甲状腺ホルモンが小脳機能に及ぼす影響を調査するための汎用性の高い行動法

要約

ここでは、最近開発された汎用性の高い動作テストであるラダービームテストのプロトコルを紹介します。この検査は、運動能力を評価する従来の行動検査と比較して、中枢神経系の甲状腺ホルモン作用の欠陥によって引き起こされる微妙な小脳性運動失調を検出できるという利点があります。

要約

甲状腺ホルモン(TH)の作用は、小脳を含む中枢神経系の発達に不可欠です。先天性甲状腺機能低下症など、幼少期にTH欠損症を呈すると、認知遅滞や運動障害などの神経障害を呈します。組織特異的または細胞特異的なTH欠損症を持つマウスモデルを用いて、小脳におけるTHの役割を調査するさまざまな研究が行われています。小脳細胞特異的TH欠損マウスは、全身性先天性甲状腺機能低下症マウスと比較して、軽度で微妙な運動失調性の特徴を示すため、従来のロータロッド検査では運動機能の評価が困難でした。

TH関連動物モデルにおける運動機能評価のための代替ツールが必要であったため、モデルマウスの運動失調の重症度に応じて様々なラダーテストを設計できる「ラダービーム試験」という汎用性の高い行動法を開発しました。私たちは、運動能力を調節する小脳皮質の唯一の出力ニューロンである小脳プルキンエ細胞に特異的にドミナントネガティブTH受容体を発現するトランスジェニックマウスを利用しました。新たに構築したラダービーム試験では、トランスジェニックマウスの運動能力の頑健な障害を、ロータロッド試験よりも高いレベルで検出することに成功しました。運動学習の中断は、ラダービームテストでも検出されましたが、ロータロッドテストでは検出されませんでした。この新しい行動装置を使用したプロトコルは、軽度の運動失調性表現型を示す可能性のある他の動物モデルに適用して、小脳機能の微妙な変化を調べることができます。

概要

甲状腺ホルモン(TH)は脳の発達に欠かせません¹。特に、幼少期のTH欠乏症は異常な小脳発達を引き起こすため、小脳におけるその役割は重要です^1,2。例えば、先天性甲状腺機能低下症では、患者は認知障害や運動障害を含む一連の神経学的遅延を示します³。小脳機能発達におけるTHの役割を明らかにするために、いくつかの研究では、小脳細胞特異的な方法でTH欠損が限定されています⁴。しかし、すべての組織や細胞がTH欠損の影響を受けている全身性先天性甲状腺機能低下症マウスと比較すると、このような小脳特異的なモデルは非常に微妙な運動失調を示すため、回転体、足跡、平均台などの従来の行動テストでは、その差はほとんど検出されません。したがって、THが小脳機能に及ぼす影響を完全に調査するには、モデルマウスの運動協調の微妙な変化を検出するための新しい評価ツールが必要です。

ロータロッドテストは、運動協調性を評価するための最も一般的なツールであり、もともとはDunhamとMiya⁵ によって開発され、後にJonesとRoberts^によって加速バージョンに適用されました6。回転ロッドから落下する潜時は、運動協調のテストとして解釈され、その単純さと簡潔さにより、運動機能を研究する行動研究者の間で一般的に使用されています⁷。ただし、このテストの使いやすさは諸刃の剣です。ロッドは自動的に回転するため、マウスは動かずに回転ロッドにしがみついて留まることができます。さらに、マウスは回転ロッドでバランスを取り続けるのではなく、落下するつもりかもしれません。いずれの状況においても、テストの有効性と信頼性は、「純粋な運動協調」を評価するには疑問があります⁷。つまり、小脳の機能を正確に狙っているわけではなく、握るための筋力など他の要素が関わっているのです。

ここでは、従来の運動協調評価ツールの代わりに、最近当研究室で開発された「ラダービーム試験」という新しい行動試験を紹介します。水平はしご歩行テストは、小脳関連の複雑な運動能力を評価するために設計されました:フィードフォワード予測と運動^の統合8。試験装置は、穴の開いたプレキシガラス4枚で構成されていました(図1)。4枚のプレートは、プレートの穴に挿入されたネジとスティックによって平行に接続されました。2つの外側プレートはデバイスの安定化に使用され、2つの内側プレートはさまざまな種類のはしご横木の設計に使用されました(図2C)。横木の幅は、動物が後退するのを最小限に抑えるために、動物のサイズに応じて調整されました(図2B)。スタート地点からゴールまでの距離は110cmでした。装置はベンチから60cm上に配置され、装置の下に安全クッションが設置されていました(図2A)。暗い部屋は、動物がゴールに向かって移動するように動機付けるために、ゴールの近くに設置されました(図2A)。

私たちは、小脳プルキンエ細胞にドミナントネガティブTH受容体(TR)を発現するトランスジェニックマウス(Mf-1/FVBマウス)を用いて、THが小脳機能発達に及ぼす影響を検討しました。ロータロッドビーム試験とラダービーム試験の両方で、Mf-1 / FVBマウスの小脳運動失調表現型を観察しました。しかし、ラダービーム試験では、ロータロッド試験よりも有意な差を検出することに成功しました(図3)。また、ラダービーム試験では、運動学習能力をより詳細に評価することができます(図3B,C)。このような行動表現型の細胞背景として、長期うつ病(LTD)の誘導が阻害され、代わりに、Mf-1/FVBプルキン^エ細胞9のLTD誘導刺激に続いて長期増強(LTP)が誘導された。LTDは、小脳¹⁰の運動協調と運動学習に不可欠です。多くの研究が、小脳機能の主要な調節遺伝子に対するノックアウトマウスまたは変異マウスにおける運動障害およびLTDの阻害を報告しているが、LTD誘導刺激後のLTPの誘導を報告した研究はこれまでにない^11,12。まとめると、この現象はMf-1/FVBマウスまたはTH欠損マウスに特有のものである可能性があり(同じ現象は成体発症甲状腺機能低下マウスで観察されました)、THが他の主要なタンパク質とは異なる方法で小脳機能を調節していることを示唆しています。もしそうなら、THの作用が異常なマウスは、他のモデルマウスと同じように小脳性運動失調を示さないと考えられる。これは、小脳機能に対するTHの影響を評価するための特定の方法の必要性を再び強調しています。この論文では、新しく構築されたラダービームテストを使用して、小脳機能に対するTHの影響を調査するための新しいプロトコルを紹介します。

プロトコル

本研究の動物実験計画書は、群馬大学の動物実験委員会によって承認されました。動物の世話と治療に関するすべての手続きは、日本の動物の福祉及び管理に関する法律および日本学術会議が発行した動物実験の適正な実施のためのガイドラインに従って行われました。装置の組み立て図は、 図1にあります。

1.はしごのセットアップ

1. 水平ラダーテスト(図2C 左)
   1. アルミスティック(直径2mm)をプレキシガラスの壁の穴に挿入します。
      注:インターバル距離は、テストしたマウスの系統または性別に応じて、体のサイズによって異なります( 表1を参照)。
   2. プレキシガラスの壁の距離を広げたり狭めたりして、はしごの横木の幅を調整します。
      注:幅は、テストしたマウスの系統や性別によって、体のサイズによって異なる場合があります( 表1を参照)。
2. ジグザグのはしご試験(図2C右)
   1. アルミスティック(直径2 mm)をプレキシガラス壁の水平方向と垂直方向の3つおきの穴に挿入します。
      注:インターバル距離は、テストしたマウスの系統または性別に応じて、体のサイズによって異なります( 表1を参照)。
   2. プレキシガラスの壁の距離を広げたり狭めたりして、はしごの横木の幅を調整します。
      注:幅は、テストしたマウスの体のサイズ、ひずみ、または性別によって異なる場合があります( 表1を参照)。
   3. 暗い部屋を目的の場所に配置します。
   4. 安全のために、クッション(緩衝材を詰めたビニール袋で作ることができます)をはしごのセットアップの30cm下に置きます。

2. 慣れ(0日目)

注:マウスをはしごのセットアップに慣れさせるために、少なくとも1日かかることをお勧めします。

1. はしごの端(開始点)にマウスを置きます。
2. エアパフを使用して、はしごの横木をマウスが前進するように促します。
3. マウスがはしごの横木を歩くことに慣れるまで繰り返します。

3. モーター性能の測定

1. はしごの端(開始点)にマウスを置きます。
2. はしごの横断を完了するまでの時間と、マウスが足を置かなかった場合、またはアルミニウムスティックに取り付けた後に滑った場合の足の滑り回数を記録します( 図2Dを参照)。可能であれば、ビデオを録画して、後でミスステップを確認してください。
3. 15分のインターバルの後、測定を繰り返します(1日あたり4〜5回の試行)。
4. 運動学習を評価するために、実験を3〜4日間繰り返します。

4. 分析

1. 1日あたりの時間と足のスリップの平均値を計算します。
2. グループ間の平均値を比較します。

結果

ロータロッド試験では、Mf-1/FVBマウスは、野生型マウスと比較して、3日間連続して回転ロッドから落下する潜時が有意に減少し、運動協調障害が認められました(図3A)。しかし、群内結果としては、Mf-1/FVBマウスは1日目から3日目にかけて成績が有意に向上しており、運動学習の保存が示唆されています(図3A

ディスカッション

私たちのデザインは、「はしご横木歩行テスト」の有用性を報告したMetzとWhishawによる過去の研究を利用しました^13,14。彼らは、熟練した歩行を評価し、動物に水平梯子^13,14の出発点からゴールまで歩くように要求することにより、前肢と後肢の両方の配置、ステップ、および四?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air puff	DAISO
Aluminum sticks	CAINZ		2 mm diameter, number of sticks may vary depending on the ladder design. Aproximately 30 sticks may be required to build the horizontal ladder (4 cm interval).
Blutack	Bostik
Plexiglass	CAINZ		110 cm x 20 cm, 110 cm x 10 cm, 2 parts each
Screws	CAINZ