JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

CD8 T hücre biyoenerjetik değerleri Mito Stres Testi kullanılarak sorgulanabilir. Bu metodoloji, akut ve kronik metabolik programlamayı incelemek için kullanılabilir. Bu protokol, T hücresi reseptör biyolojisi ve biyoenerjetik analiz arasındaki ilişkileri incelemek için yaklaşımları açıklar.

Özet

İmmünometabolizmanın lenfositlerin işlevini, farklılaşmasını ve kaderini nasıl etkilediğini anlamak önemli bir ilgi ve dikkat çekmiştir. Lenfosit biyolojisi, biyoenerjetik analiz kullanılarak araştırılmıştır ve şimdi bu alanda kritik bir ithalat aracı haline gelmiştir. Bu nedenle, reseptör stimülasyonları için ön tedaviler ve akut enjeksiyon ile uyarlanabilen bir biyoenerjetik analiz testini optimize etmeye çalıştık. Burada, naif ve efektör CD8 T hücrelerinde oksijen tüketimi ve hücre dışı asitlenme oranlarını değerlendirmek için Hücre Mito Stres Testi kullanarak CD8 T hücresi ex vivo metabolizmasını değerlendirdik. Antijene özgü efektör CD8 T hücreleri ex vivo stimülasyon yoluyla türetildi ve naif CD8 T hücreleri splenositlerden toplandı ve manyetik boncuk kolon ayrımı ile izole edildi.

Ön işlemler mikroplakalarda yapılır ve sensör kartuşlarının nasıl hazırlanacağını detaylandırırız. Enjeksiyon portlarının metabolik kapasiteleri dolaylı olarak ölçmek için ilaçlarla nasıl yüklenebileceğini ve metabolik modülatörlerle bu protokolün spesifik enzim aktivitesini incelemek için kullanılabileceğini gösteriyoruz. T hücresi reseptör stimülasyonları, akut enjeksiyon ve enjeksiyon portları kullanılarak anti-CD3 / CD28 ile stimülasyon ile gerçek zamanlı olarak incelenebilir. Ölçümler ve veri toplama için cihaz analizörleri kullanılır ve hücresel metabolizmayı yorumlamak için yazılım programları ile veri görselleştirme yapılır. Bu strateji, bağışıklık hücresi biyolojisi ve mitokondriyal biyoenerjetik hakkında kapsamlı miktarda veri üretir ve araştırmacıların protokolü CD8 T hücre metabolizmasını keşfetmek için çeşitli şekillerde özelleştirmelerine olanak tanır.

Giriş

Bağışıklık hücrelerinin kaderi ve işlevselliği metabolizma, oksidatif tüketim ve anaerobik solunumdan önemli ölçüde etkilenir 1,2,3,4. Son zamanlarda, CD8 T hücresi kaderini ve efektör fonksiyonunu yeniden programlamak veya canlandırmak ve viral klerensi iyileştirmek veya endojen anti-tümör bağışıklığını geliştirmek için bir strateji olarak metabolik modülasyonu hedeflemeye artan bir ilgi olmuştur 5,6,7,8,9. Özellikle, T hücresi reseptörü (TCR) yoluyla antijen reseptörü sinyali, CD8 T hücresi farklılaşması için temel bir gerekliliktir ve bu da aşağı akış sinyalizasyonu ve aktivasyon10,11,12 ile sonuçlanır (Şekil 1). İmmünolojik hakaretlere uzun süre maruz kalmak, TCR üzerinde kalıcı antijene özgü stimülasyona neden olur ve sonunda kronik olarak iltihaplı durumlara, T hücresi yorgunluğuna, bağışıklık mikroçevresinin yeniden şekillenmesine ve bağışıklık kaçışına yol açar 11,13,14,15,16,17,18,19.

Tükenmiş CD8 T hücrelerinin metabolizması, fonksiyonel efektör CD8 T hücrelerinin 2,3,14,15,18,20 metabolizmasından temel olarak farklıdır. T hücresi farklılaşması, interferon γ (IFNy) sekresyonu ve hatırlama kapasitesi, kısmen mitokondriyal fonksiyon ve β-oksidasyon parçalanma ürünleri ile belirlenir. IFNγ+ CD8 T hücreleri, hem anti-tümör hem de anti-viral immün yanıtların kritik bileşenleridir 21,22,23. Glikoliz ve elektron taşıma zinciri yoluyla spesifik metabolik akı, CD8 T hücre aktivasyonu, sitokin sekresyonu ve hafıza tepkileri için önemlidir 4,11,13,15,18,24,25,26,27,28 . T hücresi aktivasyonu ve efektör farklılaşması dahil olmak üzere optimal yanıtlar, koordineli ve spesifik bir mitokondriyal yanıt gerektirirken, mitokondriyal kusurlar ve aşırı reaktif oksijen türleri (ROS) bitkin veya işlevsiz T hücrelerini karakterize eder 9,29. Son zamanlarda, CD8 T hücrelerinin in vitro olarak kalıcı TCR stimülasyonu, kısmen oksidatif stresi indükleyerek ve T hücresi proliferasyonu için gerekli oksidatif metabolizmayı ve metabolik kapasiteleri yeniden programlayarak CD8 T hücresi kapsamlı farklılaşmasını teşvik eder 1,2,13,20,24,29 . Toplamda, metabolik kontrol eksenleri, CD8 T hücresi farklılaşmasını ve bunların efektör, hafıza veya tükenmiş / işlevsiz fenotiplere ilerlemesini yönlendirmede kritik bileşenlerdir.

Metabolik bileşikler ayrıca otokrin veya parakrin sinyal molekülleri olarak işlev görerek bağışıklık hücresi tepkilerini yönlendirir 9,30,31,32,33,34,35. Sfingosin-1-fosfat (S1P) ve lizofosfatidik asit (LPA), CD8 T hücreleri tarafından lenfosit çıkışını ve sitotoksisiteyi modüle etmek için G-proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) aracılığıyla sinyal veren biyoaktif ve inflamatuar lipidlerdir36. GPCR aracılığıyla LPA sinyali CD8 T hücreleri üzerindeki LPA reseptörleri, lipoliz, yağ asidi oksidasyonu ve proton sızıntısını artırmak için metabolizmayı yeniden programlar9. Toplamda, CD8 T hücrelerinin biyoenerjetik ve metabolizması büyük ölçüde substrat mevcudiyeti, çevresel ipuçları ve enerjik gereksinimler tarafından yönlendirilir.

