Универсальный поведенческий метод исследования влияния гормонов щитовидной железы на функцию мозжечка

Резюме

Здесь мы представляем протокол для универсального поведенческого теста, разработанного недавно, теста на лестничном луче. Этот тест имеет преимущество в выявлении тонкой мозжечковой атаксии, вызванной дефектом действия гормонов щитовидной железы в центральной нервной системе, по сравнению с обычными поведенческими тестами, оценивающими двигательную работоспособность.

Аннотация

Действие гормона щитовидной железы (ТГ) имеет важное значение в период развития центральной нервной системы, в том числе мозжечка. В случае дефицита ТГ в раннем возрасте, такого как врожденный гипотиреоз, у пациентов проявляются неврологические расстройства, такие как умственная отсталость и двигательный дефицит. Существуют различные исследования с использованием мышиных моделей с ткане- или клеточно-специфическим дефицитом ТГ для изучения роли ТГ в мозжечке. По сравнению с мышами с генерализованным врожденным гипотиреозом, мыши, специфичные для клеток мозжечка, с дефицитом ТГ, демонстрируют более мягкие и тонкие атаксические черты, что затрудняет оценку двигательной функции при использовании обычных тестов, таких как тест ротарода.

В связи с потребностью в альтернативном инструменте для оценки двигательной функции в моделях животных, связанных с ТГ, мы разработали универсальный поведенческий метод под названием «тест лестничного пучка», в котором мы можем разрабатывать различные тесты с лестницей в зависимости от тяжести атаксии у модельных мышей. Мы использовали трансгенных мышей, экспрессирующих доминантно-негативный рецептор TH, специфически в мозжечковой клетке Пуркинье, единственном выходном нейроне в коре мозжечка, модулирующем моторную производительность. Недавно созданный тест с использованием лестничного пучка успешно обнаружил устойчивые нарушения двигательной способности у трансгенных мышей на более высоком уровне по сравнению с тестом ротарода. Нарушение моторного обучения также было обнаружено в тесте с лестничным лучом, но не в тесте с ротародом. Протокол с этим новым поведенческим аппаратом может быть применен к другим животным моделям, которые могут демонстрировать слабый атаксичный фенотип, для изучения тонких изменений в функции мозжечка.

Введение

Гормон щитовидной железы (ТГ) незаменим для развития мозга¹. В частности, его роль в мозжечке имеет решающее значение, поскольку дефицит ТГ в раннем возрасте вызывает аберрантное развитие мозжечка ^1,2. Например, при врожденном гипотиреозе у пациентов наблюдается ряд неврологических нарушений, включая когнитивные и двигательные дефициты³. Чтобы раскрыть роль ТГ в функциональном развитии мозжечка, в некоторых исследованиях был ограничен дефицит ТГ специфическим для клеток мозжечка способом⁴. Однако, по сравнению с генерализованными мышами с врожденным гипотиреозом, у которых все ткани и клетки поражены дефицитом ТГ, такие мозжечково-специфические модели демонстрируют настолько тонкую атаксию, что обычные поведенческие тесты, такие как тесты ротарода, контакта ноги и балансирного пучка, едва обнаруживают различия. Таким образом, для полного изучения влияния ТГ на функцию мозжечка необходим новый инструмент оценки для обнаружения тонких изменений в моторной координации модельных мышей.

Тест ротарод является наиболее распространенным инструментом для оценки координации движений, первоначально разработанным Данхэмом и Мией⁵ , а затем примененным к ускоряющейся версии Джонсом и Робертсом⁶. Латентность падения от вращающегося стержня интерпретируется как тест на координацию движений, а его простота и лаконичность делают его широко используемым среди исследователей поведения, изучающих моторные^{функции.} Однако простота использования этого теста – палка о двух концах. Поскольку стержень вращается автоматически, мыши могут цепляться за вращающийся стержень и оставаться на нем, не двигаясь. Кроме того, мыши могут намереваться упасть, а не продолжать балансировать на вращающемся стержне. В любой ситуации валидность и надежность теста сомнительны для оценки «чистой моторной координации»⁷. Другими словами, он не точно нацелен на функцию мозжечка и включает в себя другие факторы, такие как мышечная сила для захвата.

Вместо традиционных инструментов для оценки координации движений здесь мы представляем новый поведенческий тест под названием «тест лестничного пучка», который недавно был разработан в нашей лаборатории. Тест на ходьбу по горизонтальной лестнице был разработан для оценки сложных двигательных способностей, связанных с мозжечком: прогнозирование прямой связи и интеграция движения⁸. Испытательное устройство состояло из четырех кусков оргстекла с отверстиями (рис. 1). Четыре пластины были соединены параллельно винтами и палочками, вставленными в отверстия на пластинах. Две внешние пластины использовались для стабилизации устройства, а две внутренние пластины использовались для проектирования различных видов лестничных перекладин (Рисунок 2C). Ширина перекладины регулировалась в зависимости от размера животного, чтобы свести к минимуму движение животных назад (рис. 2В). Расстояние от точки старта до цели составляло 110 см. Устройство располагалось на высоте 60 см над скамьей и под устройством устанавливалась подушка безопасности (рисунок 2А). Темная камера располагалась рядом с целью, чтобы мотивировать животных двигаться к цели (Рисунок 2А).

Мы изучили влияние ТГ на функциональное развитие мозжечка с использованием трансгенных мышей, экспрессирующих доминантно-негативный рецептор ТГ (TR) в клетках мозжечка Пуркинье (мыши Mf-1/FVB). В тестах с использованием ротародного и лестничного пучка мы наблюдали фенотип мозжечковой атаксии у мышей Mf-1/FVB; однако испытание с использованием лестничной балки позволило выявить более значительные различия, чем испытание с использованием ротарода (Рисунок 3). Кроме того, способность к моторному обучению может быть более тщательно оценена в тесте с лестничным лучом (рис. 3B, C). В качестве клеточного фона такого поведенческого фенотипа индукция долгосрочной депрессии (LTD) была ингибирована, и вместо этого долгосрочная потенциация (LTP) индуцировалась после LTD-индуктивной стимуляции в клетках Mf-1/FVB Purkinje⁹. LTD необходим для координации движений и моторного обучения в мозжечке¹⁰. Во многих исследованиях сообщалось о двигательном дефиците и ингибировании LTD у нокаутных или мутировавших мышей ключевых генов-регуляторов функции мозжечка, однако ни в одном исследовании никогда не сообщалось об индукции LTP после индуктивной стимуляции LTD^11,12. В совокупности это явление может быть уникальным для мышей с Mf-1/FVB или мышей с дефицитом TH-дефицита (то же явление наблюдалось у взрослых мышей с гипотиреозом), что позволяет предположить, что TH регулирует функцию мозжечка иначе, чем другие ключевые белки. Если это так, то вполне вероятно, что у мышей с аномальным действием TH мозжечковая атаксия не проявляется так же, как у других модельных мышей. Это еще раз подчеркивает необходимость специального метода оценки влияния ТГ на функцию мозжечка. В данной статье представлен новый протокол исследования влияния ТГ на функцию мозжечка с использованием недавно созданного теста на основе лестничного пучка.

протокол

Протокол экспериментов на животных в настоящем исследовании был одобрен Комитетом по уходу за животными и экспериментам Университета Гумма. Все процедуры по уходу и лечению животных выполнялись в соответствии с японским Законом о благополучии и управлении животными и Руководством по надлежащему проведению экспериментов на животных, выпущенным Научным советом Японии. Сборочный чертеж аппарата можно найти на рисунке 1.

1. Установка лестницы

1. Испытание горизонтальной лестницы (Рисунок 2C слева)
   1. Вставьте алюминиевые палочки (диаметром 2 мм) в отверстия на стенках из оргстекла.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Расстояние между интервалами варьируется в зависимости от размера тела в зависимости от штамма или пола тестируемой мыши (см. Таблицу 1).
   2. Отрегулируйте ширину перекладин лестницы, расширив или сузив расстояние между стенами из плексигласа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ширина может варьироваться в зависимости от размера тела в зависимости от штамма или пола тестируемой мыши (см. Таблицу 1).
2. Испытание зигзагообразной лестницей (Рисунок 2C справа)
   1. Вставьте алюминиевые палочки (диаметром 2 мм) в каждое третье отверстие в горизонтальном и вертикальном направлениях на стенках из оргстекла.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Расстояние между интервалами варьируется в зависимости от размера тела в зависимости от штамма или пола тестируемой мыши (см. Таблицу 1).
   2. Отрегулируйте ширину перекладин лестницы, расширив или сузив расстояние между стенами из плексигласа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ширина может варьироваться в зависимости от размера тела, штамма или пола тестируемой мыши (см. Таблицу 1).
   3. Поместите темную камеру в целевое место.
   4. Поместите подушку (можно из полиэтиленового пакета, набитого буферными материалами) на 30 см ниже лестницы для безопасности.

2. Привыкание (день 0)

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется потратить не менее 1 дня на приучение мышей к лестничной установке.

1. Поместите мышь на край лестницы (начальную точку).
2. С помощью воздушной затяжки побудите мышь двигаться вперед по ступеньке лестницы.
3. Повторяйте до тех пор, пока мышь не привыкнет ходить по ступенькам лестницы.

3. Измерение производительности двигателя

1. Поместите мышь на край лестницы (начальную точку).
2. Запишите время, необходимое для завершения пересечения лестницы, и количество соскальзываний ног, когда мыши не могут поставить лапы или поскальзываются после установки на алюминиевые палки (см. рисунок 2D). Если возможно, запишите видео, чтобы впоследствии проверить ошибки.
3. Через 15-минутный интервал повторите измерение (4-5 попыток в день).
4. Повторяйте эксперимент в течение 3-4 дней для оценки моторного обучения.

4. Анализ

1. Рассчитайте среднее значение времени и промахов за день.
2. Сравните среднее значение между группами.

Результаты

В тесте rotarod мыши Mf-1/FVB показали значительное снижение латентности падения с вращающегося стержня в течение 3 дней подряд по сравнению с мышами дикого типа, что указывает на нарушение координации движений (рис. 3A). Тем не менее, с точки зрения вн?...

Обсуждение

Наш проект основывался на предыдущем исследовании Метца и Уишоу, которые сообщили о полезности «теста на ходьбу по лестнице»^13,14. Они разработали тест ходьбы по лестнице для оценки навыков ходьбы и измерения положения передних и задних ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air puff	DAISO
Aluminum sticks	CAINZ		2 mm diameter, number of sticks may vary depending on the ladder design. Aproximately 30 sticks may be required to build the horizontal ladder (4 cm interval).
Blutack	Bostik
Plexiglass	CAINZ		110 cm x 20 cm, 110 cm x 10 cm, 2 parts each
Screws	CAINZ