JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול המוצג מתאר הליך לכימות תאים ברי קיימא אך לא ניתנים לתרבית (VBNC) בתרביות חיידקים שטופלו בדבש מאנוקה.

Abstract

עמידות לאנטיביוטיקה וסבילות בקרב חיידקים מהווים איום משמעותי על הבריאות העולמית. מנגנונים התורמים לעמידות וסבילות לאנטיביוטיקה כוללים מוטציות גנטיות, רכישת גנים עמידים, ומעבר למצבי תרדמה ברי קיימא אך לא ניתנים לתרבות (VBNC) ומצבי תרדמה אחרים, בהתאמה. למרות שהם זהים גנטית לעמיתיהם שאינם עמידים לאנטיביוטיקה, תאי VBNC מתחמקים מהשפעות אנטיביוטיות על ידי הישארות לא פעילים מבחינה מטבולית. אנטיביוטיקה יעילה רק כאשר תהליכי היעד שלה, כגון שכפול או שעתוק DNA, פעילים. מאחר שגורמי לחץ סביבתיים, במיוחד אנטיביוטיקה, יכולים לגרום לחיידקים להיכנס לתרדמה, יש צורך באנטי-מיקרוביאלים חלופיים כדי למזער או למנוע את התגובה הזו. דבש מנוקה אנטי-בקטריאלי (MH) יעיל נגד חיידקים רבים, עם התפתחות נדירה של עמידות. המנגנונים האנטי-מיקרוביאליים הרב-גוניים שלו הופכים אותו לסוכן רב ערך לטיפול בזיהומים חיידקיים. מחקר זה חקר את סרבנות MH להתפתחות עמידות לאנטיביוטיקה על ידי בדיקת ההשערה ש-MH משרה פחות תאי VBNC מאשר אנטיביוטיקה קונבנציונלית. כדי לחקור זאת, פותח פרוטוקול לטיפול בחיידקים הגורמים לפצעים Staphylococcus aureus ו-Pseudomonas aeruginosa עם ריכוזים מעכבים מינימליים של MH או האנטיביוטיקה הקונבנציונלית tobramycin או meropenem, שהשתמשו בספירת הצלחות הקיימא כדי לזהות תאים פעילים מטבולית וצביעה חיה/מתה כדי לזהות את כל התאים הברי קיימא. מספר תאי ה-VBNC היה שווה למספר התאים הקיים פחות מספר התא הניתן לתרבית. בניסויים מסוימים, מספר התאים הניתנים לתרבית היה גבוה ממספר התאים הבר-קיימא, מה שנתן מספר שלילי של תאי VBNC; לפיכך, מספרי תאי VBNC לא הושוו ישירות. במקום זאת, הושוו מספרי תאים ניתנים לתרבות וברי-קיימא עבור כל טיפול. רק ל-P. aeruginosa שטופל בטוברמיצין היו פחות תאים ניתנים לתרבית באופן משמעותי מאשר תאים ברי קיימא, מה שמעיד על מספר גבוה יותר של תאי VBNC. פרוטוקול זה מהיר וקל וניתן להשתמש בו כדי להעריך אינדוקציה MH של תאי VBNC בחיידקים פתוגניים אחרים.