CD8 T hücre metabolizmasını sorgulamak için metodolojiler giderek daha önemli hale geldi. Hücre Mito Stres Testi, biyoenerjetiğin kapsamlı bir değerlendirmesini sağlar ve şu anda immünometabolizma ve CD8 T hücre enerjisi alanında ayırt edici bir teknik olarak kabul edilmektedir 9,37. Yapışık hücreler tarihsel olarak Mito Stres Testi testi38 için kullanılmıştır; bununla birlikte, bu protokolün süspansiyon halinde büyütülen hücreler için uygulanmasına ve özellikle Hücre Mito Stres Testi testi için bağışıklık hücrelerinin kullanılmasına artan bir ilgi vardır. Burada, CD8 T hücrelerinin metabolik aktivitesini ölçmek için son yayınımız9'a dayanarak ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Hücre Mito Stres Testi testinde CD8 T hücrelerinin genişlemesi, naif CD8 T hücre izolasyonu, test hazırlığı ve hem ön tedaviler hem de akut enjeksiyonlar için protokollerle tedavi hakkında ayrıntılı bir açıklama sunuyoruz. Daha da önemlisi, poliklonal ve antijene özgü TCR stimülasyonu dahil olmak üzere TCR stimülasyonu ve CD8 T hücre aktivasyonu için birden fazla yöntemi karşılaştırıyor ve karşılaştırıyoruz.

Bu protokol, tüm fare T hücrelerinin aynı Vα2 ve Vβ5 genlerini eksprese ettiği OT-I transgenik fareler (klasik bir transgenik fare modeli) kullanılarak antijene özgü stimülasyonu detaylandırır39. OT-I fare CD8 T hücrelerinin tümü, ovalbümin oktapeptidine (OVA257-264 , ayrıca amino asit dizisi SIINFEKL veya N4 olarak da yazılır, majör histouyumluluk kompleksi (MHC) sınıf I tarafından sunulduğunda, sitotoksik CD8 T hücrelerini39 aktive eden, yaygın olarak çalışılmış bir epitop olarak da yazılır (Şekil 1A). Genel olarak, OT-I transgenik fare modeli, immünologlar tarafından TCR sinyalini ve antijene özgü T hücresi efektör fonksiyonunu incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. OT-I fare modeli ile monoklonal aktivasyonun aksine, poliklonal CD8 T hücreleri, TCR CD3 alt birimlerine ve CD28 ko-stimülatör molekül40'a karşı anti-CD3 / CD28 antikorları ile üretilebilir (Şekil 1B). Anti-CD3 / CD28 antikorları, T hücrelerinin40 poliklonal popülasyonunu aktive etmek için TCR sinyalinin antijene özgü bileşenini atlar. Sonuç olarak, bu raporda açıklanan sonuçlar, CD8 T hücrelerinde dinamik metabolik akıyı ölçmek için Hücre Mito Stres Testini kullanmak için birden fazla yöntemi karşılaştırır.

Protokol

Fareler patojen içermeyen bir ortamda tutuldu ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi standartlarına ve düzenlemelerine göre bakımı yapıldı.

1. Antijene özgü stimülasyon yoluyla CD8 T hücrelerinin oluşturulması ve genişletilmesi

  1. İlk gün, OT-I farelerinden elde edilen splenositleri hasat edin; daha sonra bunları SIINFEKL (4) peptidi ile in vitro olarak hazırlayın ve aktive edin.
    1. Davlumbaz alanını temizleyin, reaktifleri hazırlayın ve fare ortamını toplayın. Fare ortamını bir su veya boncuk inkübatöründe ısıtın.
      1. 6 oyuklu bir plakada, 7 mL fare ortamını bir oyuğa ve ardından 3 mL fare ortamını farklı bir oyuğa koyun. Daha sonra, 7 mL ortam içeren kuyucuğa bir süzgeç yerleştirin.
    2. Bir fareyi vivaryumdan bir transfer kafesinde laboratuvara getirin. Fareyi boş yeni bir kafese aktarın ve CO2 adaptörünü üstüne yerleştirin. Fareyi CO2 ile 2.75 akış seviyesine kadar ötenazi yapın.
      1. Fareyi dikkatlice izleyin ve herhangi bir sıkıntı belirtisi olup olmadığını gözlemleyin. Son nefesten sonra, en az 1 dakika boyunca solunum ve yaşam belirtilerini izleyin. CO2'yi kapatın ve ikincil ötenazi yöntemi olarak servikal çıkık yapın. Ardından tezgahı, kafesi ve çalışma alanının geri kalanını temizleyin ve fareyi diseksiyon başlığına taşıyın.
    3. Dalağı fareden çıkarın.
      1. Diseksiyon ekipmanını sterilize etmek için% 70 etanol kullanın ve fareyi sol tarafı aşağı gelecek şekilde yerleştirin, dezenfekte etmek için farenin sol tarafına püskürtün.
      2. Temiz aletler kullanarak, cildi çıkarmak ve peritonu tanımlamak için diseksiyon yapın. Dalağı bulmak için peritondan küçük bir kesi yapın ve ardından dalağı çıkarın. Dalağı süzgecin üstündeki 6 oyuklu plakaya koyun.
      3. Alanı temizleyin, fare karkasını bir atık torbasına koyun ve ardından torbayı bertaraf etmek için bir dondurucuya koyun.
      4. Tüm alanın temiz olduğundan emin olun ve sonraki adımlar için 6 oyuklu plakayı doku kültürü başlığına taşıyın.
    4. Doku kültürü davlumbazında, dalağı homojenize edin ve hücreleri topaklar olmadan tek hücreli bir süspansiyon halinde yeniden süspanse edin.
      1. Dalağı süzgeçten geçirerek 5 mL'lik bir şırınganın pistonu ile 7 mL ortam ile kuyuya itin.
      2. Ek kuyucukta 3 mL ortam kullanarak süzgeci ve kalan dokuyu durulayın.
      3. Hücre süspansiyonunu serolojik bir pipet ile yeni bir 10 mL konik tüpe aktarın.
      4. 500 × g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı bir cam pipet kullanarak aspire edin.
    5. Kırmızı kan hücrelerini parçalayın.
      1. Hücreleri ACK lizis tamponunda yeniden süspanse ederek ve oda sıcaklığında 1-5 dakika inkübe ederek 1 mL ACK lizis tamponu kullanarak kırmızı kan hücresi lizisi işlemine başlayın.
        NOT: İnkübasyon süresi, minimum splenosit ölümü ile maksimum kırmızı hücre lizizini elde etmek için spesifik ACK lizis tamponu partisine göre optimize edilmelidir.
      2. Nötralizasyon için konik tüpe 10 mL ortam ekleyin ve 500 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
      3. Hücreleri 50 mL ortamda yeniden süspanse edin ve bir T75 şişesine aktarın.
    6. Hücreleri SIINFEKL (N4) peptidi ile uyarın.
      1. SIINFEKL peptidini doku kültürü başlığına getirin. SIINFEKL peptidini -20 °C'de saklayın.
      2. 2 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için SIINFEKL'i doğrudan ortama ekleyin. 2 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 50 mL ortama 50 μL SIINFEKL (2 mg / mL) ekleyin.
    7. Hücreleri 37 ° C'de 72 saat inkübe edin.
    8. Doku kültürü başlığını %70 etanol kullanarak sterilize edin.
  2. Dördüncü günde, peptidi çıkarmak için hücreleri yıkayın. IL-2 ile desteklenmiş taze hazırlanmış ortamı kullanarak, hücreleri yeniden süspanse edin ve ardından şişeyi inkübatöre geri koyun.
    1. Hücreleri T75 doku kültürü şişesinden 50 mL'lik konik bir tüpte toplayın. OT-I CD8 T hücrelerini santrifüjleyin ve peletleyin ve ardından fazla ortamı aspirasyonla çıkarın. 1.000 U / mL IL-2 içeren 50 mL yeni fare ortamı ekleyin ve hücreleri yeni bir T75 şişesine aktarın.
    2. Saklama için, IL-2 stoğunun alikotlarını -80 °C'de bir dondurucuda saklayın. -80 °C'de depolama, peptit bozulmasını en aza indirecektir.
  3. Mitokondriyal fonksiyon testi için genişletilmiş antijene özgü sitotoksik CD8 T hücreleri hazırlayın
    1. Yedinci günde, mitokondriyal fonksiyon testi yapılır. Test için antijene özgü OT-I CD8 T hücresini hazırlayın.
    2. Canlı CD8 T hücrelerini toplayın.
      1. Hücreleri T-75 doku kültürü şişesinden 50 mL'lik yeni bir konik tüpe aktarın. Daha sonra konik tüpü 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüjleyin.
      2. 50 mL'lik yeni bir konik tüpte, hücreler dönerken 20 mL yoğunluk gradyanlı bir ortam (yoğunluk = 1.077 g/mL) pipetleyin.
      3. Santrifüjleme tamamlandıktan sonra, konik tüpü alın ve 10 mL ortam kullanarak hücreleri yeniden süspanse edin. Ardından, çok yavaş pipetleyerek, yeniden askıya alınan hücreleri yoğunluk gradyanının üzerine yerleştirin. Eğimi bozmadan, konik boruyu 1.300 × g'da oda sıcaklığında 20 dakika boyunca santrifüjleyin ve ayar frensiz olarak maksimum hızlanma ve minimum yavaşlamaya ayarlanmıştır.
      4. Santrifüjleme tamamlandığında, T hücrelerinin orta katmanını toplamak için bir P1000 pipeti kullanın. Hücresel katmanı görselleştirin ve pipetin yukarıda kaldığından ve katmanı rahatsız etmediğinden emin olun. Toplanan hücreleri, 30 mL tam fare ortamı içeren 50 mL'lik taze bir konik tüpe aktarın. Daha sonra 50 mL konik tüpü 500 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Santrifüjleme tamamlandığında, OT-I CD8 T hücrelerinden fazla süpernatanı aspire edin. 20 mL taze fare ortamı ile hücreleri yeniden süspanse edin.
    3. Bir hemositometre kullanarak, toplam canlı hücre sayısını sayın. Ölü hücreleri tanımlamak için küçük bir hücre alikotunu 1: 4 seyreltmede tripan mavisi ile boyayın.
      NOT: Bir OT-I fareden yaklaşık 40-60 × 106 hücre beklenebilir.
    4. Ek bir santrifüjleme adımıyla, kalan hücreleri 20 mL ilave taze fare ortamı ile yıkayın. Daha sonra bir mikroplaka kullanarak, hücreleri tam fare ortamında 200.000 hücre / kuyu pipetleyin.

2. Anti-CD3 / anti-CD28 stimülasyonu yoluyla poli-spesifik CD8 T hücrelerinin üretilmesi ve genişletilmesi

  1. 0. Günde, 24 oyuklu bir plakayı CD3'te kaplayın. 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna PBS içinde seyreltilmiş 5 μg / mL konsantrasyonda 1 mL anti-CD3-biyotin ekleyin. Plakayı gece boyunca nemlendirilmiş,% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin.
  2. Ertesi gün, bir fareyi hasat edin ve splenositleri toplayın. Splenositleri in vitro olarak anti-CD3 / anti-CD28 ile 1.1.1-1.1.5.3 adımlarını izleyerek aktive edin.
  3. Manyetik boncuk ayırma protokolünü kullanarak CD8 T hücrelerini izole edin.
    NOT: Hücrelerin soğuk tutulduğundan emin olun. Önceden soğutulmuş koşullar altında hızlı çalışın.
    1. 40 μL MACS tamponu kullanarak, hücreleri 40 μL MACS tamponu başına 10.000.000 hücre ile yeniden süspanse edin. Çözeltiye göre, 10 μL biyotin antikor kokteylini hücre çözeltisine iyice karıştırın ve ardından 4 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
    2. Hücrenin buzdolabında inkübe edilmesini beklerken, pozitif seçim için bir sütun hazırlayın. Kolonu yıkamak için 3 mL tampon kullanın ve ardından atık akışını atın.
    3. 5 dakika sonra, hücre-antikor çözeltisini buzdolabından toplayın ve 10.000.000 hücre başına 30 μL MACS tamponu, 20 μL anti-biyotin ekleyin ve ardından 10 dakika daha 4 ° C'de inkübe edin.
    4. 15 mL'lik yeni bir konik tüp kullanarak pozitif bir seçim sütunu altında yeni bir toplama tüpü hazırlayın. 10 dakikalık inkübasyon tamamlandıktan sonra, hücre süspansiyonunu pozitif seçim sütununa aktarın. 15 mL'lik taze bir konik tüpte akışı toplayın. 3 mL MACS tamponu kullanarak, artık hücreleri toplamak için sütunu yıkayın.
      NOT: Hücre süspansiyonunun minimum 0.5 mL hacimde olduğundan emin olun.
    5. Anti-CD3 / anti-CD28 stimülasyonu için 24 oyuklu plakada pozitif olarak seçilmiş CD8 T hücrelerini yeniden plakalayın.
      1. Akışı 500 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Fazla süpernatanı aspire edin ve hücreleri çözelti içinde yeniden süspanse etmek için pipetleyin. Bir hemasitometre ve tripan mavisi kullanarak hücreleri sayın.
        NOT: Lütfen fare dalağı başına ~ 8-10 × 106 canlı hücrenin sayılmasını bekleyin.
      2. Hücreleri saydıktan sonra, CD8 T hücrelerini mL başına 500.000 hücrede yeniden askıya alın. Daha sonra, 24 oyuklu plakadan 1 mL PBS'yi dikkatlice aspire edin, 24 oyuklu plakada sayılan hücreleri yeniden plakalayın ve oyuk başına 106 hücre ekleyin.
      3. Hücreleri uyarmak için, anti-CD28'i 24 oyuklu plakaya pipetleyin, böylece anti-CD28'in nihai konsantrasyonu 2 μg / mL olur. Hücreleri karıştırmak için, plakaya dikkatlice vurun. Hücreleri sonraki 72 saat boyunca 37 °C'de tutun.
  4. % 70 etanol kullanarak doku kültürü başlığını temizleyin.
  5. 4. Günde (72 saat sonra), hücreleri anti-CD3 / anti-CD28 stimülasyonundan çıkarın. Poliklonal CD8 T hücrelerini santrifüjleyerek hücreleri yıkayın. Fazla süpernatanı aspirasyon ile çıkarın ve daha sonra hücreleri 10 mL medya ile 1.000 birim / mL IL-2 ile taze fare ortamı ile yeniden süspanse edin. Yeniden askıya alınan hücreleri 6 oyuklu yeni bir plakaya aktarın ve inkübatöre yerleştirin.
    BILGINIZE: 1.2.2. Depolama için, IL-2 stoğunun alikotları -80 ° C'de bir dondurucuda saklanabilir. -80 °C'de depolama, peptit bozulmasını en aza indirecektir.
  6. Mitokondriyal fonksiyon deneyi için genişletilmiş poliklonal efektör CD8 T hücrelerini hazırlayın.
    1. Yedinci günde, poliklonal CD8 T hücrelerini test için hazırlayın ve işleyin.
    2. Canlı CD8 T hücrelerini toplayın.
      1. Hücreleri 6 oyuklu plakadan bir pipet kullanarak temiz bir konik tüpe aktarın, ardından hücreleri 500 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
      2. 1.3.3.2-1.3.4 adımlarını izleyin.
        NOT: Tek bir C57BL/6 fareden yaklaşık 10-30 milyon canlı CD8 T hücresi beklenebilir.
      3. CD8 saflığını değerlendirmek için akış sitometrisi için bir dizi hücre kaydedin. Akış sitometrisi için, hücreleri 20 dakika boyunca buzüzerinde 9 tercih edilen bir canlılık boyası ile boyayın.

3. Naif CD8 T hücrelerini hasat edin

  1. Yedinci günde, 1.1.1-1.1.5.3 adımlarını izleyerek bir fareden splenositleri hasat edin.
  2. Adım 2.3-2.3.5.1'de açıklanan manyetik boncuk tabanlı protokolü kullanarak CD8 T hücre izolasyonunu gerçekleştirin.
  3. Mikroplakadaki CD8 T hücrelerini, tam ortamda 200.000 hücre / kuyu başına plaka.

4. Mitokondriyal fonksiyon testini gerçekleştirin

  1. Mitokondriyal fonksiyon testini çalıştırmadan bir gün önce malzemeleri hazırlayın.
    1. Sensör kartuşunu nemlendirin.
      1. Yardımcı plakanın her bir kuyucuğuna 200 μL damıtılmış su pipetleyin. Sensör kartuşunu yardımcı plakanın üzerine yerleştirin. Uygun hidrasyonu sağlamak için sensör kartuşunun uçlarının suya daldırıldığını kontrol edin. Hem sensör kartuşunu hem de yardımcı plakayı CO2 olmayan bir inkübatöre 37 °C'de en az 10 saat boyunca koyun.
      2. 50 mL Kalbrant içeren 50 mL'lik bir konik tüp hazırlayın ve CO2 olmayan bir inkübatöre yerleştirin ve gece boyunca inkübe edin.
      3. Tahlilden bir gün önce, tahlil için hazırlık olarak tam taze ortamı hazırlayın. Toplam 50 mL'lik bir çözeltiyi test ortamında 1 mM piruvat, 2 mM glutamin ve 10 mM glikoz çözeltisi hazırlayın.
  2. Ertesi gün mitokondriyal fonksiyon testini gerçekleştirin.
    1. Damıtılmış suyu elektrik plakasından hafifçe vurarak çıkarın. 200 μL Kalibrant ile rehidrate edin. Gece boyunca CO2 olmayan inkübatörde saklanan Kalibrantı kullanın. Yardımcı plakanın üstündeki sensör kartuşunu değiştirdikten sonra. Sensör kartuşlu yardımcı plakayı CO2 olmayan inkübatöre geri koyun.
      NOT: Plakayı hafifçe vurmak için, damıtılmış suyun plakadan hızla düşmesi için plakayı lavabo üzerinde tek bir sıvı hareketiyle hızlı ve hızlı bir şekilde ters çevirin.
  3. CD8 T hücrelerini yukarıda bölüm 1-3'te açıklandığı gibi hazırlayın.
    1. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 4.5 mL tam ortamda 10 ×10 6 hücreyi yeniden süspanse ederek ve kuyu başına 90 μL kaplayarak oyuk başına 200.000 hücre plakalayın. Ardından, ön işlem sırasında oyuk başına 90 μL daha belirlenmiş ortam ekleyin.
      NOT: Herhangi bir ön işlem yoksa, hücreleri oyuk başına 180 μL'de kaplayın ve nihai konsantrasyon oyuk başına 200.000 hücredir. Protokolde bu noktadan itibaren, plakayı ortam oda sıcaklığında veya CO2 olmayan inkübatörde tutun. Plaka% 5 CO2 inkübatöre yerleştirilmemelidir. Mikroplakanın nihai hacminin 180 μL olacağını unutmayın.
  4. Ön tedaviler hazırlayın (lipid veya başka bir metabolit takviyesi dahil).
    1. Hızlı sıkmalı bir mini santrifüj kullanarak dondurucudan liyofilize lipidi döndürerek lipid ön işlemi hazırlayın. Ön işlem için istenen konsantrasyonları belirleyin ve lipid ön işlemini bu konsantrasyonlara hazırlayın. Seyreltilmiş lipiti kullanmadan hemen önce 30 dakika boyunca sonikleştirin.
    2. Lipid kokteylleri hazırlayın.
      1. Mitokondriyal fonksiyon testinde kullanılacak istenen lipid konsantrasyonunu belirleyin.
      2. Lipitleri istenen konsantrasyonun 2 katı olan bir konsantrasyonda hazırlayın. Ardından, 1:2 seyreltme elde etmek için lipit çözeltisini mikroplakadaki mevcut hacme ekleyin. Bunu, önceden var olan 90 μL'ye doğrudan 90 μL lipit çözeltisi ekleyerek tamamlayın. Nihai hacim, kuyu başına 180 μL (1:2 seyreltme) olacaktır.
        NOT: Tablo 1 , olası bir plaka kurulumu ve tasarımının örnek bir diyagramını detaylandırmaktadır. Testin, lipid katkı maddeleri olan ve olmayan hem naif hem de antijene özgü efektör CD8 T hücrelerini içeren 5-6 teknik kopya ile yapılmasını öneriyoruz. Özellikle, bu protokol, hücresel bozulmayı en aza indirmek için santrifüjlemeyi önlemek için tasarlanmıştır. Mitokondriyal fonksiyon testi hücre sayılarına karşı oldukça hassas olduğundan, hücre kaybını azaltmak kritik öneme sahiptir. Santrifüjleme yerine, hücreler bütünlüklerini korumak için fiske vurularak işlenir.
      3. Plakanın her bir köşesine 180 μL tam ortam pipetleyin. CD8 T hücreli mikroplakayı CO2 olmayan bir inkübatöre yerleştirin.
        NOT: Kuluçka süresi, istenen ön işlem uzunluğuna bağlı olarak değişecektir. Hücre ölümünü en aza indirmek için, CD8 T hücreleri için maksimum 4 saatlik ön işlem önerdik. Ön tedavi süresinin aşırı uzaması, sonuçların doğruluğunu etkileyen aşırı hücre ölümüne neden olabilir.
  5. Akut enjeksiyonlar için zehirler ve çözeltiler hazırlayın.
    1. Stok çözeltileri kullanarak, seyreltilmiş bir oligomisin formu hazırlayın. 3 mL tam ortamda bir oligomisin seyreltmesi oluşturun. 15 mL'lik konik tüplerde dikkatli bir şekilde zehirler ve akut enjeksiyonlar hazırlayın. Zehirler ışığa duyarlı olduğundan, ışığa maruz kalmaktan korumak için bu çözeltileri kalay folyoya sarılmış tüpler kullanarak hazırlayın.
      1. Kalay folyoya sarılmış 15 mL'lik bir konik tüpte, oligomisin'i 3 mL tam ortamda seyreltin, böylece nihai konsantrasyon enjeksiyondan sonra 2.5 μM olur.
      2. Kalay folyoya sarılmış ikinci bir 15 mL konik tüpte, FCCP'yi 3 mL tam ortamda seyreltin, böylece nihai konsantrasyon enjeksiyondan sonra 2.0 μM olur.
      3. Kalay folyoya sarılmış üçüncü bir 15 mL konik tüpte, enjeksiyondan sonra her iki toksin için 0.5 μM konsantrasyonlar elde etmek için 3 mL tam ortamda rotenon ve antimisin A çözeltileri oluşturun.
      4. Test ek metabolik modülatörler, ilaçlar veya stimülasyonlarla gerçekleştiriliyorsa, bu ajanları tam ortamda seyreltin. Etomoksir veya diğer metabolik modülatörleri ve ilaçları kullanmayı planlıyorsanız, önce titrasyon eğrisini test etmek ve kullanım için en uygun konsantrasyonu belirlemek için bir test yapın. Akut enjeksiyon yoluyla bir TCR stimülasyonu yapılıyorsa, test, anti-CD3 / anti-CD28 manyetik boncuklar veya plakaya bağlı anti-CD3-biyotin ile anti-CD28 streptavidin kombinasyonu kullanılarak gerçekleştirilebilir.
        NOT: Ek açıklamalar için, akut anti-CD3/CD28 enjeksiyonu ile TCR stimülasyonu protokolünü açıklayan bölüm 5'e bakın.
    2. Sensör kartuşunu CO2 olmayan inkübatörden çıkarın. Plaka adaptörlerini kullanarak zehirleri sensör kartuşuna pipetleyin. Plaka adaptörlerini, her bir hazne özel olarak zehirler veya diğer akut enjeksiyonlarla yüklenebilecek şekilde yerleştirin.
      NOT: Zehirleri pipetlerken dikkatli olun.
      1. Sensör kartuşunun bağlantı noktalarına zehirler yükleyin. Ek enjeksiyon yapılmazsa, AC portları zehirlerle yüklenecektir. A portuna 20 μL oligomisin, B portuna 22 μL FCCP, C portuna 25 μL rotenon ve C portuna 25 μL antimisin A pipetleyin.
  6. Cihaz üzerinde tahlili başlatmadan bir saat önce, mikroplakayı CO2 olmayan inkübatöre koyun.
  7. Cihazı başlatmadan önce yazılımı açın ve cihazı kalibre edin. Kalibrasyon için yeterli zaman sağlamak için mikroplakayı cihaza yüklemeden 30 dakika önce bu görevi gerçekleştirin.
    1. Yazılım sisteminde, kuyucukları etiketleyin ve enjeksiyon şemasını gözden geçirin.
    2. Kalibrasyon sırasında sensör kartuşunu cihaza yükleyin. Yazılım, başlatma ve kalite kontrolünü tamamlamanızı isteyecektir. Kalibrasyon, her bir kuyucukta pH ve O2'yi değerlendirecek ve bu da geçecek veya başarısız olacaktır. Cihaz, sonuçları ekranda bir onay işareti veya 'X' ile bildirecektir.

5. Akut bir anti-CD3 / CD28 enjeksiyonu ile ayrı bir deneyde TCR stimülasyonu ile mitokondriyal fonksiyon testinin değiştirilmiş bir versiyonunu gerçekleştirin

NOT: Mitokondriyal fonksiyon testi, 1) adım 5.2'de açıklanan biyotinile anti-CD3 + anti-CD28 + streptavidin kullanılarak iki farklı yaklaşımla akut TCR simülasyonu ile gerçekleştirilebilir veya 2) adım 5.3'te açıklanan anti-CD3 / CD28 manyetik boncuklar Bu ayrı deneylerin her ikisi de test sırasında akut bir enjeksiyon yoluyla TCR'yi uyarma işlevi görür.

  1. Ek enjeksiyonlar yapıyorsanız, testi önceki bölüm 4'te açıklandığı gibi hazırlayın. Enjeksiyon için ek odayı kullanarak enjeksiyon şemalarını değiştirin. Bu protokolde, anti-CD3/anti-CD28, sensör kartuşunun A portuna yüklenir. Ardından, diğer bağlantı noktalarını benzer şekilde, oligomisin ile B bağlantı noktasına, FCCP ile C bağlantı noktasına ve rotenon ve antimisin A ile D bağlantı noktasına yükleyin.
  2. Biyotinile anti-CD3 + anti-CD28 + streptavidin bileşenlerini hazırlayın ve yükleyin.
    1. 10 μg/mL'de 20 μL biyotinile anti-CD3'ü sensör kartuşundaki belirtilen kuyucuklara pipetleyin.
    2. 2 μg/mL'de 20 μL anti-CD28 + 20 μg/mL'de streptavidin pipetleyin ve sensör kartuşundaki belirtilen kuyucuklara pipetleyin.
    3. 10 μg/mL'de 20 μL biyotinile anti-CD3 + 2 μg/mL'de anti-CD28 + 20 μg/mL'de streptavidin pipetleyin ve sensör kartuşundaki belirtilen kuyucuklara pipetleyin.
    4. Kontrol kuyularının hazırlandığından emin olun. Yalnızca ortam, tek başına biyotinile anti-CD3, anti-CD28 + streptavidin ve biyotinile anti-CD3 + anti-CD28 + streptavidin enjekte edilen belirlenmiş kuyucukların olduğundan emin olun.
  3. 1:1 boncuk-hücre oranı kullanarak, anti-CD3/CD28 manyetik boncukları hazırlayın ve yükleyin.
    1. Oyuk başına 200.000 hücreli bir plakada, sensör kartuşundaki belirtilen oyuklara 5 μL manyetik boncuk pipetleyin.
    2. Belirlenen kontrol kuyularını sadece enjeksiyon için ortamla hazırlayın.
  4. Zehirlerin hacmini, enjeksiyon sonrası son konsantrasyonlar şu şekilde olacak şekilde ayarlayın: oligomisin için 2.5 μM, FCCP için 2.0 μM ve rotenon ve antimisin A için 0.5 μM.
  5. Mikroplakayı cihaza yüklemeden önce enjeksiyon şemasının güncellenen zaman noktalarını yansıtacak şekilde değiştirildiğinden emin olun.
  6. Yazılımı, akut TCR stimülasyonunu toplam 140 dakika boyunca çalıştıracak şekilde programlayın. Bu zaman dilimi içinde, oligomisin enjeksiyonundan önce x10 zaman noktası ölçümü olacak şekilde şemayı değiştirin.

Sonuçlar

Glikolitik ve oksidatif metabolik kapasiteler, belirli zaman noktalarında elektron taşıma zincirinin bileşenlerini hedefleyerek kapasiteleri değerlendiren bir mitokondriyal fonksiyonel test kullanılarak ölçülebilir (Şekil 2A). Geleneksel testi değiştirmek ve akut TCR stimülasyonunu değerlendirmek için sensör kartuşu portlarına farklı enjeksiyon şemaları yüklenebilir (Şekil 2B,C). Çeşitli...

Tartışmalar

Bu yazıda, naif ve efektör CD8 T hücrelerinin mitokondriyal fonksiyonunu değerlendirmek için bir protokolün ana hatlarını çiziyoruz. OT-I ve C57BL / 6 fareleri kullanarak hem antijene özgü hem de poliklonal CD8 T hücrelerini hazırlama yöntemlerini detaylandırıyor ve karşılaştırıyoruz. Sonuçlarımız, CD8 T hücrelerinde aktivasyon ve ön tedavi yöntemine rağmen metabolizmada benzer eğilimler olduğunu göstermektedir. Veriler, antijene özgü aktivasyonun, anti-C...

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmek için rekabet eden çıkarları yoktur.

Teşekkürler

Hertz Vakfı, Amy Davis Vakfı, Moore Ailesi Vakfı ve Heidi Horner Vakfı paha biçilmez destek sağladılar ve bunun için minnettarız. Bu çalışma aynı zamanda kısmen RMT'ye (AI052157, AI136534) NIH hibeleri tarafından desteklenirken, JAT Hertz Lisansüstü Bursu tarafından desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Antimycin ASigma-AldrichA8674
Anti-CD28Biolegend102116
Anti-CD3/CD28 DynabeadsThermoFisher11456D
Biotinylated anti-CD3Biolegend317320
Bovine Serum AlbuminSigma-Aldrich108321-42-2
CD8a+ T cell isolation kitMiltenyi Biotec130-104-075
Cell Strainers (100 µm)CELL TREAT229485
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma-AldrichE8008
FicollSigma-Aldrich26873-85-8density gradient medium 
FCCP ((4-(trifluoromethoxy) phenyl) carbonohydrazonoyl dicyanide)Sigma-AldrichC2920
GlucoseSigma-AldrichG-6152
GlutamineSigma-AldrichG7513
LS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401Positive selection columns
Magnetic cell separation columnMiltenyi Biotec130-042-301
MicroplateAgilent102601-100
OligomycinSigma-Aldrich75351
PyruvateSigma-Aldrich113-24-6
Recobinant IL-2PeproTech200-02
RotenoneSigma-AldrichR8875
Seahorse mediaAgilent103576-100
Sensor cartridgeAgilent102601-100
StreptavidinSigma-AldrichA9275
Sterile 6 well plateCELL TREAT230601
Sterile 24 well plateCELL TREAT229524
XF CalibrantAgilent102601-100

Referanslar

  1. Patsoukis, N., et al. PD-1 alters T-cell metabolic reprogramming by inhibiting glycolysis and promoting lipolysis and fatty acid oxidation. Nat Commun. 6, 6692 (2015).
  2. Scharping, N. E., et al. Mitochondrial stress induced by continuous stimulation under hypoxia rapidly drives T cell exhaustion. Nat Immunol. 22, 205-215 (2021).
  3. Schurich, A., et al. Distinct Metabolic Requirements of Exhausted and Functional Virus-Specific CD8 T Cells in the Same Host. Cell Rep. 16 (5), 1243-1252 (2016).
  4. Zhang, L., Romero, P. Metabolic control of CD8(+) T cell fate decisions and antitumor immunity. Trends Mol Med. 24 (1), 30-48 (2018).
  5. Batabyal, R., et al. Metabolic dysfunction and immunometabolism in COVID-19 pathophysiology and therapeutics. Int J Obes (Lond). 45 (6), 1163-1169 (2021).
  6. Chavakis, T. Immunometabolism: Where immunology and metabolism meet. J Innate Immun. 14, 1-3 (2022).
  7. Frezza, C., Mauro, C. Editorial: The metabolic challenges of immune cells in health and disease. Front Immunol. 6, 293 (2015).
  8. Wang, X., Ping, F. F., Bakht, S., Ling, J., Hassan, W. Immunometabolism features of metabolic deregulation and cancer. J Cell Mol Med. 23 (2), 694-701 (2019).
  9. Turner, J. A., et al. Lysophosphatidic acid modulates CD8 T cell immunosurveillance, metabolism, and anti-tumor immunity. Nat Commun. 14, 3214 (2023).
  10. Coussens, L. M., Werb, Z. Inflammation and cancer. Nature. 420, 860-867 (2002).
  11. Jiang, Y., Li, Y., Zhu, B. T-cell exhaustion in the tumor microenvironment. Cell Death Dis. 6 (6), e1792 (2015).
  12. Krangel, M. S. Mechanics of T cell receptor gene rearrangement. Curr Opin Immunol. 21 (2), 133-139 (2009).
  13. Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
  14. Beltra, J. C., et al. Developmental relationships of four exhausted CD8(+) T cell subsets reveals underlying transcriptional and epigenetic landscape control mechanisms. Immunity. 52 (5), 825-841 (2020).
  15. Bengsch, B., et al. Bioenergetic insufficiencies due to metabolic alterations regulated by the inhibitory receptor PD-1 are an early driver of CD8(+) T cell exhaustion. Immunity. 45 (2), 358-373 (2016).
  16. Blank, C. U., et al. Defining 'T cell exhaustion'. Nat Rev Immunol. 19, 665-674 (2019).
  17. Dolina, J. S., Van Braeckel-Budimir, N., Thomas, G. D., Salek-Ardakani, S. CD8(+) T cell exhaustion in cancer. Front Immunol. 12, 715234 (2021).
  18. Mognol, G. P., et al. Exhaustion-associated regulatory regions in CD8(+) tumor-infiltrating T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (13), E2776-E2785 (2017).
  19. Wang, D., et al. A comprehensive profile of TCF1(+) progenitor and TCF1(-) terminally exhausted PD-1(+)CD8(+) T cells in head and neck squamous cell carcinoma: implications for prognosis and immunotherapy. Int J Oral Sci. 14 (1), 8 (2022).
  20. Vardhana, S. A., et al. Impaired mitochondrial oxidative phosphorylation limits the self-renewal of T cells exposed to persistent antigen. Nat Immunol. 21, 1022-1033 (2020).
  21. Kang, S., Brown, H. M., Hwang, S. Direct antiviral mechanisms of interferon-gamma. Immune Netw. 18 (5), e33 (2018).
  22. Samuel, C. E. Antiviral actions of interferons. Clin Microbiol Rev. 14, 778-809 (2001).
  23. Schellekens, H., Weimar, W., Cantell, K., Stitz, L. Antiviral effect of interferon in vivo may be mediated by the host. Nature. 278, 742 (1979).
  24. Radoja, S., et al. CD8(+) tumor-infiltrating T cells are deficient in perforin-mediated cytolytic activity due to defective microtubule-organizing center mobilization and lytic granule exocytosis. J Immunol. 167 (9), 5042-5051 (2001).
  25. van der Windt, G. J., et al. Mitochondrial respiratory capacity is a critical regulator of CD8+ T cell memory development. Immunity. 36 (1), 68-78 (2012).
  26. Balmer, M. L., et al. Memory CD8(+) T cells require increased concentrations of acetate induced by stress for optimal function. Immunity. 44 (6), 1312-1324 (2016).
  27. Pereira, R. M., Hogan, P. G., Rao, A., Martinez, G. J. Transcriptional and epigenetic regulation of T cell hyporesponsiveness. J Leukoc Biol. 102, 601-615 (2017).
  28. Sen, D. R., et al. The epigenetic landscape of T cell exhaustion. Science. 354, 1165-1169 (2016).
  29. Quintana, A., et al. T cell activation requires mitochondrial translocation to the immunological synapse. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14418-14423 (2007).
  30. Brindley, D. N. Lysophosphatidic acid signaling in cancer. Cancers (Basel). 12 (12), 3791 (2020).
  31. Chae, C. S., et al. Tumor-derived lysophosphatidic acid blunts protective type I interferon responses in ovarian cancer. Cancer Discov. 12, 1904-1921 (2022).
  32. Kremer, K. N., et al. LPA suppresses T cell function by altering the cytoskeleton and disrupting immune synapse formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (15), e2118816119 (2022).
  33. Mathew, D., et al. LPA5 is an inhibitory receptor that suppresses CD8 T-cell cytotoxic function via disruption of early TCR signaling. Front Immunol. 10, 1159 (2019).
  34. Mathew, D., Torres, R. M. Lysophosphatidic acid is an inflammatory lipid exploited by cancers for immune evasion via mechanisms similar and distinct from CTLA-4 and PD-1. Front Immunol. 11, 531910 (2020).
  35. Oda, S. K., et al. Lysophosphatidic acid inhibits CD8 T cell activation and control of tumor progression. Cancer Immunol Res. 1 (4), 245-255 (2013).
  36. Lidgerwood, G. E., Pitson, S. M., Bonder, C., Pebay, A. Roles of lysophosphatidic acid and sphingosine-1-phosphate in stem cell biology. Prog Lipid Res. 72, 42-54 (2018).
  37. Torres, R. M., Turner, J. A., D'Antonio, M., Pelanda, R., Kremer, K. N. Regulation of CD8 T-cell signaling, metabolism, and cytotoxic activity by extracellular lysophosphatidic acid. Immunol Rev. 317 (1), 203-222 (2023).
  38. Turner, J. A., et al. BRAF modulates lipid use and accumulation. Cancers (Basel). 14 (9), 2110 (2022).
  39. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  40. Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. J Transl Med. 8, 104 (2010).
  41. Ralli, M., et al. Immunotherapy in the treatment of metastatic melanoma: current knowledge and future directions. J Immunol Res. 2020, 9235638 (2020).
  42. Philip, M., Schietinger, A. CD8(+) T cell differentiation and dysfunction in cancer. Nat Rev Immunol. 22, 209-223 (2022).
  43. Bajrai, L. H., et al. Understanding the role of potential pathways and its components including hypoxia and immune system in case of oral cancer. Sci Rep. 11, 19576 (2021).
  44. Nicholls, D. G. Mitochondrial proton leaks and uncoupling proteins. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1862, 148428 (2021).
  45. Tyrakis, P. A., et al. S-2-hydroxyglutarate regulates CD8(+) T-lymphocyte fate. Nature. 540, 236-241 (2016).
  46. Guo, Y., et al. Metabolic reprogramming of terminally exhausted CD8(+) T cells by IL-10 enhances anti-tumor immunity. Nat Immunol. 22, 746-756 (2021).
  47. Notarangelo, G., et al. Oncometabolite d-2HG alters T cell metabolism to impair CD8(+) T cell function. Science. 377 (6614), 1519-1529 (2022).
  48. Yang, K., et al. T cell exit from quiescence and differentiation into Th2 cells depend on Raptor-mTORC1-mediated metabolic reprogramming. Immunity. 39 (6), 1043-1056 (2013).
  49. Ricciardi, S., et al. The translational machinery of human CD4(+) T cells is poised for activation and controls the switch from quiescence to metabolic remodeling. Cell Metab. 28 (6), 895-906.e5 (2018).
  50. Moller, S. H., Hsueh, P. C., Yu, Y. R., Zhang, L., Ho, P. C. Metabolic programs tailor T cell immunity in viral infection, cancer, and aging. Cell Metab. 34 (3), 378-395 (2022).
  51. Alrubayyi, A., et al. Functional restoration of exhausted CD8 T cells in chronic HIV-1 infection by targeting mitochondrial dysfunction. Front Immunol. 13, 908697 (2022).
  52. Vignali, P. D. A., et al. Hypoxia drives CD39-dependent suppressor function in exhausted T cells to limit antitumor immunity. Nat Immunol. 24, 267-279 (2023).
  53. Ogando, J., et al. PD-1 signaling affects cristae morphology and leads to mitochondrial dysfunction in human CD8(+) T lymphocytes. J Immunother Cancer. 7 (1), 151 (2019).
  54. Billingham, L. K., et al. Mitochondrial electron transport chain is necessary for NLRP3 inflammasome activation. Nat Immunol. 23, 692-704 (2022).
  55. Eberhardt, D. R., et al. EFHD1 ablation inhibits cardiac mitoflash activation and protects cardiomyocytes from ischemia. J Mol Cell Cardiol. 167, 1-14 (2022).
  56. Hou, T., et al. Identification of EFHD1 as a novel Ca(2+) sensor for mitoflash activation. Cell Calcium. 59 (5), 262-270 (2016).
  57. Mun, S. A., et al. Structural and biochemical characterization of EFhd1/Swiprosin-2, an actin-binding protein in mitochondria. Front Cell Dev Biol. 8, 628222 (2020).
  58. Stein, M., et al. A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1. Cell Death Differ. 24 (7), 1239-1252 (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 217

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır