שיטה התנהגותית רב-תכליתית לחקר ההשפעות של הורמוני בלוטת התריס על תפקוד המוח הקטן

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול למבחן התנהגות ורסטילי שפותח לאחרונה, מבחן קרן הסולם. לבדיקה זו יש יתרון של גילוי אטקסיה צרבלרית עדינה הנגרמת על ידי פגם בפעילות הורמון בלוטת התריס במערכת העצבים המרכזית על פני מבחני ההתנהגות הקונבנציונליים להערכת ביצועים מוטוריים.

Abstract

פעולת הורמון בלוטת התריס (TH) חיונית במהלך התפתחות מערכת העצבים המרכזית, כולל המוח הקטן. במקרה של מחסור ב- TH בתחילת החיים כגון תת פעילות מולדת של בלוטת התריס, החולים מציגים הפרעות נוירולוגיות כגון פיגור קוגניטיבי וליקויים מוטוריים. ישנם מחקרים שונים המשתמשים במודלים של עכברים עם מחסור ב-TH ספציפי לרקמות או לתאים כדי לחקור את התפקיד של TH במוח הקטן. בהשוואה לעכברים מולדים עם תת-פעילות של בלוטת התריס, עכברים עם חסר TH ספציפי לתאי המוח הקטן מציגים תכונות אטקסי מתונות ומעודנות יותר, מה שמקשה על הערכת התפקוד המוטורי בעת שימוש בבדיקות קונבנציונליות כגון מבחן רוטרוד.

בשל הצורך בכלי חלופי להערכת תפקוד מוטורי במודלים של בעלי חיים הקשורים ל-TH, פיתחנו שיטה התנהגותית רב-תכליתית הנקראת "מבחן קרן הסולם", בה אנו יכולים לתכנן את מבחני הסולם השונים בהתאם לחומרת האטקסיה בעכברי מודל. השתמשנו בעכברים טרנסגניים המבטאים קולטן TH דומיננטי-שלילי במיוחד בתא Purkinje במוח הקטן, נוירון פלט יחיד בקליפת המוח הקטן המווסת את הביצועים המוטוריים. בדיקת קרן הסולם החדשה שנבנתה זיהתה בהצלחה ליקויים חזקים בביצועים המוטוריים בעכברים הטרנסגניים ברמה גבוהה יותר בהשוואה למבחן הרוטרוד. הפרעה בלמידה המוטורית זוהתה גם במבחן קרן הסולם אך לא במבחן הרוטרוד. הפרוטוקול עם מנגנון התנהגותי חדשני זה יכול להיות מיושם על מודלים אחרים של בעלי חיים שעשויים להראות פנוטיפ אטקסי קל כדי לבחון שינויים עדינים בתפקוד המוח הקטן.

Introduction

הורמון בלוטת התריס (TH) הוא הכרחי להתפתחות המוח¹. בפרט, תפקידו במוח הקטן הוא קריטי מכיוון שמחסור ב- TH בתחילת החיים גורם להתפתחות מוחית חריגה ^1,2. לדוגמה בתת-פעילות מולדת של בלוטת התריס, החולים מציגים סדרה של פיגור נוירולוגי כולל ליקויים קוגניטיביים ומוטוריים³. כדי לחשוף את התפקיד של TH בהתפתחות תפקודית המוח הקטן, כמה מחקרים הגבילו את חוסר TH באופן ספציפי לתא המוח הקטן⁴. עם זאת, בהשוואה לעכברים מולדים כלליים של בלוטת התריס, שבהם כל הרקמות והתאים מושפעים ממחסור ב-TH, מודלים ספציפיים למוח הקטן מציגים אטקסיה כה עדינה שמבחני ההתנהגות הקונבנציונליים, כגון רוטרוד, טביעת רגל ובדיקות קרן שיווי משקל, בקושי מזהים את ההבדלים. לכן, כדי לחקור באופן מלא את השפעות TH על תפקוד המוח הקטן, יש צורך בכלי הערכה חדש כדי לזהות שינוי עדין בתיאום המוטורי של עכברי מודל.

מבחן הרוטרוד הוא הכלי הנפוץ ביותר להערכת קואורדינציה מוטורית, שפותח במקור על ידי דנהאם ומיה⁵ ומאוחר יותר יושם על גרסה מואצת על ידי ג'ונס ורוברטס⁶. ההשהיה ליפול מהמוט המסתובב מתפרשת כמבחן לתיאום מוטורי, ופשטותה ותמציתה הופכות אותה לנפוצה בקרב חוקרי התנהגות החוקרים תפקוד מוטורי⁷. עם זאת, קלות השימוש במבחן זה היא חרב פיפיות. מכיוון שהמוט מסתובב באופן אוטומטי, עכברים יכולים להיצמד למוט המסתובב ולהישאר עליו מבלי לזוז. יתר על כן, עכברים עשויים להתכוון ליפול במקום להמשיך לאזן על המוט המסתובב. בכל מקרה, תוקפה ומהימנותה של הבדיקה מוטלים בספק להערכת "קואורדינציה מוטורית טהורה"⁷. במילים אחרות, הוא אינו מכוון במדויק לתפקוד המוח הקטן וכולל גורמים אחרים כגון כוח שרירים לאחיזה.

במקום הכלים המקובלים להערכת קואורדינציה מוטורית, אנו מציגים כאן מבחן התנהגות חדשני שנקרא "מבחן קרן סולם", שפותח לאחרונה במעבדה שלנו. מבחן ההליכה בסולם אופקי נועד להעריך יכולות מוטוריות מורכבות הקשורות למוח הקטן: חיזוי הזנה קדימה ואינטגרציה של תנועה⁸. מכשיר הבדיקה היה מורכב מארבע חתיכות פרספקס עם חורים (איור 1). ארבעת הלוחות חוברו במקביל באמצעות ברגים ומקלות שהוכנסו לחורים שעל הלוחות. שני לוחות חיצוניים שימשו לייצוב המכשיר ושני לוחות פנימיים שימשו לתכנון סוגים שונים של מדרגות סולם (איור 2C). רוחב המדרגה הותאם בהתאם לגודל החיה כדי למזער את תנועתן לאחור של החיות (איור 2B). המרחק מנקודת ההתחלה לשער היה 110 ס"מ. המכשיר היה ממוקם 60 ס"מ מעל הספסל וכרית בטיחות הונחה מתחת למכשיר (איור 2A). החדר החשוך הוצב ליד המטרה כדי להניע את החיות לנוע לעבר המטרה (איור 2A).

בחנו את השפעות TH על ההתפתחות התפקודית של המוח הקטן באמצעות עכברים טרנסגניים המבטאים קולטן TH דומיננטי-שלילי (TR) בתאי Purkinje במוח הקטן (עכברי Mf-1/FVB). הן בבדיקות רוטרוד והן בבדיקות קרן סולם, ראינו פנוטיפ אטקסי צרבלרי בעכברי Mf-1/FVB; עם זאת, בדיקת קרן הסולם הצליחה לזהות הבדלים משמעותיים יותר מאשר בדיקת רוטרוד (איור 3). נוסף על כך, ניתן להעריך באופן יסודי יותר את יכולת הלמידה המוטורית במבחן קרן סולם (איור 3B,C). כרקע תאי של פנוטיפ התנהגותי כזה, עוכבה השראת דיכאון לטווח ארוך (LTD) ובמקום זאת, הגברה לטווח ארוך (LTP) הושרה בעקבות גירוי השראתי LTD בתאי פורקיניה Mf-1/FVB⁹. LTD חיוני לתיאום מוטורי ולמידה מוטורית במוח הקטן¹⁰. מחקרים רבים דיווחו על ליקויים מוטוריים ועיכוב של LTD בעכברי נוקאאוט או מוטציה עבור גנים מווסתים מרכזיים בתפקוד המוח הקטן, עם זאת, מעולם לא דווח על השראת LTP בעקבות גירוי השראתי LTD^11,12. יחד, תופעה זו עשויה להיות ייחודית לעכברי Mf-1/FVB או עכברים עם מחסור ב-TH (אותה תופעה נצפתה בעכברים בוגרים עם תת-פעילות של בלוטת התריס), דבר המצביע על כך ש-TH מווסת את תפקוד המוח הקטן באופן שונה מחלבוני מפתח אחרים. אם כן, סביר להניח שעכברים עם פעולת TH חריגה אינם מציגים אטקסיה צרבלרית באותו אופן כמו עכברי מודל אחרים. זה שוב מדגיש את הצורך בשיטה ספציפית להערכת השפעות TH על תפקוד המוח הקטן. מאמר זה מציג פרוטוקול חדשני לחקר השפעות TH על תפקוד המוח הקטן באמצעות בדיקת קרן הסולם החדשה שנבנתה.

Protocol

פרוטוקול הניסויים בבעלי חיים במחקר הנוכחי אושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים וניסויים באוניברסיטת גונמה. כל ההליכים לטיפול וטיפול בבעלי חיים בוצעו על פי החוק היפני לרווחת וניהול בעלי חיים וההנחיות להתנהלות נאותה של ניסויים בבעלי חיים שפורסמו על ידי המועצה המדעית של יפן. את שרטוט ההרכבה של המכשיר ניתן למצוא באיור 1.

1. הגדרת סולם

1. בדיקת סולם אופקי (איור 2C משמאל)
   1. הכניסו מקלות אלומיניום (בקוטר 2 מ"מ) לחורים בדפנות הפרספקס.
      הערה: מרחק המרווח משתנה בהתאם לגודל הגוף בהתאם למאמץ או למין העכבר הנבדק (ראה טבלה 1).
   2. התאימו את רוחב שלבי הסולם על ידי הרחבה או צמצום המרחק של דפנות הפרספקס.
      הערה: הרוחב עשוי להשתנות בהתאם לגודל הגוף בהתאם למאמץ או למין העכבר הנבדק (ראה טבלה 1).
2. בדיקת סולם זיגזג (איור 2C מימין)
   1. הכניסו מקלות אלומיניום (בקוטר 2 מ"מ) לכל חור שלישי בכיוון האופקי והאנכי על דפנות הפרספקס.
      הערה: מרחק המרווח משתנה בהתאם לגודל הגוף בהתאם למאמץ או למין של העכבר הנבדק (ראה טבלה 1).
   2. התאימו את רוחב שלבי הסולם על ידי הרחבה או צמצום המרחק של דפנות הפרספקס.
      הערה: הרוחב עשוי להשתנות בהתאם לגודל הגוף, למאמץ או למין של העכבר הנבדק (ראה טבלה 1).
   3. מקם את החדר החשוך באתר היעד.
   4. הניחו את הכרית (יכולה להיות עשויה משקית ניילון ממולאת בחומרי חיץ) 30 ס"מ מתחת למערך הסולם לבטיחות.

2. התרגלות (יום 0)

הערה: מומלץ לקחת לפחות יום אחד כדי להרגיל את העכברים למערך הסולם.

1. מקם את העכבר בקצה הסולם (נקודת ההתחלה).
2. באמצעות נשיפה אווירית, עודד את העכבר לנוע קדימה על שלב הסולם.
3. חזור על הפעולה עד שהעכבר מתרגל ללכת על שלבי הסולם.

3. מדידת ביצועי המנוע

1. מקם את העכבר בקצה הסולם (נקודת ההתחלה).
2. רשמו את הזמן להשלמת חציית הסולם ואת מספר החלקות הרגליים כאשר העכברים לא מצליחים להניח את כפותיהם או מחליקים לאחר הנחתם על מקלות האלומיניום (ראו איור 2D). במידת האפשר, הקלט את הסרטון כדי לבדוק את הטעויות לאחר מכן.
3. לאחר מרווח של 15 דקות, חזור על המדידה (4-5 ניסיונות ביום).
4. חזור על הניסוי במשך 3-4 ימים להערכת למידה מוטורית.

4. ניתוח

1. חשב את הערך הממוצע של זמן והחלקות רגליים ליום.
2. השווה את הערך הממוצע בין הקבוצות.

תוצאות

במבחן הרוטרוד, עכברי Mf-1/FVB הראו ירידה משמעותית בהשהיה ליפול מהמוט המסתובב במשך 3 ימים רצופים בהשוואה לעכברי הבר, מה שמצביע על תיאום מוטורי לקוי (איור 3A). אולם במונחים של תוצאות בתוך הקבוצה, עכברי Mf-1/FVB שיפרו באופן משמעותי את הביצועים שלהם מיום 1 ליו?...

Discussion

התכנון שלנו הסתמך על מחקר עבר של מץ ווישאו, שדיווחו על התועלת של "מבחן ההליכה שלב הסולם"^13,14. הם תכננו את מבחן ההליכה שלב הסולם כדי להעריך הליכה מיומנת ולמדוד הן את מיקום הגפיים הקדמיות והאחוריות, דריכה ותיאום בין הגפיים על ידי דרישה מבעלי חי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air puff	DAISO
Aluminum sticks	CAINZ		2 mm diameter, number of sticks may vary depending on the ladder design. Aproximately 30 sticks may be required to build the horizontal ladder (4 cm interval).
Blutack	Bostik
Plexiglass	CAINZ		110 cm x 20 cm, 110 cm x 10 cm, 2 parts each
Screws	CAINZ