Introduction

חיידקים במצב תרדמה בר-קיימא אך לא מתורבת (VBNC) שורדים טיפול אנטיביוטי וגורמים למחלות זיהומיות חוזרות ולעיתים קטלניות 1,2,3. מוכרת לנו יותר היא עמידות לאנטיביוטיקה, המתרחשת באמצעות שינוי גנטי תורשתי4. השינוי הגנטי מספק עמידות לאנטיביוטיקה ספציפית על ידי מספר מנגנונים, כולל הגבלת ספיגת אנטיביוטיקה, הגדלת פליטת האנטיביוטיקה, שינוי מטרת האנטיביוטיקה או השבתת האנטיביוטיקה4. לעומת זאת, חיידקים במצבי תרדמה מציגים סבילות אנטיביוטית רחבה יותר ולא תורשתית על ידי הפחתת חילוף החומרים שלהם 2,3. אנטיביוטיקה מכוונת לתהליכים מטבוליים ספציפיים, כולל שכפול DNA וסינתזת דופן התא, ואינה יעילה נגד תאי VBNC לא פעילים מבחינה מטבולית4. תאי VBNC קיימים באופן סטוכסטי במספרים נמוכים לצד אחיהם הזהים גנטית הרגישים לאנטיביוטיקה ברוב אוכלוסיות החיידקים5. עם זאת, גורמי לחץ סביבתיים, כולל חשיפה לאנטיביוטיקה, גורמים לתאי חיידקים רגישים להיכנס למצב VBNC סובלני לאנטיביוטיקה 3,6. טיפול אנטיביוטי יהרוג תאים רגישים לאנטיביוטיקה בתוך האוכלוסייה, בעוד שתאי VBNC רדומים יישארו. כפי ששמם מרמז, תאי VBNC אינם ניתנים לתרבות על מדיה המתאימה לגידול אחיהם הפעילים מטבולית. עם זאת, הממברנות והחומר הגנטי שלהם אינם פגומים, והם יכולים להתרבות 7,8. כאשר מסירים אנטיביוטיקה, נדרשים גירויים ספציפיים כגון חומרים מזינים, טמפרטורה או גורמי מארח כדי להעיר את תאי VBNC ממצב התרדמה שלהם ולהחזיר את הצמיחה 3,9. תאי VBNC תועדו במיני חיידקים פתוגניים רבים, כולל P. aeruginosa ו- S. aureus, גורמים אטיולוגיים עיקריים לזיהומי פצעים10,11.

דבש שימש זה מכבר ביישומים רפואיים, כולל טיפול בפצעים, בגלל תכונותיו האנטיבקטריאליות12. דבש מנוקה (MH), המופק מפרחי שיח מנוקה (Leptospermum scoparium), ידוע בזכות פעילותו הקוטלת חיידקים רחבת טווח (נסקר ב-13,14,15). הוא הורג בהצלחה את רוב החיידקים הגורמים לזיהום אנושי שנבדקו, כולל זני חיידקים כגון סטפילוקוקוס זהוב עמיד למתיצילין ואנטרוקוקוס עמיד לוונקומיצין המפגינים עמידות תורשתית לאנטיביוטיקה מסורתית16,17. בנוסף, עמידות חיידקים מושרית ל-MH היא נדירה, ומתגלה רק בביופילמים של P. aeruginosa ו-Escherichia coli שנחשפו לדבש שגודלו בריכוזים הולכים וגדלים של תת-קבוצה של הדבש שנבדק 18,19,20,21. זה מצביע על כך שהמנגנונים האנטי-מיקרוביאליים של MH נבדלים מאנטיביוטיקה קונבנציונלית ועשויים לגרום לפחות תאי VBNC או ללא תאי VBNC. השערה זו נבדקה על ידי קביעת האופן שבו MH משפיע על אוכלוסיות VBNC בהשוואה לאנטיביוטיקה קונבנציונלית.

יש להבחין בין תאי VBNC לבין אחיהם הפעילים מטבולית ותאים מתים. תאים הניתנים לתרבית נספרים באמצעות טכניקת ספירת הצלחות הקיימת, שבה תאים מועברים לאמצעי תרבית שגרתיים ומודגרים לתקופה המספיקה למספיק חלוקות תאים כדי לגרום למושבות נצפות. פותחו מספר שיטות להבחנה בין תאי VBNC לתאים מתים על סמך הממברנות השלמות שלהם ושעתוק ברמה נמוכה. ספיגת מצע וצבע פלואורסצנטי, בשילוב עם מיקרוסקופיה או ציטומטריית זרימה, מאפשרת ספירה ישירה של תאים על ידי מיקרוסקופיה או ציטומטריית זרימה עם צבע המעיד על ממברנות שלמות22,23. בדיקות נשימה הדורשות ששרשרת הובלת האלקטרונים תהיה נוכחת בקרום תא שלם שימשו גם כדי להבחין בין תאים ברי קיימא לתאים מתים24. פותחו גם שיטות PCR כמותיות (qPCR) בשילוב עם צבעים משני DNA המונעים הגברה; רק DNA מתאים ברי קיימא יוגבר מכיוון שהממברנות השלמות אינן כוללות את הצבע25. למרות שתאי VBNC רדומים, הם עדיין משעתקים גנים ברמה נמוכה, וזה יכול לשמש גם כדי להבדיל אותם מתאים מתים באמצעות שעתוק הפוך PCR26.

בעבודה זו פותחה בדיקה לכימות תאי VBNC בשני חיידקים פתוגניים הגורמים לפצעים, S. aureus ו- P. aeruginosa, שטופלו ב- MH. הוא מתאר את הטיפול בחיידקים עם MH ואנטיביוטיקה קונבנציונלית ושימוש בספירת צלחות בת קיימא וצביעה חיה/מתה כדי לזהות תאים מתורבתים וברי-קיימא. פרוטוקול קל וזול זה יאפשר ניתוח של יכולתו של MH לגרום לתאי VBNC עמידים לאנטיביוטיקה בפתוגנים חיידקיים רבים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

מכיוון ש-P. aeruginosa (ATCC9721) ו-S. aureus (ATCC29213) מסווגים כסוכני בטיחות ביולוגית ברמה 2, החדרים שבהם מתבצעת העבודה חייבים להיות בעלי גישה מוגבלת ולהיות מצוידים בארון בטיחות ביולוגית למניפולציות שעלולות ליצור התזות או אירוסולים, כגון תרביות תסיסה וצנטריפוגות. בכל השלבים של פרוטוקול זה, יש ללבוש ציוד מגן אישי (PPE), כולל חלוק מעבדה, משקפי מגן וכפפות. כל הריאגנטים והציוד המשמשים בניסויים רשומים בטבלת החומרים.

1. הכנת מרק סטרילי ומדיה לתרבות אגר

  1. הכינו לוריא ברטאני ומולר הינטון, NaCl (0.85%), אנטיביוטיקה וכלי זכוכית.
    1. מכינים את אמצעי המרק לפי הוראות היצרן, מוסיפים אבקת אגר ל-1.5% למדיה האגר. הוסף 0.85 גרם NaCl ל 100 מ"ל של dH20 להכנת 0.85% NaCl. מרחו סרט חיטוי על הכלים, הניחו אותם בכלי בטוח לחיטוי וחיטוי אותם במחזור נוזלי המתאים לנפחים המשמשים.
    2. בסיום מחזור החיטוי, מצננים את האגר לכ-60 מעלות צלזיוס לפני ששופכים אותו לצלחות פטרי סטריליות.
  2. הכינו תמיסות מלאי של 100 מיקרוגרם/מ"ל של האנטיביוטיקה טוברמיצין ומרופנם ב-dH2O לדילול וטיפול בחיידקים. עקר את מלאי האנטיביוטיקה באמצעות מזרק סטרילי של 5 מ"ל המחובר למסנן סטרילי של 0.2 מיקרומטר.
    1. אחסן את מלאי האנטיביוטיקה המעוקר ב-20 מעלות צלזיוס במספר מנות קטנות כדי למנוע אובדן פעילות עקב מחזורי הקפאה-הפשרה מרובים.

2. אחזור הזנים Staphylococcus aureus ו-Pseudomonas aeruginosa המאוחסנים בארכיון מ-80 מעלות צלזיוס (יום 1)

  1. אסוף את החומרים לפסים של כמות קטנה של זני החיידקים הקפואים מבקבוקוני ההקפאה שלהם בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס לאגר לוריא ברטאני (LB). זה כולל מקלות עץ סטריליים מרובים וצלחת אגר LB המסומנת עם האורגניזם והתאריך.
  2. פתח את המקפיא -80 מעלות צלזיוס, הסר במהירות את הבקבוקונים המעניינים וסגור את דלת המקפיא. פתח כל בקבוקון ברצף והשתמש במקל סטרילי כדי לגרד כמות קטנה של חיידקים קפואים על צלחת האגר LB המסומנת כראוי. החזירו את מכסה הבקבוקון והחזירו אותו במהירות למקפיא של -80 מעלות צלזיוס.
  3. דגרו את לוחות האגר LB המחוסנים, עם צד האגר כלפי מעלה, בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתנאים אירוביים (אטמוספריים) למשך 18-24 שעות. לאחר תקופת הדגירה, אטמו את צלחות האגר LB המחוסנות עם סרט השתלה ואחסנו אותן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר משבוע. חסנו תרביות חיידקים טריות מהמלאי הקפוא של -80 מעלות צלזיוס מדי שבוע לפי הצורך.

3. הכנת S. aureus ו-P. aeruginosa לטיפול בדבש מאנוקה (MH) ובאנטיביוטיקה (יום 2)

  1. אסוף את החומרים הדרושים להתחלת תרבית מרק LB של כל זן, כולל מבחנות סטריליות קטנות, צנרת סרולוגית של 5 מ"ל, מרק LB סטרילי ולולאת חיסון. כמו כן, אספו פיפטור ידני או חשמלי לשימוש עם פיפטות סרולוגיות, מבער בונסן וחממה רועדת.
  2. בעבודה ליד להבת מבער בונסן השתמש בפיפט סרולוגי כדי להעביר 2 מ"ל מרק LB לשתי מבחנות סטריליות. עקר את לולאת החיסון בלהבת מבער הבונסן ולאחר מכן העביר רבע לולאה מלאה בחיידקים מצלחות אגר LB למבחנה המסומנת כראוי עם מרק LB.
    1. דגרו את המבחנה בתנאים אירוביים באינקובטור רועד (~250 סל"ד) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 18-24 שעות.

4. הכנת MH והקמת MH וטיפולים אנטיביוטיים של S. aureus ו- P. aeruginosa (T = 0) (יום 3)

  1. אסוף את החומרים הדרושים לניסוי, כולל מרק מולר הינטון וצלחות אגר, תרביות חיידקים של מרק LB מהיום השני, מבחנות סטריליות, מלאי האנטיביוטיקה על קרח, פיפטות (P20, P200 ו-P1000) וטיפים, צינורות 15 מ"ל, פיפטות סרולוגיות ופיפטור וצינורות מיקרופוגה.
    1. הכן את פתרונות המניות של 25% ו-50% MH טריים ביום הקמת הניסוי. בהתבסס על הצפיפות של MH (1.47 גרם/מ"ל), שקלו את הכמות המתאימה של MH בשפופרת סטרילית של 15 מ"ל והוסיפו את הכמות המתאימה של מרק מולר הינטון סטרילי. השעו מחדש את ה-MH על ידי הנחת הצינורות במים חמים והיפוכם לפי הצורך.
  2. הכן דילול של 1:1000 (כ-106 CFU/mL) של תרביות חיידקי הלילה בצינורות סטריליים של 15 מ"ל על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של תרבית החיידקים ל-10 מ"ל של מרק מולר הינטון.
    1. השתמש בתרביות המדוללות כדי להכין שלוש דגימות לכל מין חיידקים: בקרה לא מטופלת, דגימה שטופלה ב-MH (בריכוז המעכב המינימלי, MIC), ודגימה שטופלה באנטיביוטיקה (טוברמיצין עבור S. aureus או מרופנם עבור P. aeruginosa, ב-MIC).
    2. הוסף את תרבית החיידקים המדוללת, MH והאנטיביוטיקה המתאימה לדגימות בנפחים המצוינים בטבלה 1 ובטבלה 2.
  3. העבירו 0.1 מ"ל ו-0.5 מ"ל מהדגימה הלא מטופלת לצינורות מיקרו-צנטריפוגה סטריליים עבור ספירת הצלחות הקיימא (שלב 5) וצביעה חיה/מתה (שלב 6), בהתאמה, עבור דגימות T = 0.
    1. דגירה על דגימות ביקורת לא מטופלות, שטופלו ב-MH ומטופלות באנטיביוטיקה (טוברמיצין או מרופנם) בתנאים אירוביים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד (250 סל"ד) למשך 24 שעות. בצע את טכניקות ספירת הצלחות הקיימא (שלב 5) והצביעה החיה/מתה (שלב 6) על דגימות T=0 לא מטופלות.

5. קביעת התאים הניתנים לתרבית בדגימות בשיטת ספירת צלחות בת קיימא (ימים 3 - 5)

  1. ביום הרביעי, לאחר הדגירה של 24 שעות, אספו 0.1 מ"ל ו-0.5 מ"ל מכל דגימה בצינורות מיקרו-צנטריפוגה עבור ספירת הצלחות הקיימא והצביעה החיה/מתה (שלב 6), בהתאמה. אלה יהיו דגימות T = 24 שעות.
  2. בצע את ספירת הצלחות הקיימא על דגימות T = 0 ו- T = 24 שעות ביום איסוף על ידי הכנת דילול פי 10 של דגימות ספירת הצלחות הקיימות במרק LB כדי לקבל מספר תאים הניתן למנייה (~25-150).
    1. מורחים 50 מיקרוליטר מכל דגימה מדוללת על 1/2 צלחת אגר LB. דגרו את לוחות האגר LB בתנאים אירוביים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  3. למחרת, הסר את לוחות אגר LB מהחממה וזהה את צלחת הדילול שיש בה ~25-150 מושבות. ספרו את המספר המדויק של המושבות בצלחת והשתמשו בנוסחת היחידות היוצרות מושבה (CFU/mL= # מושבות שנספרו/ (מצופה נפח, מ"ל) (דילול בשימוש)) כדי לקבוע את מספר התאים הניתנים לתרבות למ"ל.
    הערה: הדגימה T = 0 תצופה ביום השלישי ותנותח ביום הרביעי; דגימות ה-T = 24 שעות יצופו ביום הרביעי וינותחו ביום החמישי.

6. קביעת התאים הקיימים בדגימות באמצעות צביעה חיה/מתת ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית (יום 3 או 4)

  1. אסוף את החומרים הנדרשים לצביעה חיה/מתה, כולל NaCl סטרילי של 0.85% כדי לשמור על סביבה אוסמוטית חיובית לתאים, פיפטים (P20, P200 ו-P1000), וקצות פיפט סטריליים, ערכת צביעה חיה/מתה לחיידקים והמוציטומטר חד פעמי. קבל גישה למיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) המוגדר לאיתור צבע SYTO 9, המכתים תאים חיים.
  2. הוסף 0.5 מ"ל של 0.85% NaCl ל-0.5 מ"ל של כל אחת מהדגימות החיות/מתות הבאות: כל הדגימות הלא מדוללות T = 0, T = 24 שעות MH לא מדוללות, ודגימות שטופלו באנטיביוטיקה, ודילול של 1:1000 של דגימת הבקרה הלא מטופלת T = 24 שעות.
    1. הקפד להכפיל את ספירת התאים החיים הסופית של כל הדגימות בשניים ולהכפיל את הבקרה המדוללת T = 24 שעות לא מטופלת ב-1000. שלב 1.5 מיקרוליטר של SYTO 9 ו -1.5 מיקרוליטר של יודיד פרופידיום לכל דגימה, ולאחר מכן הוסף 3 מיקרוליטר מהתערובת לכל דגימה. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 21 מעלות צלזיוס בחושך למשך 15 דקות.
  3. העבירו 6 מיקרוליטר מכל דגימה מוכתמת ומעורבת בעדינות להמוציטומטר חד פעמי וצפו בו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן FITC ועדשת אובייקטיבית פי 40. צלמו תמונה שמציגה גם את קווי הרשת של ההמוציטומטר וגם את התאים הירוקים החיים.
    1. ספרו את התאים הירוקים בשישה שדות לכל דגימה, ושימו לב למידות הרשת כך שניתן יהיה לחשב את מספר התאים הירוקים בכל נפח.
      הערה: מידות השדה בניסויים הנוכחיים הן 1.05 מ"מ x 0.6 מ"מ x 0.1 מ"מ, המקבילים ל-0.063 מ"מ3 או 6.3 x 10-5 מ"ל. כדי להשיג את מספר התאים ברי קיימא למ"ל, חלקו את מספר התאים החיים שנספרו ב-6.3 x 10-5 מ"ל, ולאחר מכן הכפילו אותם בשניים (או 2000 אם מדובר בבקרה הלא מטופלת T = 24 שעות).

7. קביעת מספר התאים ברי קיימא אך לא ניתנים לתרבות (VBNCs)

הערה: השתמש במספרי התאים הניתנים לתרבות המתקבלים מספירת הלוחות הקיימא ובמספר התא הבר-קיימא המתקבל מצביעה חיה/מתה כדי לקבוע את מספר ה-VBNCs.

  1. חשב VBNCs/mL על ידי הפחתת מספר התאים הניתנים לתרבית/מ"ל ממספר התאים ברי קיימא למ"ל.
  2. השתמש במבחן זוגות מותאמים של Wilcoxon כדי להשוות את ה-VBNCs/mL או התאים הניתנים לתרבית/מ"ל לתאים ברי קיימא/מ"ל עבור כל טיפול.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

צורות חיים חיידקיות ברות קיימא אך לא ניתנות לתרבות (VBNC) נגרמות על ידי גורמי לחץ, כולל טיפול אנטיביוטי, וגורמות לזיהומים חוזרים בשל הסבילות שלהם לאנטיביוטיקה. מכיוון ש-MH הוא אנטי-מיקרוביאלי רחב טווח שאליו זוהתה עמידות רק לעתים רחוקות, הועלתה השערה ש-MH גרם לפחות VBNCs מאשר אנט...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר זיהוי של אוכלוסיות תאי VBNC בחיידקים גורמי פצעים המטופלים בריכוזים מעכבים מינימליים (MICs) של MH ואנטיביוטיקה קונבנציונלית. שלבים קריטיים בפרוטוקול כללו הכנת דילול MH ביום הניסוי, מניעת אובדן דגימה במהלך צביעה חיה/מתה, וחישוב נכון של הנפח המנותח. עב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי שני מענקים מאוניברסיטת מזרח וושינגטון, מענק המחקר והיצירה של הפקולטה ל-A.R.C ומענק המחקר והפעילויות היצירתיות לתואר ראשון ל-L.T.B. ביל וקוני קרוס תרמו כספים ל-EWU לרכישת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך Leica DMIL עם מצלמה דיגיטלית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Mueller Hinton brothFisher BioreagentsB12322
Luria Bertani (LB) broth Fisher BioreagentsBP142602
BD Difco AgarFisher ScientificDF0812-07-1
sodium chlorideSigma S3014-500g
meropenemTargetMolT0224
tobramycinSelleck ChemicalsS2514
Staphylococcus aureus ATCCATCC29213
 Pseudomonas aeruginosaATCCATCC9721
shaking incubatorEppendorfM13520000
incubatorBenchmark ScientificH2200-H 
Manukaguard Manuka HoneyAmazonNA
DMIL inverted fluorescent microscope Leica Microsystems11521265
Digital cameraLeica Microsystems12730522
15 mL falcon tubesGenesee Scientific28-103
serological pipetsDiagnocineDP-LB0100005, DP-LB010010
Pipet Aid PipettorDrummond Scientific Company4-000-101
Bunsen burnerFisher ScientificS48108
Rainin pipetsPipette.comL-20, L-200, L-1000
balanceMettler ToledoXS603S
96-well plateFalcon351172
inoculating loopFisher Scientific13-104-5
isopropanolFisher ScientificBP2618-1
glass spreaderhomemadeNA
Live dead staining kit for bacteriaInvitrogenL7012
microfuge tubesBiologix Research CompanySKU 80-1500/P80-1500
tin foilCostcoNA
Figure making softwareGraphPadNAGraphPad Prism was used for making figures and conducting statistical analyses.

References

  1. Spoering, A., Lewis, K. Biofilms and planktonic cells of Pseudomonas aeruginosa have similar resistance to killing by antimicrobials. J Bacteriol. 183 (23), 6746-6751 (2001).
  2. Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis. J Bacteriol. 192 (23), 6191-6199 (2010).
  3. Li, L., Mendis, N., Trigui, H., Oliver, J. D., Faucher, S. P. The importance of the viable but non-culturable state in human bacterial pathogens. F Microbiol. 5, 00258(2014).
  4. Reygaert, W. C. An overview of the antimicrobial resistance mechanisms of bacteria. AIMS Microbiol. 4 (3), 482-450 (2018).
  5. Ayrapetyan, M., Williams, T. C., Baxter, R., Oliver, J. D. Viable but nonculturable and persister cells coexist stochastically and are induced by human serum. Infect Immun. 83 (11), 4194-4203 (2015).
  6. Cabral, D. J., Wurster, J. I., Belenky, P. Antibiotic persistence as a metabolic adaptation: Stress, metabolism, the host, and new directions. PHARH2. 11 (1), 11010014(2018).
  7. Heidelberg, J. F., et al. Effect of aerosolization on culturability and viability of gram-negative bacteria. Appl Environ Microbiol. 63 (9), 3585-3588 (1997).
  8. Cook, K. L., Bolster, C. H. Survival of Campylobacter jejuni and Escherichia coli in groundwater during prolonged starvation at low temperatures. J Appl Microbiol. 103 (3), 573-583 (2007).
  9. Xu, H. S., et al. Survival and viability of nonculturable Escherichia coli and Vibrio cholerae in the estuarine and marine environment. Microbl Ecol. 8 (4), 313-323 (1982).
  10. Qi, Z., Huang, Z., Liu, C. Metabolism differences of biofilm and planktonic Pseudomonas aeruginosa in viable but nonculturable state induced by chlorine stress. Sci Total Environ. 821, 153374(2022).
  11. Li, Y., et al. Study on the Viable but Non-culturable (VBNC) state formation of staphylococcus aureus and its control in food system. F Microbiol. 11, 599739(2020).
  12. Oryan, A., Alemzadeh, E., Moshiri, A. Biological properties and therapeutic activities of honey in wound healing: A narrative review and meta-analysis. J Tissue Viability. 25 (2), 98-118 (2016).
  13. Lusby, P. E., Coombes, A. L., Wilkinson, J. M. Bactericidal Activity of different honeys against pathogenic bacteria. Arch Med Res. 36 (5), 464-467 (2005).
  14. Mandal, M. D., Mandal, S. Honey: Its medicinal property and antibacterial activity. Asian Pac J Trop. Biomed. 1 (2), 154-160 (2011).
  15. Carter, D. A., et al. Therapeutic Manuka Honey: No longer so alternative. F Microbiol. 7, 00569(2016).
  16. Cooper, R. A., Molan, P. C., Harding, K. G. The sensitivity to honey of Gram-positive cocci of clinical significance isolated from wounds. J Appl Microbiol. 93 (5), 857-863 (2002).
  17. George Narelle May, C., Keith, F. Antibacterial Honey: In-vitro activity against clinical isolates of MRSA, VRE, and other multiresistant Gram-negative organisms. HMP Global Learning Network. , https://www.hmpgloballearningnetwork.com/site/wounds/article/7751 (2007).
  18. Blair, S. E., Cokcetin, N. N., Harry, E. J., Carter, D. A. The unusual antibacterial activity of medical-grade Leptospermum honey: Antibacterial spectrum, resistance and transcriptome analysis. Eur Soc Clin Microbiol. 28 (10), 1199-1208 (2009).
  19. Cooper, R. A., Jenkins, L., Henriques, A. F. M., Duggan, R. S., Burton, N. F. Absence of bacterial resistance to medical-grade manuka honey. Eur Soc Clin Microbiol. 29 (10), 1237-1241 (2010).
  20. Lu, J., et al. Honey can inhibit and eliminate biofilms produced by Pseudomonas aeruginosa. Sci Rep. 9 (1), 18160(2019).
  21. Bischofberger, A. M., Pfrunder Cardozo, K. R., Baumgartner, M., Hall, A. R. Evolution of honey resistance in experimental populations of bacteria depends on the type of honey and has no major side effects for antibiotic susceptibility. Evol Appl. 14 (5), 1314-1327 (2021).
  22. Cunningham, E., O'Byrne, C., Oliver, J. D. Effect of weak acids on Listeria monocytogenes survival: Evidence for a viable but nonculturable state in response to low pH. Food Control. 20 (12), 1141-1144 (2009).
  23. Kogure, K., Simidu, U., Taga, N. A tentative direct microscopic method for counting living marine bacteria. Can J Microbiol. 25 (3), 415-420 (1979).
  24. Albertini, M. C., et al. Use of multiparameter analysis for Vibrio alginolyticus viable but nonculturable state determination. Cytom J Int Soc Anal Cytol. 69 (4), 260-265 (2006).
  25. Nocker, A., Camper, A. K. Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. FEMS Microbiol Lett. 291 (2), 137-142 (2009).
  26. Trevors, J. T. Viable but non-culturable (VBNC) bacteria: Gene expression in planktonic and biofilm cells. J Microbiol Methods. 86 (2), 266-273 (2011).
  27. Ankley, L. M., Monteiro, M. P., Camp, K. M., O'Quinn, R., Castillo, A. R. Manuka honey chelates iron and impacts iron regulation in key bacterial pathogens. J App Microbiol. 128 (4), 1015-1024 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

218

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved