Tavuk Embriyolarında İntralomik Transplantasyon Yoluyla Böbrek Organoidlerinin Etkin Vaskülarizasyonu

Özet

Burada, tavuk embriyolarının selomik boşluğunda böbrek organoidlerinin transplantasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, 8 gün içinde organoidlerin vaskülarizasyonunu ve gelişmiş olgunlaşmasını indükler ve bu süreçleri verimli bir şekilde incelemek için kullanılabilir.

Özet

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden elde edilen böbrek organoidleri, yetişkin böbrektekine belirli bir dereceye kadar benzeyen nefron benzeri yapılar içerir. Ne yazık ki, klinik uygulanabilirlikleri fonksiyonel bir vaskülatür eksikliği ve sonuç olarak in vitro olgunlaşmanın sınırlı olması nedeniyle engellenmektedir. Tavuk embriyolarının selomik boşluğundaki böbrek organoidlerinin transplantasyonu, glomerüler kılcal damarların oluşumu da dahil olmak üzere perfüze edilmiş kan damarları tarafından vaskülarizasyonu indükler ve olgunlaşmalarını arttırır. Bu teknik çok etkilidir ve çok sayıda organoidin transplantasyonuna ve analizine izin verir. Bu yazıda, tavuk embriyolarında böbrek organoidlerinin intrasemik transplantasyonu için ayrıntılı bir protokol, ardından perfüze edilen vaskülatürü boyamak için floresan olarak etiketlenmiş lektin enjeksiyonu ve görüntüleme analizi için nakledilen organoidlerin toplanması açıklanmaktadır. Bu yöntem, in vitro olarak bu süreçleri geliştirmek ve hastalık modellemesini geliştirmek için ipuçları bulmak üzere organoid vaskülarizasyon ve olgunlaşmayı indüklemek ve incelemek için kullanılabilir.

Giriş

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) kaynaklı böbrek organoidlerinin gelişimsel çalışmalar^için potansiyele sahip olduğu gösterilmiştir 1,2,3,4, toksisite taraması ^5,6 ve hastalık modelleme 5,7,8,9,10,11,12,13 . Bununla birlikte, bunlar ve nihai klinik transplantasyon amaçları için uygulanabilirlikleri, vasküler bir ağın olmaması nedeniyle sınırlıdır. Embriyonik böbrek gelişimi sırasında, podositler, mezangial hücreler ve vasküler endotel hücreleri (ECs), glomerulusun karmaşık yapısını oluşturmak için etkileşime girer. Bu etkileşim olmadan, podositler, glomerüler bazal membran (GBM) ve ECs'den oluşan glomerüler filtrasyon bariyeri düzgün bir şekilde gelişemez^14,15,16. İn vitro böbrek organoidleri bazı EC'ler içermesine rağmen, bunlar uygun bir vasküler ağ oluşturamaz ve zamanla azalır¹⁷. Bu nedenle organoidlerin olgunlaşmamış kalması şaşırtıcı değildir. Farelerde transplantasyon, böbrek organoidlerinin vaskülarizasyonunu ve olgunlaşmasını indükler 18,19,20,21. Ne yazık ki, bu, çok sayıda organoidin analizi için uygun olmayan emek yoğun bir süreçtir.

Tavuk embriyoları, bir yüzyıldan fazla bir süredir vaskülarizasyon ve gelişimi incelemek için kullanılmıştır²². Kolayca erişilebilirler, düşük bakım gerektirirler, tamamen işlevsel bir bağışıklık sisteminden yoksundurlar ve yumurta kabuğunu açtıktan sonra normal olarak gelişebilirler^23,24,25,26. Organoidlerin koryoallantoik membran (CAM) transplantasyonunun vaskülarizasyona yol açtığı gösterilmiştir²⁷. Bununla birlikte, CAM üzerindeki transplantasyon süresi ve greftin olgunlaşma seviyesi, tamamlanması embriyonik gün 7'ye kadar süren CAM oluşumu ile sınırlıdır. Bu nedenle, son zamanlarda tavuk embriyolarında intrasemik transplantasyon yoluyla böbrek organoidlerini etkili bir şekilde vaskülarize etmek ve olgunlaştırmak için bir yöntem geliştirilmiştir²⁸. Tavuk embriyolarının selomik boşluğunun 1930'lardan beri embriyonik dokuların farklılaşması için elverişli bir ortam olduğu bilinmektedir^29,30. Embriyonik gelişimin erken dönemlerinde erişilebilir ve greftin her yöne nispeten sınırsız genişlemesine izin verir.

Bu yazıda, hiPSC türevi böbrek organoidlerinin 4. gün tavuk embriyolarının selomik boşluğunda transplantasyonu için bir protokol özetlenmiştir. Bu yöntem, 8 gün içinde organoidlerin vaskülarizasyonunu ve gelişmiş olgunlaşmasını indükler. Embriyoları feda etmeden önce floresan etiketli lens culinaris aglutinin (LCA) enjeksiyonu, konfokal mikroskopi ile organoidler içindeki perfüze kan damarlarının görüntülenmesini sağlar.

Protokol

Hollanda yasalarına göre, bu araştırma için hayvan refahı komitesinin onayı gerekli değildi.

1. HiPSC türevi böbrek organoidlerinin transplantasyon için hazırlanması

1. Takasato ve ^ark.4,18,31 tarafından geliştirilen protokolü kullanarak hiPSC'leri böbrek organoidlerine ayırt edin. Polyester hücre kültürü ekleri üzerindeki bu protokolü takip eden organoidlerin kültürlenmesi, farklılaşmanın 7 + 12. gününe kadar 0.4 μm gözenekli (hücre kültürü ekleri). Her hücre kültürü eki üç organoid içerecektir.
2. Organoidleri hücre kültürü ekinden çıkarın.
   1. Hücre kültürü ekinin zarının ortasında, bir çift diseksiyon forseps ile bir delik açın. Diseksiyon makası kullanarak, membranda ortadaki delikten hücre kültürü ekinin kenarına kadar üç kesim yapın ve organoidler arasında kesim yapın. Bu, her biri bir organoid eklenmiş olan ve hala dış kenarlarındaki hücre kültürü ekine bağlı olan üç parça membran ile sonuçlanacaktır.
   2. Dış kenarına yakın membran parçalarından birini bir çift forseps ile tutun ve hücre kültürü ekinden gevşetin. Membran parçasını ekli organoid ile bir Petri kabına yerleştirin. Dehidrasyonu önlemek için organoide kalsiyum ve magnezyum (DPBS-^/-) içermeyen birkaç damla Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ekleyin. Diğer iki organoid için tekrarlayın.
3. Organoidleri, zarlarını forseps ile yerinde tutarak ve çift kenarlı paslanmaz çelik bir tıraş bıçağı ile ikiye bölerek ikiye bölün (bütün bir organoid, celomun gelişimin bu aşamasında uyum sağlaması için çok büyüktür). İki organoid yarıyı bir dura dissektörü ile membrandan yavaşça itin. Zarı atın ve organoidleri transplantasyona kadar DPBS-^/- içinde bırakın.
   NOT: Transplantasyondan önce organoidlere stresi önlemek için transplantasyon için bir seferde en fazla üç organoid hazırlayın. İdeal olarak, bir kişi organoidleri hazırlarken, diğeri nakli gerçekleştirir.

2. Tavuk embriyolarının nakil için hazırlanması

1. Döllenmiş beyaz bacak boynuzu yumurtalarını kuluçkaya yatırın. Transplantasyonun doğru zamanlamasını sağlamak için yumurtaların böbrek organoid farklılaşma günü 7 + 8'de kuluçkalanmasına başlayın.
   1. Döllenmiş beyaz bacak boynuzu yumurtalarını (Gallus domesticus) yatay olarak bir tutucu üzerine yerleştirin (Şekil 1A; gün 0), yukarı bakan tarafın ortasını bir kalemle işaretlemek.
      NOT: Ismarlama plastik tutucular veya yumurta kartonları, yumurtaları kuluçkaya yatırmak için tutucu olarak kullanılabilir.
   2. Tutucuyu yumurtalarla birlikte 38 ± 1 ºC'de nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin (Şekil 1A; gün 0).
   3. Yumurtaları 3 gün boyunca inkübe edin, inkübatördeki su havzasını dolu tutun.
2. Kuluçkanın 3. gününde yumurta kabuğunda bir pencere oluşturun.
   1. Kuluçkanın 3. gününde, yumurtanın sivri ucuna (küçük uç) küçük bir parça (~ 1 cm x 0,5 cm) şeffaf bant yerleştirin. Şeffaf bandın ortasındaki yumurta kabuğunda, bir çift diseksiyon makasın keskin ucuyla dokunarak küçük bir delik açın.
   2. 5 mL'lik bir şırınga üzerine 19 G'lik bir iğneyi 45 ° 'lik bir açıyla deliğe yerleştirin, yumurta sarısı kesesine zarar vermekten kaçının ve yumurtanın içindeki embriyoyu indirmek için yumurtadan 2-3 mL albümin aspire edin. Deliği ikinci bir parça (~ 1 cm x 0,5 cm) şeffaf bantla kapatın.
   3. Yumurtanın kurşun kalemle işaretlenmiş, yukarı bakan tarafına büyük bir parça (~ 5 cm x 5 cm) şeffaf bant yerleştirin. Şeffaf bandın ortasındaki yumurta kabuğunda, bir çift diseksiyon makasının keskin ucuyla dokunarak bir delik açın (Şekil 1A; 3. gün).
   4. Bu delikten başlayarak, kavisli diseksiyon makası kullanarak yumurta kabuğunda küçük bir dairesel pencere kesin. Embriyoyu bulmak için bu pencereden bakın, ardından embriyoya erişimi optimize etmek için pencereyi genişletin (Şekil 1A; 3. gün).
   5. Forseps kullanarak embriyonun üstüne düşmüş olabilecek büyük yumurta kabuğu parçalarını çıkarın. Plastik bir transfer pipeti ile embriyonun üzerine kalsiyum ve magnezyum (DPBS+/+) içeren birkaç damla DPBS damlatarak ve ardından DPBS^+/+'ı yumurta kabuğu ile pipete aspire ederek daha küçük parçaları çıkarın.
   6. Plastik bir transfer pipeti kullanarak yumurtaya% 0.5 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş üç damla DPBS^+/+ ekleyin.
   7. Embriyo Hamburger-Hamilton aşaması 23-24 (HH 23-24)^32'de olduğunda, yumurtayı inkübatörün 4. gününe kadar inkübatöre geri yerleştirmeden önce pencereyi büyük bir parça (~ 5 cm x 5 cm) şeffaf bantla dikkatlice kapatın.
      NOT: Embriyonun dehidrasyonunu ve ölümünü önlemek için pencerenin kapatılması çok önemlidir.
   8. Embriyolara günlük olarak banttan bakarak canlılık açısından kontrol edin (dehidrasyonu önlemek için bandı çıkarmayın). Kuluçkanın bu ilk günlerinde, yumurta sarısı rengi embriyo ölümü üzerine parlaktan mat sarıya dönüşür. Ölen embriyoları atın.
   9. İnkübatördeki su havzasını dolu tutun.

3. İnkübasyonun 4. gününde intrakomomik transplantasyon

1. Çimento boşluğuna erişim kazanma
   1. Kavisli disseksiyon makası ile bandı pencereden kesin.
   2. Yumurtayı bir lastik tutucu veya yumurta kartonu üzerine diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin.
   3. Tavuk embriyosu şu anda HH 23-24 aralığındadır ve sağ tarafı izleyiciye bakacak şekilde sol tarafında yatmaktadır (Şekil 1A; 4. gün). Embriyonun sağ kanadını ve bacak tomurcuğunu bulun, çünkü celom bu iki uzuv tomurcuğu arasında erişilecektir. Sağ kanat ve bacak tomurcuğu arasındaki alanda, vitelin zarında, koryonda ve amniyonda, iki çift diseksiyon forseps ile tutarak ve yavaşça zıt yönlere çekerek ardışık olarak bir açıklık oluşturun.
      NOT: Vitelin membranı, yumurtayı açtıktan sonra karşılaşılan ilk zardır ve bazı durumlarda 3. günde pencereyi yaptıktan sonra zaten hasar görmüştür. Eğer embriyo döndürülmüşse, sol tarafı izleyiciye bakacak şekilde sağ tarafında yatmaktadır (Şekil 1A; 4. gün), transplantasyonu sağlamak için onu tersine çevirmek gerekir. Bunu yapmak için, vitelin ve koryon zarında büyük bir açıklık açın, ardından forseps kullanarak embriyoyu dikkatlice çevirin.
   4. Selomik boşluğa engelsiz erişim olup olmadığını kontrol edin: bir çift diseksiyon forseps ile kanat ve uzuv tomurcuğu arasındaki vücut duvarının kenarını yavaşça tutun ve izleyiciye doğru hafifçe çekin. Çimento boşluğu açıkça görülebilmelidir. Çimento boşluğuna künt ama ince bir alet (örneğin, bir mikroneşter tutucusunda künt bir tungsten teli) dikkatlice yerleştirin.
      NOT: Künt aletin selomik boşluğa sokulması mümkün değilse, bu, membranlardan bir veya daha fazlasının düzgün açılmadığı anlamına gelir.
2. Ekimi
   1. Bir dura dissektörü kullanarak allantozun üzerine yumurtanın içine yarım organoid yerleştirin.
   2. Diseksiyon forsepsleri kullanarak, vücut duvarının kenarını dikkatlice tutun ve celom açıklığını görünür kılmak için izleyiciye doğru hafifçe çekin.
      NOT: Vücut duvarındaki kan damarlarına zarar vermekten kaçının.
   3. Organoidi, vücut duvarındaki açıklığa doğru ve içinden yavaşça bir mikroneşter tutucuda künt bir Tungsten teli ile celom içine doğru hareket ettirin. Organoidi celomun içine yerleştirmek için hafifçe kraniyal olarak itin. Artık kanat tomurcuğunun hemen arkasında görülebilir (Şekil 1A; 4. gün).
   4. Plastik bir transfer pipeti kullanarak yumurtaya üç damla ^DPBS+/+ ekleyin.
   5. Yumurtayı inkübasyonun 12. gününe kadar (transplantasyondan 8 gün sonra) inkübatöre geri yerleştirmeden önce pencereyi büyük bir parça (~ 5 cm x 5 cm) şeffaf bantla dikkatlice kapatın.
   6. Embriyolara banttan bakarak canlılık açısından günlük olarak kontrol etmeye devam edin (dehidrasyonu önlemek için bandı çıkarmayın). Ölen embriyoları atın.
      NOT: Embriyolar ve koryoallantoik zarları büyüdükçe, banttan daha net görünür hale gelirler. Embriyo tarafından hareket eksikliği ve çökmüş veya seyrek kan damarları embriyo ölümünün bir işaretidir.
   7. İnkübatördeki su havzasını günlük olarak kontrol edin ve dolu tutun.

4. Floresan etiketli lektin enjeksiyonu

1. Enjeksiyon için hazırlık
   1. Aşağıdaki ayarlarla bir mikropipet çektirici içinde cam mikro kılcal damarları çekerek cam mikroenjeksiyon iğneleri yapın: Isı 533, Çekme 60, Hız 150, Zaman 200. Diseksiyon mikroskobuna bakarken, bir açıklık oluşturmak için diseksiyon forsepsleri kullanarak mikroenjeksiyon iğnelerinin uçlarını dikkatlice kırın.
      NOT: Mikropipet çektirici için gerekli ayarlar makineye bağlı olarak farklılık gösterebilir.
   2. Enjeksiyon sistemini monte edin. İki parça 38 cm'lik silikon boru alın ve aralarına 0,2 μm'lik bir filtre yerleştirerek birbirine bağlayın. Filtre çıkışına bağlı tüpün ucuna (silikon tüp 1) bir ağızlık ve filtre girişine bağlı tüpün ucuna bir konektör (silikon tüp 2) yerleştirin. Son olarak, mikroenjeksiyon iğnesini konektöre yerleştirin (Şekil 1B).
   3. Floresan olarak etiketlenmiş lens culinaris aglutinin (LCA) ile DPBS-/- ile 0,5 ^mL'lik bir tüpte 2,5 mg ^mL-1 konsantrasyonuna kadar seyreltin ve agregaları tüpün dibine taşımak için bir mikrosantrifüjde ~ 30 s aşağı döndürün.
   4. Bir parça parafilm üzerine 20 μL LCA pipet edin.
   5. 20 μL LCA'yı parafilmden monte edilmiş enjeksiyon sisteminin mikrokapiller iğnesine aspire edin.
2. Enjeksiyon
   1. Kavisli disseksiyon makası ile bandı pencereden kesin. Yumurtayı bir lastik tutucuda diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin.
   2. Vaskülatürü değerlendirin ve arterlerden biraz daha parlak kırmızı renkleriyle ayırt edilebilen damarları bulun (Şekil 1A; 12. gün). Vaskülatüre erişimi iyileştirmek için, kavisli diseksiyon makası ile keserek pencereyi dikkatlice büyütün. Erişilebilirliğe ve boyuta göre enjeksiyon için bir damar seçin.
   3. Mikrokapiler iğnenin ucunu seçilen damara 0°-20º açıyla yerleştirin. Ucu yavaşça bir yandan diğer yana hareket ettirerek iğnenin damarda olduğundan emin olun. LCA'yı enjekte etmek için enjeksiyon sistemine nazikçe ve istikrarlı bir şekilde üfleyin (Şekil 1A; 12. gün).
      NOT: Damar içindeki iğne doğru pozisyonda ise damar sınırları içerisinde kalmalıdır.
   4. LCA'nın dolaşmasına izin vermek için yumurtayı inkübatöre 10 dakika boyunca geri yerleştirin.
      NOT: Bu süre zarfında yumurtanın bantla kapatılması gerekli değildir.

5. İnkübasyonun 12. gününde nakledilen organoidlerin toplanması

1. Tavuk embriyosunu feda etmek
   1. Yumurtayı banktaki lastik bir tutucuya yerleştirin. Kavisli disseksiyon makası ile bandı pencereden kesin. Ardından, embriyoyu çevreleyen zarları kavisli diseksiyon makası ile kesin.
      NOT: Bu adım için diseksiyon mikroskobu gerekli değildir.
   2. Embriyoyu delikli bir kaşıkla yumurtadan çıkarın ve hemen makas kullanarak embriyonun kafasını kesin. Embriyonun vücudunu diseksiyon mikroskobu altında bir Petri kabına yerleştirin.
2. Organoidlerin bulunması ve toplanması
   1. Embriyoyu Petri kabına sırt üstü yerleştirin ve uzuvlarını yayın.
   2. Forseps kullanarak embriyonun karın duvarını uzunlamasına eksen boyunca dikkatlice açın.
   3. Embriyonun içindeki organoidi bulun. Organoid en sık sağ karaciğer lobuna kaudal uçta veya kraniyal olarak göğüs kafesinin hemen altında bağlanır (Şekil 1A; 12. gün). Bu nedenle, bu konumlara bakarak başlamanız önerilir.
   4. Organoid yerleştirildikten sonra, mikro makasla etrafını keserek embriyodan çıkarın. Organoidi ve kaçınılmaz olarak ona bağlı olan tavuk dokusunu, diseksiyon mikroskobunun altındaki bir Petri kabına yerleştirin. Çift kenarlı paslanmaz çelik tıraş bıçağı ile mümkün olduğunca fazla tavuk dokusunu çıkarın.
   5. İstenilen analize bağlı olarak organoidi işleyin.

6. Tam montajlı immünofloresan boyama

1. Nakledilen bir organoidi 24 delikli bir plakaya yerleştirin ve 24 saat boyunca 4 ° C'de 500 μL% 4 paraformaldehit (PFA) içine sabitleyin. DPBS^-/- ile 3 kez yıkayın.
2. Organoidi oda sıcaklığında 2 saat boyunca 300 μL bloke edici çözelti (DPBS-/-% 10 eşek serumu içeren% 0.3 ^Triton-X ) içinde geçirgen hale getirin ve bloke edin.
3. Birincil antikor karışımını hazırlayın: bir organoid için, birincil antikorlar NPHS1 (koyun-α-insan, 1:100 seyreltme), CD31 (fare-α-insan, 1:100 seyreltme) ve LTL (biyotin konjuge edilmiş, 1:300 seyreltme) 300 μL bloke çözeltisi içinde seyreltin. Antikor karışımını organoide ekleyin ve 4 ° C'de 72 saat inkübe edin.
4. DPBS-^/-'de %0,3 TritonX ile 3 kat yıkayın.
5. İkincil antikor karışımını hazırlayın: bir organoid için, ikincil antikorları eşek-α-koyun Alexa Fluor 647 (1:500'ün seyreltilmesi), eşek α fare Alexa Fluor 488'i (1:500'ün seyreltilmesi) ve streptavidin Alexa Fluor 405'i (1:200'ün seyreltilmesi) 300 μL blokaj çözeltisinde seyreltin. İkincil antikor karışımını organoide ekleyin ve oda sıcaklığında 2-4 saat inkübe edin. İkincil antikorların ışığa maruz kalmasını önlemek için alüminyum folyo ile örtün.
6. DPBS^-/- ile 3 kez yıkayın.
7. Organoidi ~ 30 μL montaj ortamına 35 mm'lik bir cam tabanlı bir kaba yerleştirin ve alüminyum folyo ile kaplanmış oda sıcaklığında gece boyunca kurumaya bırakın. 4 °C'de saklayın.
8. Konfokal mikroskop kullanarak görüntü.

Sonuçlar

HiPSC'lerin böbrek organoidlerine farklılaşması, döllenmiş tavuk yumurtasının inkübasyonu, böbrek organoidlerinin transplantasyonu, LCA enjeksiyonu ve organoidlerin toplanması için yöntem ve zaman çizelgesi Şekil 1A'da özetlenmiştir. Organoid farklılaşma ve tavuk yumurtası inkübasyonunun zamanlamasını koordine etmek, inkübasyondan 15 gün önce farklılaşmaya başlamak önemlidir. Kuluçkanın 0, 3, 4 ve 12. günlerindeki eylemler zaman çizelgesinin altındaki foto...

Tartışmalar

Bu yazıda, tavuk embriyolarında hiPSC türevi böbrek organoidlerinin intrasemik transplantasyonu için bir protokol gösterilmiştir. Transplantasyon üzerine, organoidler, insan organoid kaynaklı ve tavuk kaynaklı ECs'nin bir kombinasyonundan oluşan perfüze kan damarları tarafından vaskülarize edilir. Bunlar organoid boyunca yayılır ve glomerüler yapıları istila ederek ECs ve podositler arasında etkileşimi sağlar. Daha önce bunun organoid glomerüler ve tübüler yapıların olgunlaşmasının artmas?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm	Whatman	10462200
35 mm glass bottom dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes	Sigma-Aldrich	A5177-5EA	Contains silicone tubes, mouth piece and connector
Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope	Leica	TCS SP8
Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips	Hammacher Karl	HAMMHTC091-10
Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips	Hammacher Karl	HAMMHTC090-11
Dissecting microscope	Wild Heerbrugg	355110
Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp	Hammacher Karl	HAMMHSB391-10
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663
Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-212-02	dilution 1:500
Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647	ThermoFisher Scientific	A-21448	dilution 1:500
Double edged stainless steel razor blades	Electron Microsopy Sciences	72000
DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-)	ThermoFisher Scientific	14040133
DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+)	ThermoFisher Scientific	14190094
Egg cartons or custom made egg holders	NA	NA
Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus)	Drost Loosdrecht B.V.	NA
Incubator	Elbanton BV	ET-3 combi
Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated	Vector Laboratories	B-1325	dilution 1:300
Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm	Hammacher Karl	HAMMHSB500-09
Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament	World Precision Instruments	TW150F-3
Micropipette puller	Sutter Instrument Company	Model P-97	We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200
Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws.	Euronexia	L-120
Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher Scientific	P36930
Olivecrona dura dissector 18 cm	Reda	41146-18
Parafilm	Heathrow Scientific	HS234526B
Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL	ThermoFisher Scientific	15070063
Perforated spoon	Euronexia	S-20-P
Petri dish 60 x 15 mm	CELLSTAR	628160
Plastic transfer pipettes	ThermoFisher Scientific	PP89SB
Purified mouse anti-human CD31 antibody	BD Biosciences	555444	dilution 1:100
Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA)	Vector Laboratories	RL-1042	This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5)
Sheep anti-human NPHS1 antibody	R&D systems	AF4269	dilution 1:100
Sterile hypodermic needles, 19 G	BD microlance	301500
Streptavidin Alexa Fluor 405	ThermoFisher Scientific	S32351	dilution 1:200
Syringe 5 mL	BD Emerald	307731
Transparent tape	Tesa	4124	Available at most hardware stores
Triton X	Sigma-Aldrich	T9284
Tungsten wire, 0.25 mm dia	ThermoFisher Scientific	010404.H2