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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
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  • Ergebnisse
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  • Offenlegungen
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  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die Bioenergetik der CD8-T-Zellen kann mit dem Mito Stresstest abgefragt werden. Diese Methodik kann verwendet werden, um die akute und chronische metabolische Programmierung zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt Ansätze zur Untersuchung der Beziehungen zwischen der Biologie von T-Zell-Rezeptoren und der bioenergetischen Analyse.

Zusammenfassung

Das Verständnis, wie sich der Immunstoffwechsel auf die Funktion, Differenzierung und das Schicksal von Lymphozyten auswirkt, hat großes Interesse und Aufmerksamkeit geweckt. Die Lymphozytenbiologie wurde mit Hilfe der bioenergetischen Analyse erforscht und ist heute zu einem wichtigen Werkzeug auf diesem Gebiet geworden. Daher haben wir versucht, einen bioenergetischen Analyse-Assay zu optimieren, der mit Vorbehandlungen und akuter Injektion für Rezeptorstimulationen angepasst werden kann. In dieser Arbeit untersuchten wir den Ex-vivo-Metabolismus von CD8-T-Zellen mit dem Cell Mito Stresstest, um die Raten des Sauerstoffverbrauchs und der extrazellulären Ansäuerung in naiven und Effektor-CD8-T-Zellen zu bestimmen. Antigen-spezifische Effektor-CD8-T-Zellen wurden durch ex vivo-Stimulation gewonnen, und naive CD8-T-Zellen wurden aus Splenozyten entnommen und mit magnetischer Bead-Säulentrennung isoliert.

Die Vorbehandlungen werden in Mikrotiterplatten durchgeführt und wir beschreiben die Vorbereitung von Sensorpatronen. Wir zeigen, wie Injektionsöffnungen mit Medikamenten beladen werden können, um indirekt die Stoffwechselkapazität zu messen, und mit Stoffwechselmodulatoren kann dieses Protokoll verwendet werden, um die spezifische Enzymaktivität zu untersuchen. Die Stimulation von T-Zell-Rezeptoren kann in Echtzeit mit akuter Injektion und Stimulation mit Anti-CD3/CD28 unter Verwendung der Injektionsöffnungen untersucht werden. Instrumentenanalysatoren werden für Messungen und Datenerfassung verwendet, und die Datenvisualisierung erfolgt mit Softwareprogrammen zur Interpretation des Zellstoffwechsels. Diese Strategie erzeugt eine umfangreiche Menge an Daten über die Immunzellbiologie und die mitochondriale Bioenergetik, die es den Forschern ermöglicht, das Protokoll auf vielfältige Weise anzupassen, um den CD8-T-Zellstoffwechsel zu erforschen.

Einleitung

Das Schicksal und die Funktionalität von Immunzellen werden maßgeblich durch den Stoffwechsel, den oxidativen Verbrauch und die anaerobe Atmung beeinflusst 1,2,3,4. In jüngster Zeit besteht ein wachsendes Interesse an der gezielten metabolischen Modulation als Strategie zur Neuprogrammierung oder Wiederbelebung des Schicksals und der Effektorfunktion von CD8-T-Zellen und zur Verbesserung der viralen Clearance oder zur Verbesserung der endogenen Anti-Tumor-Immunität 5,6,7,8,9. Insbesondere die Signalübertragung des Antigenrezeptors durch den T-Zell-Rezeptor (TCR) ist eine Schlüsselvoraussetzung für die Differenzierung von CD8-T-Zellen, was zu einer nachgeschalteten Signalübertragung und Aktivierung führt 10,11,12 (Abbildung 1). Eine längere Exposition gegenüber immunologischen Beleidigungen führt zu einer anhaltenden antigenspezifischen Stimulation des TCR, die schließlich zu chronisch entzündeten Zuständen, T-Zell-Müdigkeit, einem Umbau der Immunmikroumgebung und einer Immunflucht führt 11,13,14,15,16,17,18,19.

Der Metabolismus erschöpfter CD8-T-Zellen unterscheidet sich grundlegend von dem der funktionellen Effektor-CD8-T-Zellen 2,3,14,15,18,20. Die Differenzierung von T-Zellen, die Sekretion von Interferon γ (IFNγ) und die Recall-Kapazität werden zum Teil durch die mitochondriale Funktion und die β-Oxidations-Abbauprodukte bestimmt. IFNγ+ CD8-T-Zellen sind wichtige Bestandteile sowohl der Anti-Tumor- als auch der antiviralen Immunantwort 21,22,23. Der spezifische metabolische Fluss über die Glykolyse und die Elektronentransportkette ist wichtig für die Aktivierung von CD8-T-Zellen, die Zytokinsekretion und die Gedächtnisreaktionen 4,11,13,15,18,24,25,26,27,28 . Optimale Reaktionen, einschließlich T-Zell-Aktivierung und Effektordifferenzierung, erfordern eine koordinierte und spezifische mitochondriale Antwort, während mitochondriale Defekte und übermäßige reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erschöpfte oder dysfunktionale T-Zellen charakterisieren 9,29. In jüngster Zeit fördert die persistente TCR-Stimulation von CD8-T-Zellen in vitro die umfassende Differenzierung von CD8-T-Zellen, zum Teil durch Induktion von oxidativem Stress und die Reprogrammierung des oxidativen Stoffwechsels und der metabolischen Kapazitäten, die für die T-Zellproliferation erforderlich sind 1,2,13,20,24,29 . Insgesamt sind metabolische Kontrollachsen entscheidende Komponenten bei der Steuerung der CD8-T-Zell-Differenzierung und ihrer Progression zu Effektor-, Gedächtnis- oder erschöpften/dysfunktionalen Phänotypen.

Stoffwechselverbindungen steuern auch die Immunzellreaktionen, indem sie als autokrine oder parakrine Signalmoleküle fungieren 9,30,31,32,33,34,35. Sphingosin-1-phosphat (S1P) und Lysophosphatidsäure (LPA) sind bioaktive und inflammatorische Lipide, die über G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) signalisieren, um den Lymphozytenaustritt und die Zytotoxizität von CD8-T-Zellen zu modulieren36. Die LPA-Signalübertragung über GPCR-LPA-Rezeptoren auf CD8-T-Zellen programmiert den Stoffwechsel um, um die Lipolyse, die Fettsäureoxidation und das Protonenleck zu erhöhen9. Insgesamt werden die Bioenergetik und der Stoffwechsel von CD8-T-Zellen weitgehend von der Substratverfügbarkeit, Umwelteinflüssen und energetischen Anforderungen bestimmt.

Methoden zur Untersuchung des CD8-T-Zellstoffwechsels werden immer wichtiger. Der Cell Mito Stresstest bietet eine umfassende Bewertung der Bioenergetik und ist mittlerweile als Markenzeichen auf dem Gebiet des Immunstoffwechsels und der CD8-T-Zellenergetik anerkannt 9,37. Adhärente Zellen wurden in der Vergangenheit für den Mito-Stresstest-Assayverwendet 38; Es besteht jedoch ein zunehmendes Interesse daran, dieses Protokoll auf Zellen anzuwenden, die in Suspension gezüchtet wurden, und speziell Immunzellen für den Cell Mito Stress Test Assay zu verwenden. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Messung der metabolischen Aktivität von CD8-T-Zellen vor, das auf unserer jüngsten Veröffentlichung9 basiert. Wir bieten eine detaillierte Erläuterung der Expansion von CD8-T-Zellen, der naiven Isolierung von CD8-T-Zellen, der Assay-Vorbereitung und der Behandlung mit Protokollen sowohl für Vorbehandlungen als auch für akute Injektionen im Cell Mito Stress Test Assay. Wichtig ist, dass wir mehrere Methoden zur TCR-Stimulation und CD8-T-Zell-Aktivierung, einschließlich polyklonaler und antigenspezifischer TCR-Stimulation, vergleichen und gegenüberstellen.

Dieses Protokoll beschreibt die antigenspezifische Stimulation mit OT-I-transgenen Mäusen (einem klassischen transgenen Mausmodell), bei denen alle Maus-T-Zellen die gleichen Vα2 - und Vβ5-Gene exprimieren39. Die CD8-T-Zellen der OT-I-Maus beherbergen alle denselben TCR, der spezifisch gegen das Ovalbumin-Octapeptid ist (OVA257-264 , auch als Aminosäuresequenz SIINFEKL oder N4 geschrieben, ein umfassend untersuchtes Epitop, das bei Präsentation durch den Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse I zytotoxische CD8-T-Zellen aktiviert39 (Abbildung 1A). Insgesamt wird das OT-I-transgene Mausmodell von Immunologen häufig verwendet, um die TCR-Signalgebung und die antigenspezifische T-Zell-Effektorfunktion zu untersuchen. Im Gegensatz zur monoklonalen Aktivierung mit dem OT-I-Mausmodell können polyklonale CD8-T-Zellen mit Anti-CD3/CD28-Antikörpern gegen TCR-CD3-Untereinheiten und das CD28-Co-stimulatorische Molekül40 erzeugt werden (Abbildung 1B). Anti-CD3/CD28-Antikörper umgehen die antigenspezifische Komponente des TCR-Signalwegs, um eine polyklonale Population von T-Zellen zu aktivieren40. Letztendlich vergleichen die in diesem Bericht beschriebenen Ergebnisse mehrere Methoden zur Verwendung des Cell Mito Stresstests zur Quantifizierung des dynamischen Stoffwechselflusses in CD8-T-Zellen.

Protokoll

Die Mäuse wurden in einer pathogenfreien Umgebung gehalten und gemäß den Standards und Vorschriften des Institutional Animal Care and Use Committee gehalten.

1. Erzeugung und Expansion von CD8-T-Zellen durch antigenspezifische Stimulation

  1. Ernten Sie am ersten Tag Splenozyten, die von OT-I-Mäusen stammen; Bereiten Sie sie dann vor und aktivieren Sie sie in vitro mit dem Peptid SIINFEKL (4).
    1. Reinigen Sie den Raum der Haube, bereiten Sie Reagenzien vor und sammeln Sie das Mausmedium. Erwärmen Sie das Mausmedium in einem Wasser- oder Perleninkubator.
      1. Geben Sie in eine 6-Well-Platte 7 ml Mausmedium in eine Vertiefung und dann weitere 3 ml Mausmedium in eine andere Vertiefung. Führen Sie anschließend ein Sieb mit 7 mL Medium in die Vertiefung ein.
    2. Bringen Sie eine Maus aus dem Vivarium in einen Transferkäfig ins Labor. Setzen Sie die Maus in einen leeren neuen Käfig um und positionieren Sie den CO2 -Adapter auf der Oberseite. Euthanasieren Sie die Maus mit CO2 bis zu einem Durchflussniveau von 2,75.
      1. Beobachten Sie die Maus sorgfältig und achten Sie auf Anzeichen von Stress. Achten Sie nach dem letzten Atemzug mindestens 1 Minute lang auf Anzeichen von Atmung und Leben. Schalten Sie das CO2 aus und führen Sie eine Gebärmutterhalsluxation als sekundäre Methode der Euthanasie durch. Reinigen Sie dann die Arbeitsplatte, den Käfig und den Rest des Arbeitsbereichs und tragen Sie die Maus zur Präparierhaube.
    3. Präpariere die Milz aus der Maus.
      1. Verwenden Sie 70%iges Ethanol, um das Seziergerät zu sterilisieren, und legen Sie die Maus mit der linken Seite nach unten, besprühen Sie die linke Seite der Maus zur Desinfektion.
      2. Präparieren Sie mit sauberen Instrumenten, um die Haut zu entfernen und das Bauchfell zu identifizieren. Machen Sie einen kleinen Schnitt durch das Bauchfell, um die Milz zu finden, und entfernen Sie dann die Milz. Lege die Milz in die 6-Well-Platte auf das Sieb.
      3. Reinigen Sie den Bereich, legen Sie den Mäusekadaver in einen Entsorgungsbeutel und legen Sie den Beutel dann zur Entsorgung in einen Gefrierschrank.
      4. Stellen Sie sicher, dass der gesamte Bereich sauber ist, und schieben Sie die 6-Well-Platte für die nächsten Schritte in die Gewebekulturhaube.
    4. In der Gewebekulturhaube wird die Milz homogenisiert und die Zellen zu einer einzelligen Suspension ohne Klumpen resuspendiert.
      1. Schieben Sie die Milz mit dem Kolben einer 5-ml-Spritze durch das Sieb in die Vertiefung mit 7 ml Medium.
      2. Spülen Sie das Sieb und das restliche Gewebe mit 3 ml Medium in der zusätzlichen Vertiefung ab.
      3. Übertragen Sie die Zellsuspension mit einer serologischen Pipette in ein neues konisches 10-ml-Röhrchen.
      4. 5 min bei 500 × g zentrifugieren und den Überstand mit einer Glaspipette absaugen.
    5. Lysieren Sie rote Blutkörperchen.
      1. Beginnen Sie den Prozess für eine Lyse roter Blutkörperchen mit 1 ml ACK-Lysepuffer, indem Sie die Zellen in ACK-Lysepuffer resuspendieren und 1-5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.
        HINWEIS: Die Inkubationszeit sollte auf die spezifische Charge des ACK-Lysepuffers abgestimmt werden, um eine maximale Lyse der roten Blutkörperchen bei minimalem Milnozytentod zu erreichen.
      2. 10 ml Medium zur Neutralisation in das konische Röhrchen geben und 5 min bei 500 × g zentrifugieren.
      3. Die Zellen werden in 50 ml Medium resuspendiert und in einen T75-Kolben überführt.
    6. Stimulieren Sie die Zellen mit SIINFEKL (N4) Peptid.
      1. Bringen Sie das SIINFEKL-Peptid in die Gewebekulturhaube. Lagern Sie das SIINFEKL-Peptid bei -20 °C.
      2. Geben Sie SIINFEKL direkt in das Medium, um eine Endkonzentration von 2 μg/ml zu erreichen. 50 μl SIINFEKL (2 mg/ml) zu 50 mL Medium hinzufügen, um eine Endkonzentration von 2 μg/ml zu erreichen.
    7. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 72 h.
    8. Desinfizieren Sie die Gewebekulturhaube mit 70 % Ethanol.
  2. Waschen Sie am vierten Tag die Zellen, um das Peptid zu entfernen. Mit frisch vorbereiteten Medien, die mit IL-2 ergänzt sind, resuspendieren Sie die Zellen und stellen Sie den Kolben wieder in den Inkubator.
    1. Sammeln Sie die Zellen aus dem T75-Gewebekulturkolben in einem konischen 50-ml-Röhrchen. OT-I CD8 T-Zellen zentrifugieren und pelletieren und anschließend überschüssige Medien durch Aspiration entfernen. Geben Sie 50 ml eines neuen Mausmediums mit 1.000 U/ml IL-2 hinzu und übertragen Sie die Zellen in einen neuen T75-Kolben.
    2. Zur Lagerung sind die Aliquote der IL-2-Brühe in einem Gefrierschrank bei -80 °C aufzubewahren. Die Lagerung bei -80 °C minimiert den Peptidabbau.
  3. Bereiten Sie expandierte antigenspezifische zytotoxische CD8-T-Zellen für den mitochondrialen Funktionsassay vor
    1. Am siebten Tag wird der mitochondriale Funktionstest durchgeführt. Bereiten Sie die antigenspezifische OT-I CD8 T-Zelle für den Assay vor.
    2. Sammeln Sie lebende CD8-T-Zellen.
      1. Übertragen Sie die Zellen aus dem T-75-Gewebekulturkolben in ein neues konisches 50-ml-Röhrchen. Dann zentrifugieren Sie das konische Röhrchen 5 Minuten lang bei 500 × g.
      2. In ein neues konisches 50-ml-Röhrchen pipettieren Sie 20 mL eines Dichtegradientenmediums (Dichte = 1,077 g/ml), während sich die Zellen drehen.
      3. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, nehmen Sie das konische Röhrchen und resuspendieren Sie die Zellen mit 10 ml Medium. Schichten Sie dann mit sehr langsamem Pipettieren die resuspendierten Zellen auf den Dichtegradienten. Ohne den Gradienten zu stören, zentrifugieren Sie das konische Röhrchen bei 1.300 × g für 20 min bei Raumtemperatur, wobei die Einstellung auf maximale Beschleunigung und minimale Verzögerung ohne Bremse eingestellt ist.
      4. Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, verwenden Sie eine P1000-Pipette, um die mittlere Schicht der T-Zellen zu entnehmen. Visualisieren Sie die Zellschicht und stellen Sie sicher, dass die Pipette oben bleibt und die Schicht nicht stört. Übertragen Sie die gesammelten Zellen in ein frisches konisches 50-ml-Röhrchen mit 30 mL vollständigem Mausmedium. Zentrifugieren Sie dann das konische 50-ml-Röhrchen bei 500 × g für 5 Minuten. Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, aspirieren Sie den überschüssigen Überstand aus den OT-I CD8 T-Zellen. Mit 20 ml frischem Mausmedium resuspendieren Sie die Zellen.
    3. Zählen Sie mit einem Hämozytometer die Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen. Färben Sie ein kleines Aliquot von Zellen mit Trypanblau in einer Verdünnung von 1:4, um tote Zellen zu identifizieren.
      HINWEIS: Von einer OT-I-Maus können ca. 40-60 × 106 Zellen erwartet werden.
    4. Waschen Sie die verbleibenden Zellen in einem zusätzlichen Zentrifugationsschritt mit zusätzlichen 20 mL frischem Mausmedium. Pipettieren Sie dann mit einer Mikroplatte 200.000 Zellen/Well in vollständiges Mausmedium.

2. Erzeugung und Expansion von poly-spezifischen CD8-T-Zellen durch Anti-CD3/Anti-CD28-Stimulation

  1. Beschichten Sie an Tag 0 eine 24-Well-Platte mit CD3. Geben Sie 1 ml Anti-CD3-Biotin in einer Konzentration von 5 μg/ml, verdünnt in PBS, in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte. Stellen Sie die Platte über Nacht in einen befeuchteten 5 % CO2 -Inkubator.
  2. Ernten Sie am nächsten Tag eine Maus und sammeln Sie Splenozyten. Aktivieren Sie Milzzellen in vitro mit Anti-CD3/Anti-CD28, indem Sie die Schritte 1.1.1-1.1.5.3 befolgen.
  3. Isolieren Sie CD8-T-Zellen mit dem Protokoll zur Isolierung von magnetischen Beads.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Zellen kalt bleiben. Unter vorgekühlten Bedingungen schnell arbeiten.
    1. Unter Verwendung von 40 μl MACS-Puffer resuspendieren Sie die Zellen mit 10.000.000 Zellen pro 40 μl MACS-Puffer. In die Lösung 10 μl Biotin-Antikörper-Cocktail gründlich in die Zelllösung mischen und dann 5 Minuten bei 4 °C inkubieren.
    2. Während Sie darauf warten, dass die Zelle im Kühlschrank inkubiert ist, bereiten Sie eine Säule für die Positivauswahl vor. Verwenden Sie 3 ml Puffer, um die Säule zu waschen, und entsorgen Sie dann den Abfallfluss.
    3. Nach 5 Minuten die Zell-Antikörper-Lösung aus dem Kühlschrank nehmen und 30 μl MACS-Puffer pro 10.000.000 Zellen und 20 μl Anti-Biotin hinzufügen und dann weitere 10 Minuten bei 4 °C inkubieren.
    4. Bereiten Sie ein neues Entnahmeröhrchen unter einer Positivselektionssäule unter Verwendung eines frischen konischen 15-ml-Röhrchens vor. Sobald die 10-minütige Inkubation abgeschlossen ist, übertragen Sie die Zellsuspension in die positive Selektionssäule. In einem frischen konischen 15-ml-Röhrchen den Durchfluss auffangen. Waschen Sie die Säule mit 3 ml MACS-Puffer, um Restzellen zu sammeln.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich die Zellsuspension in einem Mindestvolumen von 0,5 ml befindet.
    5. Replatetieren Sie die positiv selektierten CD8-T-Zellen in der 24-Well-Platte für die Anti-CD3/Anti-CD28-Stimulation.
      1. Zentrifugieren Sie den Durchfluss bei 500 × g für 5 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den überschüssigen Überstand und pipetieren Sie die Zellen, um sie in Lösung wieder zu suspendieren. Zählen Sie mit einem Hämazytometer und Trypanblau die Zellen.
        HINWEIS: Bitte erwarten Sie, dass ~8-10 × 106 lebende Zellen pro Mausmilz gezählt werden.
      2. Nachdem Sie die Zellen gezählt haben, resuspendieren Sie die CD8-T-Zellen bei 500.000 Zellen pro ml. Aspirieren Sie dann vorsichtig 1 ml PBS aus der 24-Well-Platte, legen Sie die gezählten Zellen erneut in die 24-Well-Platte und fügen Sie 106 Zellen pro Well hinzu.
      3. Um die Zellen zu stimulieren, pipettieren Sie Anti-CD28 in die 24-Well-Platte, so dass die Endkonzentration von Anti-CD28 2 μg/ml beträgt. Um die Zellen zu mischen, klopfen Sie vorsichtig auf die Platte. Halten Sie die Zellen für die nächsten 72 Stunden bei 37 °C.
  4. Reinigen Sie die Gewebekulturhaube mit 70 % Ethanol.
  5. Entfernen Sie am 4. Tag (72 h später) die Zellen aus der Anti-CD3/Anti-CD28-Stimulation. Waschen Sie die Zellen, indem Sie polyklonale CD8-T-Zellen zentrifugieren. Entfernen Sie den überschüssigen Überstand durch Aspiration und resuspendieren Sie die Zellen dann mit frischem Mausmedium mit 1.000 Einheiten/ml IL-2 mit 10 ml Medium. Übertragen Sie die resuspendierten Zellen in eine neue 6-Well-Platte und legen Sie sie in den Inkubator.
    ANMERKUNG: 1.2.2. Zur Lagerung können Aliquots der IL-2-Brühe in einem Gefrierschrank bei -80 °C gelagert werden. Die Lagerung bei -80 °C minimiert den Peptidabbau.
  6. Bereiten Sie die CD8-T-Zellen des expandierten polyklonalen Effektors für den mitochondrialen Funktionsassay vor.
    1. Am siebten Tag bereiten Sie die polyklonalen CD8-T-Zellen für den Assay vor und verarbeiten sie.
    2. Sammeln Sie lebende CD8-T-Zellen.
      1. Übertragen Sie die Zellen mit einer Pipette von der 6-Well-Platte in ein sauberes konisches Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen dann 5 Minuten lang bei 500 × g.
      2. Führen Sie die Schritte 1.3.3.2-1.3.4 aus.
        HINWEIS: Von einer einzigen C57BL/6-Maus können ungefähr 10-30 Millionen lebende CD8-T-Zellen erwartet werden.
      3. Speichern Sie ein Aliquot von Zellen für die Durchflusszytometrie, um die CD8-Reinheit zu beurteilen. Für die Durchflusszytometrie färben Sie die Zellen 20 Minuten lang auf Eis mit einem Viabilitätsfarbstoff Ihrer Wahl9.

3. Naive CD8-T-Zellen ernten

  1. Ernten Sie am siebten Tag Milzzellen aus einer Maus, indem Sie die Schritte 1.1.1-1.1.5.3 befolgen.
  2. Führen Sie die Isolierung von CD8-T-Zellen unter Verwendung des auf magnetischen Beads basierenden Protokolls durch, das in den Schritten 2.3 bis 2.3.5.1 beschrieben wurde.
  3. CD8 T-Zellen in der Mikroplatte mit 200.000 Zellen/pro Well in vollständigem Medium plattieren.

4. Führen Sie den mitochondrialen Funktionstest durch

  1. Bereiten Sie die Materialien am Tag vor der Durchführung des mitochondrialen Funktionstests vor.
    1. Hydratisieren Sie die Sensorpatrone.
      1. Pipettieren Sie 200 μl destilliertes Wasser in jede Vertiefung der Versorgungsplatte. Setzen Sie die Sensorkassette auf die Versorgungsplatte. Vergewissern Sie sich, dass die Enden der Sensorkartusche eingetaucht sind, um eine ausreichende Flüssigkeitszufuhr zu gewährleisten. Legen Sie sowohl die Sensorpatrone als auch die Versorgungsplatte für mindestens 10 Stunden in einen Nicht-CO2 -Inkubator bei 37 °C.
      2. Bereiten Sie ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 50 mL Calbrant vor, legen Sie es in einen Nicht-CO2 -Inkubator und inkubieren Sie es über Nacht.
      3. Bereiten Sie am Tag vor dem Assay das komplette frische Medium zur Vorbereitung des Assays vor. Bereiten Sie in insgesamt 50 ml eine Lösung aus 1 mM Pyruvat, 2 mM Glutamin und 10 mM Glucose im Testmedium vor.
  2. Führen Sie den mitochondrialen Funktionstest am nächsten Tag durch.
    1. Entfernen Sie destilliertes Wasser von der Platte, indem Sie es abschnippen. Rehydrieren Sie mit 200 μl Calibrant. Verwenden Sie das Calibrant, das über Nacht im Nicht-CO2 -Inkubator gelagert wurde. Nach dem Austausch der Sensorpatrone auf der Oberseite der Versorgungsplatte. Setzen Sie die Utility-Platte mit der Sensorkartusche wieder in den Nicht-CO2 -Inkubator ein.
      HINWEIS: Um die Platte zu schnippen, drehen Sie die Platte schnell und schnell in einer fließenden Bewegung über die Spüle, so dass das destillierte Wasser schnell aus der Platte fällt.
  3. Bereiten Sie CD8-T-Zellen vor, wie oben in den Abschnitten 1-3 beschrieben.
    1. Mit einer Mehrkanalpipette werden 200.000 Zellen pro Vertiefung plattiert, indem 10 × 106 Zellen in 4,5 ml vollständigem Medium resuspendiert und 90 μl pro Vertiefung plattiert werden. Fügen Sie dann während der Vorbehandlung weitere 90 μl des dafür vorgesehenen Mediums pro Vertiefung hinzu.
      HINWEIS: Wenn keine Vorbehandlungen vorhanden sind, plattieren Sie die Zellen in 180 μl pro Vertiefung mit einer Endkonzentration von 200.000 Zellen pro Vertiefung. Bewahren Sie die Platte ab diesem Zeitpunkt im Protokoll bei Raumtemperatur oder im Nicht-CO2 -Inkubator auf. Die Platte sollte nicht in einen 5%igen CO2 -Inkubator gestellt werden. Beachten Sie, dass das endgültige Volumen der Mikroplatte 180 μl beträgt.
  4. Bereiten Sie Vorbehandlungen vor (einschließlich Lipid- oder anderen Metaboliten-Supplementierungen).
    1. Bereiten Sie die Lipidvorbehandlung vor, indem Sie lyophilisierte Lipide mit einer Schnelldreh-Minizentrifuge aus dem Gefrierschrank herunterschleudern. Bestimmen Sie die gewünschten Konzentrationen für die Vorbehandlung und bereiten Sie die Lipidvorbehandlung auf diese Konzentrationen vor. Beschallen Sie das verdünnte Lipid unmittelbar vor der Anwendung 30 Minuten lang.
    2. Bereiten Sie Lipidcocktails vor.
      1. Bestimmen Sie die gewünschte Lipidkonzentration, die im Assay für die mitochondriale Funktion verwendet werden soll.
      2. Bereiten Sie die Lipide in einer Konzentration vor, die dem 2-fachen der gewünschten Konzentration entspricht. Fügen Sie dann die Lipidlösung zu dem vorhandenen Volumen in der Mikroplatte hinzu, um eine Verdünnung von 1:2 zu erreichen. Vervollständigen Sie dies, indem Sie 90 μl der Lipidlösung direkt zu den bereits vorhandenen 90 μl hinzufügen. Das endgültige Volumen beträgt 180 μl (1:2 Verdünnung) pro Well.
        HINWEIS: Tabelle 1 zeigt ein Beispieldiagramm eines möglichen Plattenaufbaus und -designs. Wir empfehlen, den Assay mit 5-6 technischen Replikaten durchzuführen, die sowohl naive als auch antigenspezifische Effektor-CD8-T-Zellen mit und ohne Lipidzusätze enthalten. Insbesondere ist dieses Protokoll so konzipiert, dass es eine Zentrifugation vermeidet, um zelluläre Störungen zu minimieren. Da der Assay für die mitochondriale Funktion sehr empfindlich auf die Zellzahl reagiert, ist die Reduzierung des Zellverlusts von entscheidender Bedeutung. Anstelle einer Zentrifugation werden die Zellen durch Schnippen behandelt, um ihre Integrität zu erhalten.
      3. Pipettieren Sie 180 μl des vollständigen Mediums in jede Ecke der Platte. Legen Sie die Mikrotiterplatte mit CD8 T-Zellen in einen Nicht-CO2 -Inkubator.
        HINWEIS: Die Inkubationszeit variiert je nach gewünschter Dauer der Vorbehandlung. Um den Zelltod zu minimieren, empfahlen wir eine maximale Vorbehandlung von 4 Stunden für CD8-T-Zellen. Eine Überverlängerung der Vorbehandlungszeit kann zu einem übermäßigen Zelltod führen, der die Genauigkeit der Ergebnisse beeinträchtigt.
  5. Bereiten Sie Gifte und Lösungen für akute Injektionen vor.
    1. Bereiten Sie unter Verwendung von Stammlösungen eine verdünnte Form von Oligomycin vor. Erstellen Sie eine Verdünnung von Oligomycin in 3 ml vollständigem Medium. Bereiten Sie in konischen 15-ml-Röhrchen vorsichtig Gifte und akute Injektionen vor. Da die Gifte lichtempfindlich sind, bereiten Sie diese Lösungen mit in Alufolie eingewickelten Röhrchen vor, um sie vor Lichteinwirkung zu schützen.
      1. In einem konischen 15-ml-Röhrchen, das in Zinnfolie eingewickelt ist, verdünnen Sie Oligomycin in 3 ml vollständigem Medium, so dass die Endkonzentration nach der Injektion 2,5 μM beträgt.
      2. In einem zweiten konischen 15-ml-Röhrchen, das in Zinnfolie eingewickelt ist, verdünnen Sie FCCP in 3 mL vollständigem Medium, so dass die Endkonzentration nach der Injektion 2,0 μM beträgt.
      3. In einem dritten konischen 15-ml-Röhrchen, das in Alufolie eingewickelt ist, werden Lösungen von Rotenon und Antimycin A in 3 ml vollständigem Medium hergestellt, um nach der Injektion Konzentrationen von 0,5 μM für beide Toxine zu erreichen.
      4. Wenn der Assay mit zusätzlichen metabolischen Modulatoren, Arzneimitteln oder Stimulationen durchgeführt wird, verdünnen Sie diese Wirkstoffe in vollständigem Medium. Wenn Sie planen, Etomoxir oder andere metabolische Modulatoren und Arzneimittel zu verwenden, führen Sie zunächst einen Assay durch, um die Titrationskurve zu testen und die optimale Konzentration für die Verwendung zu bestimmen. Bei einer TCR-Stimulation durch akute Injektion kann der Assay entweder mit anti-CD3/anti-CD28-Magnetbeads oder einer Kombination aus plattengebundenem anti-CD3-Biotin und anti-CD28-Streptavidin durchgeführt werden.
        HINWEIS: Weitere Beschreibungen finden Sie in Abschnitt 5, in dem das Protokoll für die TCR-Stimulation mit akuter Anti-CD3/CD28-Injektion beschrieben wird.
    2. Entfernen Sie die Sensorpatrone aus dem Nicht-CO2 -Inkubator. Pipettieren Sie die Gifte mit den Plattenadaptern in die Sensorpatrone. Platzieren Sie die Plattenadapter so, dass jede Kammer speziell mit Giften oder anderen akuten Injektionen beladen werden kann.
      HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Gifte pipettieren.
      1. Laden Sie Gifte in die Anschlüsse der Sensorpatrone. Wenn keine weiteren Injektionen durchgeführt werden, werden die Ports A-C mit Giftstoffen belastet. Pipettieren Sie 20 μl Oligomycin in Port A, 22 μl FCCP in Port B, 25 μl Rotenon in Port C und 25 μl Antimycin A in Port C.
  6. Legen Sie die Mikroplatte eine Stunde vor Beginn des Assays auf dem Gerät in den Nicht-CO2 -Inkubator.
  7. Öffnen Sie vor dem Starten des Geräts die Software und kalibrieren Sie das Gerät. Führen Sie diese Aufgabe 30 Minuten vor dem Einlegen der Mikroplatte in das Gerät durch, um genügend Zeit für die Kalibrierung zu gewährleisten.
    1. Beschriften Sie im Softwaresystem die Vertiefungen und überprüfen Sie das Injektionsschema.
    2. Legen Sie während der Kalibrierung die Sensorkartusche in das Gerät ein. Die Software fordert Sie auf, die Initialisierung und Qualitätsprüfung abzuschließen. Bei der Kalibrierung werden pH und O2 an jeder Vertiefung bewertet, die entweder bestanden oder nicht bestanden werden. Das Gerät meldet die Ergebnisse auf dem Bildschirm mit einem Häkchen oder einem "X" an.

5. Durchführung einer modifizierten Version des mitochondrialen Funktionsassays mit TCR-Stimulation in einem separaten Experiment mit einer akuten Anti-CD3/CD28-Injektion

HINWEIS: Der mitochondriale Funktionsassay kann mit einer akuten TCR-Simulation über zwei verschiedene Ansätze durchgeführt werden, indem entweder 1) biotinyliertes Anti-CD3 + Anti-CD28 + Streptavidin verwendet wird, wie in Schritt 5.2 beschrieben, oder 2) anti-CD3/CD28 magnetische Kügelchen, die in Schritt 5.3 beschrieben sind. Diese separaten Experimente dienen beide dazu, den TCR über eine akute Injektion während des Assays zu stimulieren.

  1. Wenn Sie zusätzliche Injektionen durchführen, bereiten Sie den Assay wie im vorherigen Abschnitt 4 beschrieben vor. Ändern Sie die Injektionsschemata mit Hilfe der zusätzlichen Kammer für die Injektion. Bei diesem Protokoll werden Anti-CD3/Anti-CD28 in Anschluss A der Sensorkassette geladen. Laden Sie dann die anderen Ports auf ähnliche Weise, mit Oligomycin in Port B, FCCP in Port C und Rotenon und Antimycin A in Port D.
  2. Biotinylierte Anti-CD3 + Anti-CD28 + Streptavidin-Komponenten vorbereiten und laden.
    1. Pipettieren Sie 20 μl biotinyliertes Anti-CD3 in einer Menge von 10 μg/ml in die dafür vorgesehenen Vertiefungen in der Sensorpatrone.
    2. Pipettieren Sie 20 μl Anti-CD28 mit 2 μg/ml + Streptavidin mit 20 μg/ml in die dafür vorgesehenen Vertiefungen in der Sensorpatrone.
    3. Pipettieren Sie 20 μl biotinyliertes Anti-CD3 mit 10 μg/ml + Anti-CD28 mit 2 μg/ml + Streptavidin mit 20 μg/ml in die dafür vorgesehenen Vertiefungen in der Sensorpatrone.
    4. Stellen Sie sicher, dass die Kontrollbohrungen vorbereitet sind. Stellen Sie sicher, dass es ausgewiesene Vertiefungen gibt, in die nur biotinyliertes Anti-CD3, Anti-CD28 + Streptavidin und biotinyliertes Anti-CD3 + Anti-CD28 + Streptavidin injiziert werden.
  3. Mit einem Bead-to-Cell-Verhältnis von 1:1 können Sie magnetische Anti-CD3/CD28-Beads vorbereiten und laden.
    1. Pipettieren Sie in einer Platte mit 200.000 Zellen pro Vertiefung 5 μl magnetische Kügelchen in die dafür vorgesehenen Vertiefungen in der Sensorpatrone.
    2. Bereiten Sie die dafür vorgesehenen Kontrollvertiefungen mit Medien nur für die Injektion vor.
  4. Passen Sie das Volumen der Gifte so an, dass die endgültigen Konzentrationen nach der Injektion 2,5 μM für Oligomycin, 2,0 μM für FCCP und 0,5 μM für Rotenon und Antimycin A betragen.
  5. Stellen Sie sicher, dass das Injektionsschema geändert wird, um die aktualisierten Zeitpunkte vor dem Laden der Mikroplatte auf das Gerät widerzuspiegeln.
  6. Programmieren Sie die Software so, dass die akute TCR-Stimulation insgesamt 140 Minuten lang ausgeführt wird. Ändern Sie innerhalb dieses Zeitrahmens das Schema so, dass vor der Oligomycin-Injektion x10-Zeitpunktmessungen durchgeführt werden.

Ergebnisse

Die glykolytischen und oxidativen metabolischen Kapazitäten können mit einem mitochondrialen funktionellen Assay gemessen werden, der die Kapazitäten bewertet, indem Komponenten der Elektronentransportkette zu bestimmten Zeitpunkten angegriffen werden (Abbildung 2A). Verschiedene Injektionsschemata können auf die Anschlüsse der Sensorkartuschen geladen werden, um den herkömmlichen Assay zu modifizieren und die akute TCR-Stimulation zu beurteilen (

Diskussion

In diesem Artikel skizzieren wir ein Protokoll zur Beurteilung der mitochondrialen Funktion von naiven und Effektor-CD8-T-Zellen. Wir beschreiben und vergleichen Methoden zur Präparation sowohl antigenspezifischer als auch polyklonaler CD8 T-Zellen mit Hilfe von OT-I- und C57BL/6-Mäusen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass es trotz der Methode der Aktivierung und Vorbehandlung in CD8-T-Zellen ähnliche Trends im Stoffwechsel gibt. Die Daten zeigen, dass die antigenspezifische Aktivierung zu...

Offenlegungen

Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen offenzulegen.

Danksagungen

Die Hertz Foundation, die Amy Davis Foundation, die Moore Family Foundation und die Heidi Horner Foundation haben uns unschätzbar unterstützt, wofür wir dankbar sind. Diese Arbeit wurde zum Teil auch durch NIH-Zuschüsse an RMT (AI052157, AI136534) unterstützt, während JAT durch das Hertz Graduate Fellowship unterstützt wurde.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Antimycin ASigma-AldrichA8674
Anti-CD28Biolegend102116
Anti-CD3/CD28 DynabeadsThermoFisher11456D
Biotinylated anti-CD3Biolegend317320
Bovine Serum AlbuminSigma-Aldrich108321-42-2
CD8a+ T cell isolation kitMiltenyi Biotec130-104-075
Cell Strainers (100 µm)CELL TREAT229485
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma-AldrichE8008
FicollSigma-Aldrich26873-85-8density gradient medium 
FCCP ((4-(trifluoromethoxy) phenyl) carbonohydrazonoyl dicyanide)Sigma-AldrichC2920
GlucoseSigma-AldrichG-6152
GlutamineSigma-AldrichG7513
LS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401Positive selection columns
Magnetic cell separation columnMiltenyi Biotec130-042-301
MicroplateAgilent102601-100
OligomycinSigma-Aldrich75351
PyruvateSigma-Aldrich113-24-6
Recobinant IL-2PeproTech200-02
RotenoneSigma-AldrichR8875
Seahorse mediaAgilent103576-100
Sensor cartridgeAgilent102601-100
StreptavidinSigma-AldrichA9275
Sterile 6 well plateCELL TREAT230601
Sterile 24 well plateCELL TREAT229524
XF CalibrantAgilent102601-100

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