrioni di pollo del giorno 4. Questo metodo induce la vascolarizzazione e una maggiore maturazione degli organoidi entro 8 giorni. L'iniezione di lente fluorescente culinaris agglutinina (LCA) prima di sacrificare gli embrioni consente la visualizzazione dei vasi sanguigni perfusi all'interno degli organoidi attraverso la microscopia confocale.

Protocollo

In conformità con la legge olandese, l'approvazione da parte del comitato per il benessere degli animali non era richiesta per questa ricerca.

1. Preparazione di organoidi renali derivati da hiPSC per il trapianto

1. Differenziare le hiPSCs dagli organoidi renali usando il protocollo sviluppato da Takasato et al.4,18,31. Coltura degli organoidi seguendo questo protocollo su inserti di coltura cellulare in poliestere con pori da 0,4 μm (inserti di coltura cellulare) fino al giorno 7 + 12 di differenziazione. Ogni inserto di coltura cellulare conterrà tre organoidi.
2. Rimuovere gli organoidi dall'inserto della coltura cellulare.
   1. Fai un buco nel mezzo della membrana dell'inserto di coltura cellulare con un paio di pinze da dissezione. Usando le forbici da dissezione, effettuare tre tagli nella membrana dal foro nel mezzo fino al bordo dell'inserto della coltura cellulare, tagliando tra gli organoidi. Ciò si tradurrà in tre pezzi di membrana, ciascuno con un organoide attaccato, che sono ancora collegati all'inserto della coltura cellulare sul loro bordo esterno.
   2. Afferrare uno dei pezzi di membrana vicino al suo bordo esterno con un paio di pinze e strapparlo dall'inserto di coltura cellulare. Posizionare il pezzo di membrana con l'organoide attaccato in una capsula di Petri. Aggiungere alcune gocce di soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco (DPBS) senza calcio e magnesio (DPBS-^/-) all'organoide per evitare la disidratazione. Ripetere l'operazione per gli altri due organoidi.
3. Dividere in due gli organoidi tenendo la loro membrana in posizione con una pinza e tagliandoli a metà con una lama di rasoio in acciaio inossidabile a doppio taglio (un organoide intero è troppo grande perché il celom possa ospitare in questa fase di sviluppo). Spingere delicatamente le due metà organoidi fuori dalla membrana con un dissettore di dura. Eliminare la membrana e lasciare gli organoidi in DPBS-^/- fino al trapianto.
   NOTA: Preparare un massimo di tre organoidi alla volta per il trapianto per evitare stress agli organoidi prima del trapianto. Idealmente, una persona prepara gli organoidi mentre un'altra esegue il trapianto.

2. Preparare embrioni di pollo per il trapianto

1. Incubare uova di livorno bianche fecondate. Inizia l'incubazione delle uova sul differenziamento organoide renale giorno 7 + 8 per garantire la corretta tempistica del trapianto.
   1. Disporre orizzontalmente le uova fecondate di livorno bianco (Gallus domesticus) su un supporto (figura 1A; giorno 0), segnando il centro del lato rivolto verso l'alto con una matita.
      NOTA: I supporti in plastica su misura o i cartoni delle uova possono essere utilizzati come supporti per incubare le uova.
   2. Porre il supporto con le uova in un'incubatrice umidificata a 38 ± 1 ºC (Figura 1A; giorno 0).
   3. Incubare le uova per 3 giorni, mantenendo il bacino d'acqua nell'incubatrice pieno.
2. Crea una finestra nel guscio d'uovo il giorno 3 dell'incubazione.
   1. Il giorno 3 dell'incubazione, posizionare un piccolo pezzo (~ 1 cm x 0,5 cm) di nastro trasparente sulla punta appuntita dell'uovo (estremità piccola). Fai un piccolo foro nel guscio d'uovo nel mezzo del nastro trasparente picchiettandolo con l'estremità affilata di un paio di forbici da dissezione.
   2. Inserire un ago da 19 G su una siringa da 5 ml nel foro con un angolo di 45°, evitando danni al sacco vitellino, e aspirare 2-3 ml di albume dall'uovo per abbassare l'embrione all'interno dell'uovo. Sigillare il foro con un secondo pezzo (~1 cm x 0,5 cm) di nastro trasparente.
   3. Posizionare un pezzo grande (~ 5 cm x 5 cm) di nastro trasparente sul lato dell'uovo contrassegnato dalla matita e rivolto verso l'alto. Fai un buco nel guscio d'uovo al centro del nastro trasparente picchiettandolo con l'estremità affilata di un paio di forbici da dissezione (Figura 1A; giorno 3).
   4. Partendo da questo foro, tagliare una piccola finestra circolare nel guscio d'uovo usando forbici da dissezione curve. Guardare attraverso questa finestra per individuare l'embrione, quindi ingrandire la finestra per ottimizzare l'accesso all'embrione (Figura 1A; giorno 3).
   5. Rimuovere eventuali pezzi grandi di guscio d'uovo che potrebbero essere caduti sopra l'embrione usando una pinza. Rimuovere i pezzi più piccoli posizionando alcune gocce di DPBS con calcio e magnesio (DPBS+/+) sull'embrione con una pipetta di trasferimento di plastica, quindi aspirando il DPBS^+/+ con il guscio d'uovo nella pipetta.
   6. Aggiungere tre gocce di DPBS +/+ integrate con 0,5% di penicillina ^/ streptomicina all'uovo usando una pipetta di trasferimento di plastica.
   7. Sigillare accuratamente la finestra con un pezzo grande (~ 5 cm x 5 cm) di nastro trasparente prima di riporre l'uovo nell'incubatrice fino al giorno 4 dell'incubazione, quando l'embrione è nella fase di Hamburger-Hamilton 23-24 (HH 23-24) ³².
      NOTA: Sigillare la finestra è molto importante per evitare la disidratazione e la morte dell'embrione.
   8. Controllare quotidianamente la vitalità degli embrioni guardandoli attraverso il nastro (non rimuovere il nastro per evitare la disidratazione). Durante questi primi giorni di incubazione, il colore del tuorlo d'uovo cambia da giallo brillante a giallo opaco alla morte dell'embrione. Scartare gli embrioni deceduti.
   9. Tenere il bacino d'acqua nell'incubatore pieno.

3. Trapianto di intracelomic il giorno 4 di incubazione

1. Ottenere l'accesso alla cavità celomica
   1. Tagliare il nastro dalla finestra con forbici da dissezione curve.
   2. Metti l'uovo sotto un microscopio da dissezione su un supporto di gomma o un cartone per uova.
   3. L'embrione di pollo è ora in HH 23-24 e giace sul lato sinistro, con il lato destro rivolto verso lo spettatore (Figura 1A; giorno 4). Individua l'ala destra e la gemma della gamba dell'embrione, poiché il celom sarà accessibile tra questi due germogli degli arti. Nell'area tra l'ala destra e la gemma della gamba, crea un'apertura consecutiva nella membrana vitellina, nel corion e nell'amnione, tenendoli con due paia di pinze da dissezione e tirandoli delicatamente in direzioni opposte.
      NOTA: La membrana vitellina è la prima membrana che si incontra dopo l'apertura dell'uovo e, in alcuni casi, è già danneggiata dopo aver fatto la finestra il giorno 3. Se l'embrione è ruotato, giace sul lato destro con il lato sinistro rivolto verso lo spettatore (Figura 1A; giorno 4), è necessario girarlo per consentire il trapianto. Per fare questo, fare una grande apertura nella membrana vitellina e corion, quindi ruotare attentamente l'embrione usando una pinza.
   4. Controlla se c'è un accesso libero alla cavità celomica: afferra delicatamente il bordo della parete del corpo tra l'ala e la gemma dell'arto con un paio di pinze da dissezione e tiralo leggermente verso l'osservatore. La cavità celomica deve essere chiaramente visibile. Inserire con cautela uno strumento smussato ma sottile (ad esempio, un filo di tungsteno smussato in un supporto per microbisturi) nella cavità celomica.
      NOTA: Se l'inserimento dello strumento contundente nella cavità celomica non è possibile, significa che una o più membrane non sono state aperte correttamente.
2. Trapianto
   1. Posizionare mezzo organoide all'interno dell'uovo sopra l'allantoide usando un dissettore di dura.
   2. Usando una pinza da dissezione, afferrare con attenzione il bordo della parete del corpo e tirarlo leggermente verso l'osservatore per rendere visibile l'apertura verso il celom.
      NOTA: Evitare di danneggiare i vasi sanguigni nella parete del corpo.
   3. Spostare delicatamente l'organoide verso e attraverso l'apertura nella parete del corpo nel celom con un filo di tungsteno smussato in un supporto per microbisturi. Spingere leggermente l'organoide cranialmente per alloggiarlo all'interno del celom. Ora è visibile appena dietro la gemma alare (Figura 1A; giorno 4).
   4. Aggiungere tre gocce di DPBS^+/+ all'uovo utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica.
   5. Sigillare accuratamente la finestra con un pezzo grande (~ 5 cm x 5 cm) di nastro trasparente prima di riporre l'uovo nell'incubatrice fino al giorno 12 dell'incubazione (8 giorni dopo il trapianto).
   6. Continua a controllare quotidianamente gli embrioni per la vitalità guardandoli attraverso il nastro (non rimuovere il nastro per evitare la disidratazione). Scartare gli embrioni deceduti.
      NOTA: Man mano che gli embrioni e le loro membrane corioallantoiche crescono, diventano più chiaramente visibili attraverso il nastro. Una mancanza di movimento da parte dell'embrione e vasi sanguigni collassati o radi sono un segno di morte dell'embrione.
   7. Controlla quotidianamente il bacino dell'acqua nell'incubatore e tienilo pieno.

4. Iniezione di lectina marcata con fluorescenza

1. Preparazione per l'iniezione
   1. Realizzare aghi per microiniezione di vetro tirando microcapillari di vetro in un estrattore di micropipette con le seguenti impostazioni: Calore 533, Tiro 60, Velocità 150, Tempo 200. Mentre si guarda attraverso il microscopio da dissezione, rompere con cura le punte degli aghi di microiniezione usando una pinza da dissezione per creare un'apertura.
      NOTA: le impostazioni richieste per l'estrattore di micropipette possono variare a seconda della macchina.
   2. Assemblare il sistema di iniezione. Prendi due pezzi di tubo di silicone da 38 cm e collegali tra loro posizionando un filtro da 0,2 μm tra di loro. Inserire un boccaglio all'estremità del tubo collegato all'uscita del filtro (tubo di silicone 1) e un connettore all'estremità del tubo collegato all'ingresso del filtro (tubo di silicone 2). Infine, inserire l'ago per microiniezione nel connettore (Figura 1B).
   3. Diluire lente fluorescente culinaria agglutinina (LCA) con DPBS-^/ - ad una concentrazione di 2,5 mg ^mL-1 in un tubo da 0,5 mL e centrifugare verso il basso per ~30 s in una microcentrifuga per spostare gli aggregati sul fondo del tubo.
   4. Pipettare 20 μL di LCA su un pezzo di parafilm.
   5. Aspirare i 20 μL di LCA dal parafilm nell'ago microcapillare del sistema di iniezione assemblato.
2. Iniezione
   1. Tagliare il nastro dalla finestra con forbici da dissezione curve. Metti l'uovo sotto un microscopio da dissezione in un supporto di gomma.
   2. Valutare la vascolarizzazione e individuare le vene, che possono essere distinte dalle arterie per il loro colore rosso leggermente più brillante (Figura 1A; giorno 12). Per migliorare l'accesso alla vascolarizzazione, allargare con cura la finestra tagliando con forbici da dissezione curve. Selezionare una vena per iniezione in base all'accessibilità e alle dimensioni.
   3. Inserire la punta dell'ago microcapillare nella vena selezionata con un angolo di 0°-20º. Assicurarsi che l'ago sia nella vena spostando delicatamente la punta da un lato all'altro. Soffiare delicatamente e costantemente nel sistema di iniezione per iniettare l'LCA (Figura 1A; giorno 12).
      NOTA: Se l'ago nella vena è nella posizione corretta, dovrebbe rimanere entro i confini della vena.
   4. Rimettere l'uovo nell'incubatrice per 10 minuti per far circolare la LCA.
      NOTA: Non è necessario sigillare l'uovo con del nastro adesivo durante questo periodo.

5. Raccolta di organoidi trapiantati il giorno 12 di incubazione

1. Sacrificare l'embrione di pollo
   1. Metti l'uovo in un supporto di gomma sul banco. Tagliare il nastro dalla finestra con forbici da dissezione curve. Quindi, tagliare le membrane che circondano l'embrione con forbici da dissezione curve.
      NOTA: per questo passaggio non è necessario un microscopio da dissezione.
   2. Raccogliere l'embrione dall'uovo con un cucchiaio perforato e decapitare immediatamente l'embrione usando le forbici. Metti il corpo dell'embrione in una capsula di Petri al microscopio a dissezione.
2. Localizzazione e raccolta di organoidi
   1. Metti l'embrione sulla schiena nella capsula di Petri e allarga le sue membra.
   2. Aprire con attenzione la parete addominale dell'embrione lungo l'asse longitudinale usando una pinza.
   3. Individuare l'organoide all'interno dell'embrione. L'organoide si attacca più frequentemente al lobo del fegato destro, sia sulla punta caudale che cranialmente appena sotto la gabbia toracica (Figura 1A; giorno 12). Si consiglia quindi di iniziare guardando in questi luoghi.
   4. Una volta individuato l'organoide, rimuoverlo dall'embrione tagliandolo intorno con micro forbici. Metti l'organoide e il tessuto di pollo che è inevitabilmente attaccato ad esso in una piastra di Petri sotto il microscopio da dissezione. Rimuovere quanto più tessuto di pollo possibile con una lama di rasoio in acciaio inossidabile a doppio taglio.
   5. Elaborare l'organoide in base all'analisi desiderata.

6. Colorazione a immunofluorescenza a montaggio intero

1. Porre un organoide trapiantato in una piastra a 24 pozzetti e fissare 500 μL di paraformaldeide (PFA) al 4% a 4 °C per 24 ore. Lavare 3 volte con DPBS-^/-.
2. Permeabilizzare e bloccare l'organoide in 300 μL di soluzione bloccante (0,3% Triton-X in DPBS-^/- contenente il 10% di siero d'asino) per 2 ore a temperatura ambiente.
3. Preparare la miscela di anticorpi primari: per un organoide, diluire gli anticorpi primari NPHS1 (pecora-α-umana, diluizione di 1:100), CD31 (topo-α-umano, diluizione di 1:100) e LTL (coniugato con biotina, diluizione di 1:300) in 300 μL di soluzione bloccante. Aggiungere la miscela di anticorpi all'organoide e incubare per 72 ore a 4 °C.
4. Lavare 3 volte con TritonX allo 0,3% in DPBS-^/-.
5. Preparare la miscela di anticorpi secondari: per un organoide, diluire gli anticorpi secondari asino-α-pecora Alexa Fluor 647 (diluizione di 1:500), Alexa Fluor 488 α topo d'asino (diluizione di 1:500) e streptavidina Alexa Fluor 405 (diluizione di 1:200) in 300 μL di soluzione bloccante. Aggiungere la miscela di anticorpi secondari all'organoide e incubare per 2-4 ore a temperatura ambiente. Coprire con un foglio di alluminio per evitare l'esposizione degli anticorpi secondari alla luce.
6. Lavare 3 volte con DPBS-^/-.
7. Incorporare l'organoide in ~ 30 μL di mezzo di montaggio in un piatto inferiore di vetro da 35 mm e lasciare asciugare per una notte a temperatura ambiente, coperto con un foglio di alluminio. Conservare a 4 °C.
8. Immagine con un microscopio confocale.

Risultati

Il metodo e la tempistica per la differenziazione delle hiPSC in organoidi renali, l'incubazione di uova di gallina fecondate, il trapianto di organoidi renali, l'iniezione di LCA e la raccolta degli organoidi sono riassunti nella Figura 1A. È importante coordinare i tempi della differenziazione organoide e dell'incubazione dell'uovo di gallina, iniziando la differenziazione 15 giorni prima dell'incubazione. Le azioni nei giorni 0, 3, 4 e 12 dell'incubazione sono illustrate da fotografie s...

Discussione

In questo manoscritto viene dimostrato un protocollo per il trapianto tracciatomico di organoidi renali derivati da hiPSC in embrioni di pollo. Dopo il trapianto, gli organoidi vengono vascolarizzati da vasi sanguigni perfusi che consistono in una combinazione di EC derivate da organoidi umani e derivate dal pollo. Questi si diffondono in tutto l'organoide e invadono le strutture glomerulari, consentendo l'interazione tra EC e podociti. In precedenza è stato dimostrato che ciò porta a una maggiore maturazione delle str...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm	Whatman	10462200
35 mm glass bottom dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes	Sigma-Aldrich	A5177-5EA	Contains silicone tubes, mouth piece and connector
Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope	Leica	TCS SP8
Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips	Hammacher Karl	HAMMHTC091-10
Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips	Hammacher Karl	HAMMHTC090-11
Dissecting microscope	Wild Heerbrugg	355110
Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp	Hammacher Karl	HAMMHSB391-10
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663
Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-212-02	dilution 1:500
Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647	ThermoFisher Scientific	A-21448	dilution 1:500
Double edged stainless steel razor blades	Electron Microsopy Sciences	72000
DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-)	ThermoFisher Scientific	14040133
DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+)	ThermoFisher Scientific	14190094
Egg cartons or custom made egg holders	NA	NA
Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus)	Drost Loosdrecht B.V.	NA
Incubator	Elbanton BV	ET-3 combi
Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated	Vector Laboratories	B-1325	dilution 1:300
Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm	Hammacher Karl	HAMMHSB500-09
Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament	World Precision Instruments	TW150F-3
Micropipette puller	Sutter Instrument Company	Model P-97	We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200
Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws.	Euronexia	L-120
Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher Scientific	P36930
Olivecrona dura dissector 18 cm	Reda	41146-18
Parafilm	Heathrow Scientific	HS234526B
Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL	ThermoFisher Scientific	15070063
Perforated spoon	Euronexia	S-20-P
Petri dish 60 x 15 mm	CELLSTAR	628160
Plastic transfer pipettes	ThermoFisher Scientific	PP89SB
Purified mouse anti-human CD31 antibody	BD Biosciences	555444	dilution 1:100
Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA)	Vector Laboratories	RL-1042	This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5)
Sheep anti-human NPHS1 antibody	R&D systems	AF4269	dilution 1:100
Sterile hypodermic needles, 19 G	BD microlance	301500
Streptavidin Alexa Fluor 405	ThermoFisher Scientific	S32351	dilution 1:200
Syringe 5 mL	BD Emerald	307731
Transparent tape	Tesa	4124	Available at most hardware stores
Triton X	Sigma-Aldrich	T9284
Tungsten wire, 0.25 mm dia	ThermoFisher Scientific	010404.H2