Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ניתן לחקור ביו-אנרגטיקה של תאי CD8 T באמצעות מבחן מאמץ מיטו. ניתן להשתמש במתודולוגיה זו כדי לחקור תכנות מטבולי אקוטי וכרוני. פרוטוקול זה מתאר גישות לבחינת הקשרים בין ביולוגיה של קולטני תאי T לניתוח ביו-אנרגטי.

Abstract

הבנת האופן שבו אימונומטבוליזם משפיע על התפקוד, ההתמיינות והגורל של לימפוציטים זכתה לעניין ותשומת לב משמעותיים. ביולוגיה של לימפוציטים נחקרה באמצעות ניתוח ביו-אנרגטי והפכה כעת לכלי בעל חשיבות קריטית בתחום. לפיכך, ביקשנו לייעל מבחן ניתוח ביו-אנרגטי שניתן להתאים עם טיפולים מקדימים והזרקה חריפה לגירוי קולטנים. כאן, הערכנו את חילוף החומרים של תאי CD8 T ex vivo באמצעות מבחן המתח של Cell Mito כדי להעריך את שיעורי צריכת החמצן והחמצה חוץ-תאית בתאי CD8 T נאיביים ואפקטיביים. תאי CD8 T אפקטורים ספציפיים לאנטיגן הופקו באמצעות גירוי ex vivo , ותאי CD8 T נאיביים שנקטפו מטחול ובודדו עם הפרדת עמוד חרוזים מגנטי.

טיפולים מקדימים מבוצעים במיקרו-פלטות ואנו מפרטים כיצד להכין מחסניות חיישנים. אנו מראים כיצד ניתן להעמיס יציאות הזרקה בתרופות למדידה עקיפה של יכולות מטבוליות ועם מודולטורים מטבוליים, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לחקור פעילות אנזימים ספציפית. ניתן לחקור גירויים של קולטני תאי T בזמן אמת עם הזרקה וגירוי חריפים עם אנטי-CD3/CD28 באמצעות יציאות ההזרקה. מנתחי מכשירים משמשים למדידות ואיסוף נתונים והדמיית נתונים נעשית עם תוכנות לפירוש חילוף החומרים התאי. אסטרטגיה זו מייצרת כמות נרחבת של נתונים על ביולוגיה של תאי חיסון וביו-אנרגטיקה מיטוכונדריאלית המאפשרת לחוקרים להתאים אישית את הפרוטוקול בדרכים רבות כדי לחקור את חילוף החומרים של תאי CD8 T.

Introduction

גורלם ותפקודם של תאי מערכת החיסון מושפעים באופן משמעותי מחילוף החומרים, צריכת חמצון ונשימה אנאירובית 1,2,3,4. לאחרונה, יש עניין גובר בהתמקדות באפנון מטבולי כאסטרטגיה לתכנת מחדש או להחיות מחדש את גורל תאי CD8 T ותפקוד האפקטור ולשפר את פינוי הנגיף או לשפר את החסינות האנדוגנית נגד גידולים 5,6,7,8,9. יש לציין כי איתות קולטני אנטיגן דרך קולטן תאי T (TCR) הוא דרישת מפתח עבור התמיינות תאי CD8 T וכתוצאה מכך איתות והפעלה במורד הזרם 10,11,12 (איור 1). חשיפה ממושכת לעלבונות אימונולוגיים גורמת לגירוי מתמשך ספציפי לאנטיגן ב-TCR שמוביל בסופו של דבר למצבים דלקתיים כרוניים, עייפות תאי T, עיצוב מחדש של המיקרו-סביבה החיסונית ובריחה חיסונית 11,13,14,15,16,17,18,19.

חילוף החומרים של תאי CD8 T מותשים שונה באופן מהותי מזה של תאי CD8 T אפקטורים פונקציונליים 2,3,14,15,18,20. התמיינות תאי T, הפרשת γ אינטרפרון (IFNγ) ויכולת ההיזכרות נקבעים, בחלקם, על ידי תפקוד המיטוכונדריה ותוצרי פירוק חמצון β. תאי IFNγ+ CD8 T הם מרכיבים קריטיים של תגובות חיסוניות אנטי-גידוליות ואנטי-ויראליות 21,22,23. שטף מטבולי ספציפי באמצעות גליקוליזה ושרשרת הובלת האלקטרונים חשוב להפעלת תאי CD8 T, הפרשת ציטוקינים ותגובות זיכרון 4,11,13,15,18,24,25,26,27,28 . תגובות אופטימליות, כולל הפעלת תאי T והתמיינות אפקטור, דורשות תגובה מיטוכונדריאלית מתואמת וספציפית, בעוד שפגמים במיטוכונדריה ומיני חמצן תגובתיים מוגזמים (ROS) מאפיינים תאי T מותשים או לא מתפקדים 9,29. לאחרונה, גירוי TCR מתמשך של תאי CD8 T במבחנה מקדם התמיינות ממצה של תאי CD8 T בין השאר על ידי השראת עקה חמצונית ותכנות מחדש של חילוף החומרים החמצוני והיכולות המטבוליות הנדרשות לשגשוג תאי T 1,2,13,20,24,29. בסך הכל, צירי בקרה מטבוליים הם מרכיבים קריטיים בהכוונת התמיינות תאי CD8 T והתקדמותם לפנוטיפים אפקטור, זיכרון או מותשים/לא מתפקדים.

תרכובות מטבוליות גם מכוונות את תגובות תאי החיסון על ידי תפקוד כמולקולות איתות אוטוקריניות או פרקריניות 9,30,31,32,33,34,35. ספינגוזין-1-פוספט (S1P) וחומצה ליזופוספטית (LPA) הם ליפידים ביו-אקטיביים ודלקתיים המאותתים באמצעות קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) כדי לווסת את יציאת הלימפוציטים והציטוטוקסיות על ידי תאי CD8 T36. איתות LPA באמצעות קולטני LPA GPCR על תאי CD8 T מתכנת מחדש את חילוף החומרים כדי להגביר ליפוליזה, חמצון חומצות שומן ודליפת פרוטונים9. בסך הכל, הביו-אנרגטיקה וחילוף החומרים של תאי CD8 T מונעים במידה רבה על ידי זמינות המצע, רמזים סביבתיים ודרישות אנרגטיות.

מתודולוגיות לחקירת חילוף החומרים של תאי CD8 T הפכו לחשובות יותר ויותר. מבחן המתח של Cell Mito מספק הערכה מקיפה של ביו-אנרגטיקה ומוכר כיום כטכניקה סימן היכר בתחום האימונומטבוליזם ואנרגטיקת תאי CD8 T 9,37. תאים דבקים שימשו היסטורית לבדיקת מבחן מאמץ מיטו38; עם זאת, יש עניין הולך וגובר ביישום פרוטוקול זה עבור תאים הגדלים בתרחיף ובמיוחד שימוש בתאי חיסון לבדיקת מבחן המתח של Cell Mito. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט למדידת הפעילות המטבולית של תאי CD8 T בהתבסס על הפרסום האחרון שלנו9. אנו מספקים הסבר מפורט על התרחבות תאי CD8 T, בידוד תאי CD8 T נאיבי, הכנת בדיקה וטיפול בפרוטוקולים הן לטיפולים מקדימים והן לזריקות חריפות במבחן המאמץ של Cell Mito. חשוב לציין, אנו משווים ומשווים שיטות מרובות לגירוי TCR והפעלת תאי CD8 T, כולל גירוי TCR רב-שבטי וספציפי לאנטיגן.

פרוטוקול זה מפרט גירוי ספציפי לאנטיגן באמצעות עכברים טרנסגניים OT-I (מודל עכבר טרנסגני קלאסי) שעבורו כל תאי ה-T של העכבר מבטאים את אותם גנים Vα2 ו-Vβ5 39. תאי CD8 T של עכבר OT-I מכילים כולם את אותו TCR שהוא ספציפי כנגד אוקטפפטיד אובאלבומין (OVA257-264 נכתב גם כרצף חומצות האמינו SIINFEKL או N4, אפיטופ שנחקר באופן נרחב שעם הצגתו על ידי קומפלקס תאימות היסטולוגית עיקרי (MHC) Class I, מפעיל תאי CD8 T ציטוטוקסיים39 (איור 1A). בסך הכל, מודל העכבר הטרנסגני OT-I נמצא בשימוש נרחב על ידי אימונולוגים לחקר איתות TCR ותפקוד אפקטור תאי T ספציפיים לאנטיגן. בניגוד להפעלה חד-שבטית עם מודל העכבר OT-I, תאי CD8 T רב-שבטיים עשויים להיווצר עם נוגדנים אנטי-CD3/CD28 כנגד תת-יחידות TCR CD3 ומולקולת CD2840 (איור 1B). נוגדנים נגד CD3/CD28 עוקפים את המרכיב הספציפי לאנטיגן של איתות TCR כדי להפעיל אוכלוסייה רב-שבטית של תאי T40. בסופו של דבר, התוצאות המתוארות בדוח זה משוות שיטות מרובות לשימוש במבחן המתח של מיטו התא כדי לכמת שטף מטבולי דינמי בתאי CD8 T.

Protocol

עכברים הוחזקו בסביבה נטולת פתוגנים ונשמרו על פי התקנים והתקנות של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים.

1. יצירה והרחבה של תאי CD8 T באמצעות גירוי ספציפי לאנטיגן

  1. ביום הראשון, קוטפים טחול שמקורו בעכברי OT-I; לאחר מכן, הכינו והפעילו אותם במבחנה עם פפטיד SIINFEKL (4).
    1. נקה את חלל מכסה המנוע, הכין ריאגנטים ואסוף את מדיום העכבר. מחממים את אמצעי העכבר בחממת מים או חרוזים.
      1. בצלחת של 6 בארות, הכניסו 7 מ"ל של מדיום עכבר לבאר אחת ואז עוד 3 מ"ל של מדיום עכבר לבאר אחרת. לאחר מכן, הכנס מסננת לבאר המכילה 7 מ"ל מדיה.
    2. הכניסו עכבר למעבדה מהוויווריום בכלוב העברה. העבר את העכבר לכלוב חדש ריק ומקם את מתאם CO2 בחלק העליון. המתת חסד של העכבר עם CO2 עד לרמת זרימה של 2.75.
      1. התבונן היטב בעכבר ושים לב לכל סימני מצוקה. לאחר הנשימה האחרונה, שימו לב לסימני נשימה וחיים למשך דקה אחת לפחות. כבה את ה-CO2 ובצע פריקת צוואר הרחם כשיטה המשנית להמתת חסד. לאחר מכן, נקה את הספסל, הכלוב ושאר אזור העבודה ונשא את העכבר אל מכסה המנוע.
    3. נתח את הטחול מהעכבר.
      1. השתמש ב-70% אתנול כדי לעקר את ציוד החיתוך ולהניח את הצד השמאלי של העכבר כלפי מטה, לרסס את הצד השמאלי של העכבר כדי לחטא.
      2. בעזרת מכשירים נקיים, מנתחים כדי להסיר את העור ולזהות את הצפק. בצע חתך קטן דרך הצפק כדי למצוא את הטחול ואז כרת את הטחול. שים את הטחול בצלחת 6 בארות על גבי המסננת.
      3. נקו את האזור, הכניסו את פגר העכבר לשקית סילוק ואז הכניסו את השקית למקפיא לסילוק.
      4. ודא שהאזור כולו נקי והעבר את צלחת 6 הבארות לתוך מכסה המנוע לתרבית הרקמות לשלבים הבאים.
    4. במכסה המנוע של תרבית הרקמות, הומוגניזציה של הטחול והשעיה מחדש של התאים לתרחיף של תא בודד ללא גושים.
      1. דחף את הטחול דרך המסננת לבאר עם 7 מ"ל מדיה עם בוכנה של מזרק 5 מ"ל.
      2. שטפו את המסננת וכל רקמה שנותרה באמצעות 3 מ"ל של מדיום בבאר הנוספת.
      3. העבירו את תרחיף התאים עם צינור סרולוגי לצינור חרוטי חדש של 10 מ"ל.
      4. צנטריפוגה למשך 5 דקות בחום של 500 × גרם ושואבים את הסופרנטנט באמצעות פיפט זכוכית.
    5. כדוריות דם אדומות.
      1. התחל את התהליך לליזה של תאי דם אדומים באמצעות 1 מ"ל של מאגר ליזה ACK על ידי השעיית התאים במאגר ליזה ACK ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 1-5 דקות.
        הערה: יש לייעל את זמן הדגירה לאצווה הספציפית של מאגר ליזה ACK כדי להשיג ליזה מקסימלית של תאים אדומים עם מינימום מוות של טחול.
      2. הוסף 10 מ"ל מדיום לצינור החרוטי לנטרול וצנטריפוגה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 500 × גרם.
      3. השעו מחדש את התאים במדיום של 50 מ"ל והעבירו אותם לבקבוק T75.
    6. לעורר את התאים עם פפטיד SIINFEKL (N4).
      1. הביאו את פפטיד SIINFEKL למכסה המנוע של תרבית הרקמה. אחסן את פפטיד SIINFEKL ב-20 מעלות צלזיוס.
      2. הוסף SIINFEKL ישירות למדיה כדי להשיג ריכוז סופי של 2 מיקרוגרם/מ"ל. הוסף 50 מיקרוליטר של SIINFEKL (2 מ"ג/מ"ל) ל-50 מ"ל של מדיום כדי להשיג ריכוז סופי של 2 מיקרוגרם/מ"ל.
    7. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות.
    8. חיטוי מכסה המנוע של תרבית הרקמה באמצעות 70% אתנול.
  2. ביום הרביעי יש לשטוף את התאים כדי להסיר את הפפטיד. בעזרת מדיה טרייה שהוכנה בתוספת IL-2, השעו מחדש תאים ואז החזירו את הבקבוק לחממה.
    1. אוספים את התאים מבקבוק תרבית הרקמה T75 בצינור חרוטי של 50 מ"ל. צנטריפוגה וגלולה תאי OT-I CD8 T ולאחר מכן הסר את כל המדיה העודפת עם שאיפה. הוסף 50 מ"ל של מדיית עכבר חדשה המכילה 1,000 U/mL של IL-2 והעבר מחדש את התאים לבקבוק T75 חדש.
    2. לאחסון, שמור את הכמויות של ציר IL-2 במקפיא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. אחסון בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס ימזער את פירוק הפפטידים.
  3. הכנת תאי CD8 T ציטוטוקסיים מורחבים ספציפיים לאנטיגן לבדיקת תפקוד המיטוכונדריה
    1. ביום השביעי מתבצעת בדיקת תפקוד המיטוכונדריה. הכן את תא ה-OT-I CD8 T הספציפי לאנטיגן לבדיקה.
    2. אסוף תאי CD8 T חיים.
      1. העבירו את התאים מבקבוק תרבית הרקמה T-75 לצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור החרוטי למשך 5 דקות בחום של 500 × גרם.
      2. בצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל, פיפט 20 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות (צפיפות = 1.077 גרם/מ"ל) בזמן שהתאים מסתובבים.
      3. לאחר השלמת הצנטריפוגה, קח את הצינור החרוטי ובעזרת 10 מ"ל של מדיום, השהה מחדש את התאים. לאחר מכן, פיפטינג לאט מאוד, שכב את התאים התלויים על גבי שיפוע הצפיפות. מבלי להפריע לשיפוע, צנטריפוגה של הצינור החרוטי ב-1,300 × גרם למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כאשר ההגדרה מוגדרת לתאוצה מקסימלית והאטה מינימלית ללא בלם.
      4. לאחר השלמת הצנטריפוגה, השתמש בפיפט P1000 כדי לאסוף את השכבה האמצעית של תאי T. דמיין את השכבה הסלולרית וודא שהפיפט נשאר מעל ואינו מפריע לשכבה. העבירו תאים שנאספו לצינור חרוטי טרי של 50 מ"ל המכיל 30 מ"ל של מדיום עכבר שלם. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור החרוטי של 50 מ"ל ב-500 × גרם למשך 5 דקות. כאשר הצנטריפוגה מסתיימת, שאפו את עודף הסופרנטנט מתאי OT-I CD8 T. עם 20 מ"ל של מדיום עכבר טרי, השעו מחדש את התאים.
    3. בעזרת המוציטומטר, ספרו את המספר הכולל של תאים ברי קיימא. צבעו כמות קטנה של תאים בכחול טריפן בדילול של 1:4 כדי לזהות תאים מתים.
      הערה: ניתן לצפות לכ-40-60 ×-106 תאים מעכבר OT-I אחד.
    4. עם שלב צנטריפוגה נוסף, שטפו את התאים הנותרים עם 20 מ"ל נוספים של מדיום עכבר טרי. לאחר מכן באמצעות מיקרופלייט, תאי פיפט 200,000 תאים / באר במדיום עכבר שלם.

2. יצירה והרחבה של תאי CD8 T ספציפיים לפולי באמצעות גירוי אנטי-CD3/אנטי-CD28

  1. ביום 0, מצפים צלחת של 24 בארות ב-CD3. הוסף 1 מ"ל של אנטי-CD3-ביוטין בריכוז של 5 מיקרוגרם/מ"ל, מדולל ב-PBS, לכל באר של צלחת של 24 בארות. מניחים את הצלחת בחממה לחה של 5% CO2 למשך הלילה.
  2. למחרת, קצרו עכבר ואספו טחול. הפעל טחול במבחנה עם anti-CD3/anti-CD28 על ידי ביצוע השלבים 1.1.1-1.1.5.3.
  3. באמצעות פרוטוקול הפרדת החרוזים המגנטיים, בודד תאי CD8 T.
    הערה: ודא שהתאים נשמרים קרים. בתנאים מקוררים מראש, עבדו במהירות.
    1. שימוש ב-40 מיקרוליטר של מאגר MACS השהה מחדש את התאים עם 10,000,000 תאים לכל 40 מיקרוליטר של מאגר MACS. לתמיסה, מערבבים היטב 10 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים ביוטין לתוך תמיסת התא ולאחר מכן מדגרים למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    2. בזמן ההמתנה לתא לדגירת התא במקרר, הכינו עמודה לבחירה חיובית. השתמש ב-3 מ"ל של מאגר כדי לשטוף את העמוד ולאחר מכן השליך את זרימת הפסולת.
    3. לאחר 5 דקות, אספו את תמיסת הנוגדנים לתאים מהמקרר והוסיפו 30 מיקרוליטר של מאגר MACS לכל 10,000,000 תאים, 20 מיקרוליטר אנטי-ביוטין, ולאחר מכן דגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות נוספות.
    4. הכן צינור איסוף חדש מתחת לעמודת בחירה חיובית באמצעות צינור חרוטי טרי של 15 מ"ל. לאחר השלמת הדגירה של 10 דקות, העבר את תרחיף התא לעמודת הבחירה החיובית. בצינור חרוטי טרי של 15 מ"ל, אוספים את הזרימה. בעזרת 3 מ"ל של מאגר MACS, שטפו את העמודה כדי לאסוף תאים שיוריים.
      הערה: ודא שמתלה התא הוא בנפח מינימלי של 0.5 מ"ל.
    5. צבחו מחדש את תאי ה-CD8 T שנבחרו באופן חיובי בצלחת 24 הבארות לגירוי אנטי-CD3/אנטי-CD28.
      1. צנטריפוגה את הזרימה ב-500 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שאפו את עודפי הסופרנטנט והחליפו את התאים כדי להשעות אותם מחדש בתמיסה. בעזרת המציטומטר וטריפן כחול, ספרו את התאים.
        הערה: אנא צפו לספירה של ~8-10 ×-106 תאים חיים לכל טחול עכבר.
      2. לאחר ספירת התאים, השעו מחדש את תאי CD8 T ב-500,000 תאים למ"ל. לאחר מכן, שאפו בזהירות 1 מ"ל PBS מצלחת 24 הבארות, צבחו מחדש את התאים שנספרו בצלחת 24 הבארות והוסיפו 106 תאים לבאר.
      3. כדי לעורר את התאים, פיפט אנטי-CD28 לתוך צלחת 24 הבארות כך שהריכוז הסופי של אנטי-CD28 הוא 2 מיקרוגרם/מ"ל. כדי לערבב את התאים, הקש בזהירות על הצלחת. שמור את התאים על 37 מעלות צלזיוס במשך 72 השעות הבאות.
  4. בעזרת 70% אתנול, נקו את מכסה המנוע של תרבית הרקמות.
  5. ביום הרביעי (72 שעות מאוחר יותר), הסר את התאים מהגירוי נגד CD3/anti-CD28. שטפו את התאים על ידי צנטריפוגה של תאי CD8 T פוליקלונליים. הסר את עודפי ה-supernatant על ידי שאיבה ולאחר מכן השהה מחדש את התאים עם מדיום עכבר טרי עם 1,000 יחידות/מ"ל של IL-2 עם 10 מ"ל מדיה. העבירו את התאים התלויים לצלחת חדשה בת 6 בארות והניחו אותה בחממה.
    הערה: 1.2.2. לאחסון, ניתן לאחסן כמויות של מלאי IL-2 במקפיא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. אחסון בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס ימזער את פירוק הפפטידים.
  6. הכן את תאי האפקטור הפוליקלונלי המורחב CD8 T לבדיקת תפקוד המיטוכונדריה.
    1. ביום השביעי, הכינו ועבדו את תאי ה-CD8 T הפוליקלונליים לבדיקה.
    2. אסוף תאי CD8 T חיים.
      1. העבירו את התאים מצלחת 6 הבארות לצינור חרוטי נקי באמצעות פיפטה, ואז צנטריפוגה את התאים למשך 5 דקות בחום של 500 × גרם.
      2. בצע את השלבים 1.3.3.2-1.3.4.
        הערה: ניתן לצפות לכ-10-30 מיליון תאי CD8 T חיים מעכבר C57BL/6 יחיד.
      3. שמור כמות גדולה של תאים לזרימה ציטומטרית כדי להעריך את טוהר CD8. עבור ציטומטריית זרימה, צבעו את התאים על קרח למשך 20 דקות עם צבע כדאיות לבחירה9.

3. קציר תאי CD8 T נאיביים

  1. ביום השביעי, קצרו טחול מעכבר על ידי ביצוע השלבים 1.1.1-1.1.5.3.
  2. בצע בידוד תאי CD8 T באמצעות הפרוטוקול מבוסס החרוזים המגנטיים המתואר בשלבים 2.3-2.3.5.1.
  3. צלחת תאי CD8 T במיקרופלייט ב-200,000 תאים/לבאר בתווך שלם.

4. בצע את בדיקת תפקוד המיטוכונדריה

  1. הכן חומרים יום לפני הפעלת בדיקת תפקוד המיטוכונדריה.
    1. לחות את מחסנית החיישן.
      1. הכניסו 200 מיקרוליטר מים מזוקקים לכל באר של לוחית השירות. הנח את מחסנית החיישן על גבי לוחית השירות. בדוק שקצוות מחסנית החיישן שקועים כדי להבטיח הידרציה נאותה. הכנס גם את מחסנית החיישן וגם את לוחית השירות לחממה שאינה CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 שעות לפחות.
      2. הכינו צינור חרוטי של 50 מ"ל עם 50 מ"ל קלברנט והניחו אותו בחממה שאינה CO2 ודגרו למשך הלילה.
      3. יום לפני הבדיקה, הכינו את המדיום הטרי המלא לקראת הבדיקה. בסך הכל 50 מ"ל הכינו תמיסה של 1 מ"מ פירובט, 2 מ"מ גלוטמין ו-10 מ"מ גלוקוז במדיום הבדיקה.
  2. בצע את בדיקת תפקוד המיטוכונדריה למחרת.
    1. הסר מים מזוקקים מלוחית השירות על ידי החלקתם. יש להחזיר לחות עם 200 מיקרוליטר קליברנט. השתמש בקליברנט שאוחסן באינקובטור שאינו CO2 למשך הלילה. לאחר החלפת מחסנית החיישן על גבי לוחית השירות. החזר את לוחית השירות עם מחסנית החיישן לחממה שאינה CO2 .
      הערה: כדי להעיף את הצלחת, הפוך במהירות ובמהירות את הצלחת בתנועת נוזל אחת מעל הכיור כך שהמים המזוקקים ייפלו במהירות מהצלחת.
  3. הכן תאי CD8 T כמתואר לעיל בסעיפים 1-3.
    1. בעזרת פיפט רב ערוצי, צלחת 200,000 תאים לבאר על ידי השעיה מחדש של 10 × 106 תאים ב -4.5 מ"ל של מדיום שלם וציפוי 90 מיקרוליטר לבאר. לאחר מכן, הוסף עוד 90 מיקרוליטר של מדיה ייעודית לכל באר במהלך הטיפול המקדים.
      הערה: אם אין טיפולים מקדימים, צלחו את התאים ב-180 מיקרוליטר לבאר עם ריכוז סופי של 200,000 תאים לבאר. מנקודה זו ואילך בפרוטוקול, שמור את הצלחת בטמפרטורת החדר הסביבתית או בחממה שאינה CO2 . אין להניח את הצלחת בחממה של 5% CO2 . שימו לב שהנפח הסופי של המיקרופלייט יהיה 180 מיקרוליטר.
  4. הכינו טיפולים מקדימים (כולל ליפידים או תוסף מטבוליט אחר).
    1. הכן טיפול מקדים בשומנים על ידי סיבוב שומן ליופילי מהמקפיא באמצעות מיני צנטריפוגה סיבוב מהיר. קבע את הריכוזים הרצויים לטיפול מקדים והכן את הטיפול המקדים בשומנים לריכוזים אלה. יש לסרוק את השומן המדולל למשך 30 דקות מיד לפני השימוש.
    2. הכינו קוקטיילים שומנים.
      1. קבע את ריכוז השומנים הרצוי לשימוש בבדיקת תפקוד המיטוכונדריה.
      2. מכינים את השומנים בריכוז שהוא פי 2 מהריכוז הרצוי. לאחר מכן, הוסף את תמיסת השומנים לנפח הקיים במיקרופלייט כדי להשיג דילול של 1:2. השלם זאת על ידי הוספת 90 מיקרוליטר של תמיסת השומנים ישירות ל-90 מיקרוליטר הקיימים. הנפח הסופי יהיה 180 מיקרוליטר (דילול 1:2) לבאר.
        הערה: טבלה 1 מפרטת תרשים לדוגמה של הגדרה ועיצוב אפשריים של לוחית. אנו מציעים לבצע את הבדיקה עם 5-6 שכפולים טכניים, המשלבים תאי CD8 T אפקטורים נאיביים וספציפיים לאנטיגן עם ובלי תוספי שומנים. יש לציין כי פרוטוקול זה נועד למנוע צנטריפוגה כדי למזער הפרעה סלולרית. מכיוון שבדיקת תפקוד המיטוכונדריה רגישה מאוד למספר התאים, הפחתת אובדן התאים היא קריטית. במקום צנטריפוגה, התאים מטופלים על ידי תנועה כדי לשמור על שלמותם.
      3. הכניסו 180 מיקרוליטר של מדיום שלם לכל פינה של הצלחת. הנח את המיקרופלייט עם תאי CD8 T לתוך אינקובטור שאינו CO2 .
        הערה: זמן הדגירה ישתנה בהתאם למשך הטיפול המקדים הרצוי. כדי למזער את מוות התאים, המלצנו על מקסימום 4 שעות טיפולים מקדימים לתאי CD8 T. הארכת יתר של זמן הטיפול המקדים עלולה לגרום למוות מוגזם של תאים, ולהשפיע על דיוק התוצאות.
  5. הכינו רעלים ופתרונות לזריקות חריפות
    1. בעזרת תמיסות מלאי, הכינו צורה מדוללת של אוליגומיצין. צור דילול של אוליגומיצין ב -3 מ"ל של מדיום שלם. בצינורות חרוטיים של 15 מ"ל, הכינו בזהירות רעלים וזריקות חריפות מכיוון שהרעלים רגישים לאור, הכינו את התמיסות הללו באמצעות צינורות עטופים בנייר כסף כדי להגן מפני חשיפה לאור.
      1. בצינור חרוטי אחד של 15 מ"ל עטוף בנייר כסף, יש לדלל אוליגומיצין ב -3 מ"ל של מדיום שלם כך שהריכוז הסופי יהיה 2.5 מיקרומטר לאחר ההזרקה.
      2. בצינור חרוטי שני של 15 מ"ל עטוף בנייר כסף, יש לדלל FCCP ב-3 מ"ל של מדיום שלם כך שהריכוז הסופי יהיה 2.0 מיקרומטר לאחר ההזרקה.
      3. בצינור חרוטי שלישי של 15 מ"ל עטוף בנייר כסף, צור תמיסות של רוטנון ואנטימיצין A ב-3 מ"ל של מדיום שלם כדי להשיג ריכוזים של 0.5 מיקרומטר לשני הרעלים לאחר ההזרקה.
      4. אם הבדיקה מבוצעת עם מודולטורים מטבוליים נוספים, תרופות או גירויים, יש לדלל את החומרים הללו במדיום שלם. אם מתכננים להשתמש באטומוקסיר או במודולטורים ותרופות מטבוליות אחרות, בצע תחילה בדיקה לבדיקת עקומת הטיטרציה ולקבוע את הריכוז האופטימלי לשימוש. אם מבצעים גירוי TCR באמצעות הזרקה חריפה, ניתן לבצע את הבדיקה באמצעות חרוזים מגנטיים anti-CD3/anti-CD28 או שילוב של anti-CD3-biotin הקשור לצלחת עם anti-CD28 סטרפטווידין.
        הערה: לתיאורים נוספים, עיין בסעיף 5 המתאר את הפרוטוקול לגירוי TCR עם הזרקה חריפה נגד CD3/CD28.
    2. הסר את מחסנית החיישן מהחממה שאינה CO2 . בעזרת מתאמי הצלחת, הכניסו את הרעלים למחסנית החיישן. הנח את מתאמי הצלחת כך שניתן יהיה להעמיס כל תא במיוחד ברעלים או זריקות חריפות אחרות.
      הערה: היזהר בעת פיפטינג הרעלים.
      1. טען רעלים ליציאות של מחסנית החיישן. אם לא יבוצעו זריקות נוספות, יציאות A-C יהיו עמוסות ברעלים. הכניסו 20 מיקרוליטר של אוליגומיצין ליציאה A, 22 מיקרוליטר של FCCP ליציאה B, 25 מיקרוליטר רוטנון ליציאה C ו-25 מיקרוליטר של אנטימיצין A ליציאה C.
  6. שעה לפני תחילת הבדיקה על המכשיר, הכניסו את המיקרו-פלייט לחממה שאינה CO2 .
  7. לפני הפעלת המכשיר, פתח את התוכנה וכייל את המכשיר. בצע משימה זו 30 דקות לפני טעינת המיקרופלייט למכשיר כדי להבטיח זמן מספיק לכיול.
    1. במערכת התוכנה, סמן את הבארות וסקור את תוכנית ההזרקה.
    2. במהלך הכיול, טען את מחסנית החיישן לתוך המכשיר. התוכנה תבקש ממך להשלים את האתחול ובדיקת האיכות. הכיול יעריך את ה-pH וה-O2 בכל באר שתעבור או תיכשל. המכשיר ידווח על התוצאות על המסך עם סימן ביקורת או 'X'.

5. בצע גרסה שונה של בדיקת תפקוד המיטוכונדריה עם גירוי TCR בניסוי נפרד עם הזרקה חריפה נגד CD3/CD28

הערה: ניתן לבצע את בדיקת התפקוד המיטוכונדריאלי עם סימולציית TCR חריפה באמצעות שתי גישות שונות על ידי 1) באמצעות אנטי-CD3 ביוטיניל + אנטי-CD28 + סטרפטווידין המתואר בשלב 5.2 או 2) חרוזים מגנטיים אנטי-CD3/CD28 המתוארים בשלב 5.3 ניסויים נפרדים אלה מתפקדים שניהם כדי לעורר את ה-TCR באמצעות הזרקה חריפה במהלך הבדיקה.

  1. אם מבצעים זריקות נוספות, הכינו את הבדיקה כמתואר בסעיף 4 הקודם. שנה את תוכניות ההזרקה באמצעות החדר הנוסף להזרקה. בפרוטוקול זה, אנטי-CD3/אנטי-CD28 נטענים ליציאה A של מחסנית החיישן. לאחר מכן, טען את היציאות האחרות באופן דומה, עם אוליגומיצין ליציאה B, FCCP ליציאה C, ורוטנון ואנטימיצין A ליציאה D.
  2. הכן וטען רכיבי אנטי-CD3 + אנטי-CD28 + סטרפטווידין ביוטיניליים.
    1. הכניסו 20 מיקרוליטר של אנטי-CD3 ביוטיניל ב-10 מיקרוגרם/מ"ל לתוך הבארות המיועדות במחסנית החיישן.
    2. הכניסו 20 מיקרוליטר של אנטי-CD28 ב-2 מיקרוגרם/מ"ל + סטרפטווידין ב-20 מיקרוגרם/מ"ל לתוך הבארות המיועדות במחסנית החיישן.
    3. הכניסו 20 מיקרוליטר של אנטי-CD3 ביוטיניל ב-10 מיקרוגרם/מ"ל + אנטי-CD28 ב-2 מיקרוגרם/מ"ל + סטרפטווידין ב-20 מיקרוגרם/מ"ל לתוך הבארות המיועדות במחסנית החיישן.
    4. ודא שבארות הבקרה מוכנות. ודא שיש בארות ייעודיות המוזרקות עם מדיה בלבד, אנטי-CD3 ביוטיניל בלבד, אנטי-CD28 + סטרפטווידין וביוטינילציה נגד CD3 + אנטי-CD28 + סטרפטווידין.
  3. באמצעות יחס חרוז לתא, הכינו וטענו חרוזים מגנטיים נגד CD3/CD28.
    1. בצלחת עם 200,000 תאים לבאר, צינור 5 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים לבארות המיועדות במחסנית החיישן.
    2. הכן את בארות הבקרה המיועדות עם מדיה להזרקה בלבד.
  4. התאם את נפח הרעלים כך שהריכוזים הסופיים לאחר ההזרקה יהיו: 2.5 מיקרומטר עבור אוליגומיצין, 2.0 מיקרומטר עבור FCCP ו-0.5 מיקרומטר עבור רוטנון ואנטימיצין A.
  5. ודא שערכת ההזרקה שונתה כדי לשקף את נקודות הזמן המעודכנות לפני טעינת המיקרו-פלייט על המכשיר.
  6. תכנת את התוכנה להריץ את גירוי ה-TCR החריף למשך 140 דקות בסך הכל. בתוך מסגרת זמן זו, שנה את התוכנית כך שיהיו מדידות של x10 נקודות זמן לפני הזרקת אוליגומיצין.

תוצאות

ניתן למדוד את היכולות המטבוליות הגליקוליטיות והחמצוניות באמצעות מבחן תפקודי מיטוכונדריאלי המעריך יכולות על ידי התמקדות ברכיבים של שרשרת הובלת האלקטרונים בנקודות זמן מסוימות (איור 2A). ניתן לטעון סכמות הזרקה שונות על יציאות מחסנית החיישן כדי לשנות את הב?...

Discussion

במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול להערכת תפקוד המיטוכונדריה של תאי CD8 T נאיביים ואפקטיביים. אנו מפרטים ומשווים שיטות להכנת תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן ופוליקלונליים באמצעות עכברי OT-I ו-C57BL/6. התוצאות שלנו מראות שישנן מגמות דומות בחילוף החומרים למרות שיטת ההפעלה והטיפול המקדים בת?...

Disclosures

למחברים אין אינטרסים מתחרים לחשוף.

Acknowledgements

קרן הרץ, קרן איימי דייויס, קרן משפחת מור וקרן היידי הורנר סיפקו תמיכה שלא תסולא בפז, ועל כך אנו אסירי תודה. עבודה זו נתמכה בחלקה גם על ידי מענקי NIH ל-RMT (AI052157, AI136534), בעוד ש-JAT נתמכה על ידי מלגת הרץ.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Antimycin ASigma-AldrichA8674
Anti-CD28Biolegend102116
Anti-CD3/CD28 DynabeadsThermoFisher11456D
Biotinylated anti-CD3Biolegend317320
Bovine Serum AlbuminSigma-Aldrich108321-42-2
CD8a+ T cell isolation kitMiltenyi Biotec130-104-075
Cell Strainers (100 µm)CELL TREAT229485
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma-AldrichE8008
FicollSigma-Aldrich26873-85-8density gradient medium 
FCCP ((4-(trifluoromethoxy) phenyl) carbonohydrazonoyl dicyanide)Sigma-AldrichC2920
GlucoseSigma-AldrichG-6152
GlutamineSigma-AldrichG7513
LS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401Positive selection columns
Magnetic cell separation columnMiltenyi Biotec130-042-301
MicroplateAgilent102601-100
OligomycinSigma-Aldrich75351
PyruvateSigma-Aldrich113-24-6
Recobinant IL-2PeproTech200-02
RotenoneSigma-AldrichR8875
Seahorse mediaAgilent103576-100
Sensor cartridgeAgilent102601-100
StreptavidinSigma-AldrichA9275
Sterile 6 well plateCELL TREAT230601
Sterile 24 well plateCELL TREAT229524
XF CalibrantAgilent102601-100

References

  1. Patsoukis, N., et al. PD-1 alters T-cell metabolic reprogramming by inhibiting glycolysis and promoting lipolysis and fatty acid oxidation. Nat Commun. 6, 6692 (2015).
  2. Scharping, N. E., et al. Mitochondrial stress induced by continuous stimulation under hypoxia rapidly drives T cell exhaustion. Nat Immunol. 22, 205-215 (2021).
  3. Schurich, A., et al. Distinct Metabolic Requirements of Exhausted and Functional Virus-Specific CD8 T Cells in the Same Host. Cell Rep. 16 (5), 1243-1252 (2016).
  4. Zhang, L., Romero, P. Metabolic control of CD8(+) T cell fate decisions and antitumor immunity. Trends Mol Med. 24 (1), 30-48 (2018).
  5. Batabyal, R., et al. Metabolic dysfunction and immunometabolism in COVID-19 pathophysiology and therapeutics. Int J Obes (Lond). 45 (6), 1163-1169 (2021).
  6. Chavakis, T. Immunometabolism: Where immunology and metabolism meet. J Innate Immun. 14, 1-3 (2022).
  7. Frezza, C., Mauro, C. Editorial: The metabolic challenges of immune cells in health and disease. Front Immunol. 6, 293 (2015).
  8. Wang, X., Ping, F. F., Bakht, S., Ling, J., Hassan, W. Immunometabolism features of metabolic deregulation and cancer. J Cell Mol Med. 23 (2), 694-701 (2019).
  9. Turner, J. A., et al. Lysophosphatidic acid modulates CD8 T cell immunosurveillance, metabolism, and anti-tumor immunity. Nat Commun. 14, 3214 (2023).
  10. Coussens, L. M., Werb, Z. Inflammation and cancer. Nature. 420, 860-867 (2002).
  11. Jiang, Y., Li, Y., Zhu, B. T-cell exhaustion in the tumor microenvironment. Cell Death Dis. 6 (6), e1792 (2015).
  12. Krangel, M. S. Mechanics of T cell receptor gene rearrangement. Curr Opin Immunol. 21 (2), 133-139 (2009).
  13. Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
  14. Beltra, J. C., et al. Developmental relationships of four exhausted CD8(+) T cell subsets reveals underlying transcriptional and epigenetic landscape control mechanisms. Immunity. 52 (5), 825-841 (2020).
  15. Bengsch, B., et al. Bioenergetic insufficiencies due to metabolic alterations regulated by the inhibitory receptor PD-1 are an early driver of CD8(+) T cell exhaustion. Immunity. 45 (2), 358-373 (2016).
  16. Blank, C. U., et al. Defining 'T cell exhaustion'. Nat Rev Immunol. 19, 665-674 (2019).
  17. Dolina, J. S., Van Braeckel-Budimir, N., Thomas, G. D., Salek-Ardakani, S. CD8(+) T cell exhaustion in cancer. Front Immunol. 12, 715234 (2021).
  18. Mognol, G. P., et al. Exhaustion-associated regulatory regions in CD8(+) tumor-infiltrating T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (13), E2776-E2785 (2017).
  19. Wang, D., et al. A comprehensive profile of TCF1(+) progenitor and TCF1(-) terminally exhausted PD-1(+)CD8(+) T cells in head and neck squamous cell carcinoma: implications for prognosis and immunotherapy. Int J Oral Sci. 14 (1), 8 (2022).
  20. Vardhana, S. A., et al. Impaired mitochondrial oxidative phosphorylation limits the self-renewal of T cells exposed to persistent antigen. Nat Immunol. 21, 1022-1033 (2020).
  21. Kang, S., Brown, H. M., Hwang, S. Direct antiviral mechanisms of interferon-gamma. Immune Netw. 18 (5), e33 (2018).
  22. Samuel, C. E. Antiviral actions of interferons. Clin Microbiol Rev. 14, 778-809 (2001).
  23. Schellekens, H., Weimar, W., Cantell, K., Stitz, L. Antiviral effect of interferon in vivo may be mediated by the host. Nature. 278, 742 (1979).
  24. Radoja, S., et al. CD8(+) tumor-infiltrating T cells are deficient in perforin-mediated cytolytic activity due to defective microtubule-organizing center mobilization and lytic granule exocytosis. J Immunol. 167 (9), 5042-5051 (2001).
  25. van der Windt, G. J., et al. Mitochondrial respiratory capacity is a critical regulator of CD8+ T cell memory development. Immunity. 36 (1), 68-78 (2012).
  26. Balmer, M. L., et al. Memory CD8(+) T cells require increased concentrations of acetate induced by stress for optimal function. Immunity. 44 (6), 1312-1324 (2016).
  27. Pereira, R. M., Hogan, P. G., Rao, A., Martinez, G. J. Transcriptional and epigenetic regulation of T cell hyporesponsiveness. J Leukoc Biol. 102, 601-615 (2017).
  28. Sen, D. R., et al. The epigenetic landscape of T cell exhaustion. Science. 354, 1165-1169 (2016).
  29. Quintana, A., et al. T cell activation requires mitochondrial translocation to the immunological synapse. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14418-14423 (2007).
  30. Brindley, D. N. Lysophosphatidic acid signaling in cancer. Cancers (Basel). 12 (12), 3791 (2020).
  31. Chae, C. S., et al. Tumor-derived lysophosphatidic acid blunts protective type I interferon responses in ovarian cancer. Cancer Discov. 12, 1904-1921 (2022).
  32. Kremer, K. N., et al. LPA suppresses T cell function by altering the cytoskeleton and disrupting immune synapse formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (15), e2118816119 (2022).
  33. Mathew, D., et al. LPA5 is an inhibitory receptor that suppresses CD8 T-cell cytotoxic function via disruption of early TCR signaling. Front Immunol. 10, 1159 (2019).
  34. Mathew, D., Torres, R. M. Lysophosphatidic acid is an inflammatory lipid exploited by cancers for immune evasion via mechanisms similar and distinct from CTLA-4 and PD-1. Front Immunol. 11, 531910 (2020).
  35. Oda, S. K., et al. Lysophosphatidic acid inhibits CD8 T cell activation and control of tumor progression. Cancer Immunol Res. 1 (4), 245-255 (2013).
  36. Lidgerwood, G. E., Pitson, S. M., Bonder, C., Pebay, A. Roles of lysophosphatidic acid and sphingosine-1-phosphate in stem cell biology. Prog Lipid Res. 72, 42-54 (2018).
  37. Torres, R. M., Turner, J. A., D'Antonio, M., Pelanda, R., Kremer, K. N. Regulation of CD8 T-cell signaling, metabolism, and cytotoxic activity by extracellular lysophosphatidic acid. Immunol Rev. 317 (1), 203-222 (2023).
  38. Turner, J. A., et al. BRAF modulates lipid use and accumulation. Cancers (Basel). 14 (9), 2110 (2022).
  39. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  40. Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. J Transl Med. 8, 104 (2010).
  41. Ralli, M., et al. Immunotherapy in the treatment of metastatic melanoma: current knowledge and future directions. J Immunol Res. 2020, 9235638 (2020).
  42. Philip, M., Schietinger, A. CD8(+) T cell differentiation and dysfunction in cancer. Nat Rev Immunol. 22, 209-223 (2022).
  43. Bajrai, L. H., et al. Understanding the role of potential pathways and its components including hypoxia and immune system in case of oral cancer. Sci Rep. 11, 19576 (2021).
  44. Nicholls, D. G. Mitochondrial proton leaks and uncoupling proteins. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1862, 148428 (2021).
  45. Tyrakis, P. A., et al. S-2-hydroxyglutarate regulates CD8(+) T-lymphocyte fate. Nature. 540, 236-241 (2016).
  46. Guo, Y., et al. Metabolic reprogramming of terminally exhausted CD8(+) T cells by IL-10 enhances anti-tumor immunity. Nat Immunol. 22, 746-756 (2021).
  47. Notarangelo, G., et al. Oncometabolite d-2HG alters T cell metabolism to impair CD8(+) T cell function. Science. 377 (6614), 1519-1529 (2022).
  48. Yang, K., et al. T cell exit from quiescence and differentiation into Th2 cells depend on Raptor-mTORC1-mediated metabolic reprogramming. Immunity. 39 (6), 1043-1056 (2013).
  49. Ricciardi, S., et al. The translational machinery of human CD4(+) T cells is poised for activation and controls the switch from quiescence to metabolic remodeling. Cell Metab. 28 (6), 895-906.e5 (2018).
  50. Moller, S. H., Hsueh, P. C., Yu, Y. R., Zhang, L., Ho, P. C. Metabolic programs tailor T cell immunity in viral infection, cancer, and aging. Cell Metab. 34 (3), 378-395 (2022).
  51. Alrubayyi, A., et al. Functional restoration of exhausted CD8 T cells in chronic HIV-1 infection by targeting mitochondrial dysfunction. Front Immunol. 13, 908697 (2022).
  52. Vignali, P. D. A., et al. Hypoxia drives CD39-dependent suppressor function in exhausted T cells to limit antitumor immunity. Nat Immunol. 24, 267-279 (2023).
  53. Ogando, J., et al. PD-1 signaling affects cristae morphology and leads to mitochondrial dysfunction in human CD8(+) T lymphocytes. J Immunother Cancer. 7 (1), 151 (2019).
  54. Billingham, L. K., et al. Mitochondrial electron transport chain is necessary for NLRP3 inflammasome activation. Nat Immunol. 23, 692-704 (2022).
  55. Eberhardt, D. R., et al. EFHD1 ablation inhibits cardiac mitoflash activation and protects cardiomyocytes from ischemia. J Mol Cell Cardiol. 167, 1-14 (2022).
  56. Hou, T., et al. Identification of EFHD1 as a novel Ca(2+) sensor for mitoflash activation. Cell Calcium. 59 (5), 262-270 (2016).
  57. Mun, S. A., et al. Structural and biochemical characterization of EFhd1/Swiprosin-2, an actin-binding protein in mitochondria. Front Cell Dev Biol. 8, 628222 (2020).
  58. Stein, M., et al. A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1. Cell Death Differ. 24 (7), 1239-1252 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

217

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved