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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Le protocole présenté décrit une procédure de quantification des cellules viables mais non cultivables (VBNC) dans des cultures bactériennes traitées au miel de Manuka.

Résumé

La résistance aux antibiotiques et la tolérance des bactéries constituent une menace importante pour la santé mondiale. Les mécanismes contribuant à la résistance et à la tolérance aux antibiotiques comprennent les mutations génétiques et l’acquisition de gènes de résistance, ainsi que la transition vers l’état de dormance viable mais non cultivable (VBNC) et d’autres états de dormance. Bien que génétiquement identiques à leurs homologues non tolérants aux antibiotiques, les cellules VBNC échappent aux effets antibiotiques en restant métaboliquement inactives. Les antibiotiques ne sont efficaces que lorsque leurs processus cibles, tels que la réplication ou la transcription de l’ADN, sont actifs. Étant donné que les facteurs de stress environnementaux, en particulier les antibiotiques, peuvent pousser les bactéries à la dormance, d’autres antimicrobiens sont nécessaires pour minimiser ou prévenir cette réponse. L’antimicrobien Miel de Manuka (MH) est efficace contre de nombreuses bactéries, avec un développement rare de résistance. Ses mécanismes antimicrobiens à multiples facettes en font un agent précieux pour traiter les infections bactériennes. Cette recherche a examiné la récalcitrance de l’HM au développement de la résistance aux antibiotiques en testant l’hypothèse selon laquelle l’HM induit moins de cellules VBNC que les antibiotiques conventionnels. Pour étudier cela, un protocole a été développé pour traiter les bactéries responsables des plaies Staphylococcus aureus et Pseudomonas aeruginosa avec des concentrations inhibitrices minimales de MH ou des antibiotiques conventionnels tobramycine ou méropénème, qui ont ensuite utilisé la numération sur plaque viable pour identifier les cellules cultivables métaboliquement actives et la coloration vivante/morte pour identifier toutes les cellules viables. Le nombre de cellules VBNC était égal au nombre de cellules viables moins le nombre de cellules cultivables. Dans certaines expériences, le nombre de cellules cultivables était supérieur au nombre de cellules viables, ce qui donnait un nombre négatif de cellules VBNC ; par conséquent, les numéros de cellules VBNC n’ont pas été comparés directement. Au lieu de cela, les nombres de cellules cultivables et viables ont été comparés pour chaque traitement. Seul P. aeruginosa traité à la tobramycine avait significativement moins de cellules cultivables que de cellules viables, ce qui indique un nombre plus élevé de cellules VBNC. Ce protocole est rapide et facile et peut être utilisé pour évaluer l’induction MH des cellules VBNC chez d’autres bactéries pathogènes.

Introduction

Les bactéries à l’état de dormance viable mais non cultivable (VBNC) survivent au traitement antibiotique et provoquent des maladies infectieuses récurrentes et parfois mortelles 1,2,3. La résistance aux antibiotiques, qui se produit par le biais d’un changement génétique héréditaire4, nous est plus familière. Le changement génétique fournit une résistance à un antibiotique spécifique par plusieurs mécanismes, notamment la limitation de l’absorption d’un antibiotique, l’augmentation de l’efflux de l’antibiotique, la modification de la cible de l’antibiotique ou l’inactivation de l’antibiotique4. En revanche, les bactéries en état de dormance présentent une tolérance aux antibiotiques plus large et non héréditaire en réduisant leurmétabolisme2,3. Les antibiotiques ciblent des processus métaboliques spécifiques, notamment la réplication de l’ADN et la synthèse de la paroi cellulaire, et sont inefficaces contre les cellules VBNC métaboliquement inactives4. Les cellules VBNC existent de manière stochastique en faible nombre aux côtés de leurs frères et sœurs génétiquement identiques sensibles aux antibiotiques dans la plupart des populations bactériennes5. Cependant, les facteurs de stress environnementaux, y compris l’exposition aux antibiotiques, incitent les cellules bactériennes sensibles à entrer dans l’état VBNC tolérant aux antibiotiques 3,6. Le traitement antibiotique tuera les cellules sensibles aux antibiotiques au sein de la population, tandis que les cellules VBNC dormantes restent. Comme leur nom l’indique, les cellules VBNC ne sont pas cultivables sur des milieux adaptés à la croissance de leurs frères et sœurs métaboliquement actifs. Cependant, leurs membranes et leur matériel génétique ne sont pas endommagés et ils peuvent se reproduire 7,8. Lorsque les antibiotiques sont éliminés, des stimuli spécifiques tels que les nutriments, la température ou les facteurs de l’hôte sont nécessaires pour réveiller les cellules VBNC de leur état de dormance et restaurer la croissance 3,9. Des cellules VBNC ont été documentées chez de nombreuses espèces bactériennes pathogènes, notamment P. aeruginosa et S. aureus, principaux agents étiologiques des infections des plaies10,11.

Le miel est utilisé depuis longtemps dans des applications médicales, y compris le traitement des plaies, en raison de ses propriétés antibactériennes12. Le miel de Manuka (MH), dérivé des fleurs du buisson de Manuka (Leptospermum scoparium), a été noté pour son activité bactéricide à large spectre (examiné dans 13,14,15). Il tue avec succès la majorité des bactéries infectieuses humaines testées, y compris les souches bactériennes telles que le Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline et l’entérocoque résistant à la vancomycine qui présentent une résistance héréditaire aux antibiotiques traditionnels16,17. De plus, la résistance bactérienne induite à l’MH est rare, n’étant détectée que dans les biofilms de P. aeruginosa exposés au miel et d’Escherichia coli cultivés à des concentrations croissantes d’un sous-ensemble du miel testé 18,19,20,21. Cela suggère que les mécanismes antimicrobiens de l’HM sont distincts de ceux des antibiotiques conventionnels et peuvent induire moins ou pas de cellules VBNC. Cette hypothèse a été testée en déterminant l’impact de l’HM sur les populations de VBNC par rapport aux antibiotiques conventionnels.

Les cellules VBNC doivent être distinguées de leurs sœurs cultivables métaboliquement actives et des cellules mortes. Les cellules cultivables sont comptées à l’aide de la technique de comptage sur plaque viable, où les cellules sont transférées dans des milieux de culture habituels et incubées pendant une période suffisante pour qu’il y ait suffisamment de divisions cellulaires pour obtenir des colonies observables. Plusieurs méthodes pour distinguer les cellules VBNC des cellules mortes ont été développées sur la base de leurs membranes intactes et de leur transcription de bas niveau. L’absorption du substrat et du colorant fluorescent, combinée à la microscopie ou à la cytométrie en flux, permet de compter directement les cellules par microscopie ou cytométrie en flux avec une couleur qui indique des membranes intactes22,23. Des tests de respiration qui nécessitent la présence de la chaîne de transport d’électrons dans une membrane cellulaire intacte ont également été utilisés pour distinguer les cellules viables des cellules mortes24. Des méthodes de PCR quantitative (qPCR) combinées à des colorants modifiant l’ADN qui empêchent l’amplification ont également été développées ; seul l’ADN des cellules viables sera amplifié car les membranes intactes excluent le colorant25. Bien que les cellules VBNC soient dormantes, elles transcrivent toujours les gènes à un faible niveau, ce qui peut également être utilisé pour les distinguer des cellules mortes à l’aide de la transcription inverse PCR26.

Dans ce travail, un test a été mis au point pour quantifier les cellules VBNC chez deux bactéries pathogènes causant des plaies, S. aureus et P. aeruginosa, traitées par MH. Il décrit le traitement de la bactérie avec l’HM et les antibiotiques conventionnels et l’utilisation de la numération sur plaque viable et de la coloration vivante/morte pour détecter les cellules cultivables et viables. Ce protocole simple et peu coûteux permettra d’analyser la capacité de MH à induire des cellules VBNC résistantes aux antibiotiques dans de nombreux agents pathogènes bactériens.

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Protocole

Étant donné que P. aeruginosa (ATCC9721) et S. aureus (ATCC29213) sont classés comme agents de biosécurité de niveau 2, les salles où les travaux sont effectués doivent avoir un accès limité et être équipées d’une enceinte de biosécurité pour les manipulations qui pourraient créer des éclaboussures ou des aérosols, comme l’agitation et la centrifugation des cultures. À toutes les étapes de ce protocole, portez de l’équipement de protection individuelle (EPI), y compris une blouse de laboratoire, des lunettes de protection et des gants. Tous les réactifs et équipements utilisés dans les expériences sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation du bouillon stérile et des milieux de culture gélosés

  1. Préparez Luria Bertani et Mueller Hinton, du NaCl (0,85 %), des antibiotiques et de la verrerie.
    1. Préparez le milieu de bouillon selon les instructions du fabricant, en ajoutant de la poudre d’agar à 1,5 % pour le milieu de gélose. Ajouter 0,85 g de NaCl à 100 mL de dH20 pour préparer 0,85 % de NaCl. Appliquez du ruban adhésif autoclave sur les récipients, placez-les dans un récipient sans danger pour l’autoclave et autoclavez-les selon un cycle de liquide adapté aux volumes utilisés.
    2. Lorsque le cycle d’autoclave est terminé, refroidissez la gélose à environ 60 °C avant de la verser dans des boîtes de Pétri stériles.
  2. Préparer des solutions mères de 100 μg/mL d’antibiotiques tobramycine et méropénème dans dH2O pour la dilution et le traitement des bactéries. Stérilisez les stocks d’antibiotiques à l’aide d’une seringue stérile de 5 mL reliée à un filtre stérile de 0,2 μm.
    1. Conservez les stocks d’antibiotiques stérilisés à -20 °C dans plusieurs petites aliquotes pour éviter la perte d’activité due à plusieurs cycles de gel-dégel.

2. Récupération des souches archivées de Staphylococcus aureus et de Pseudomonas aeruginosa à -80 °C (jour 1)

  1. Rassemblez les matériaux pour le striage d’une petite partie aliquote des souches bactériennes congelées de leurs flacons de congélation à 80 °C sur la gélose Luria Bertani (LB). Cela comprend plusieurs bâtonnets en bois stériles et une plaque de gélose LB étiquetée avec l’organisme et la date.
  2. Ouvrez le congélateur à -80 °C, retirez rapidement les flacons qui vous intéressent et fermez la porte du congélateur. Ouvrez chaque flacon séquentiellement et utilisez un bâtonnet stérile pour gratter une petite quantité de bactéries congelées sur la plaque de gélose LB correctement étiquetée. Remettez le bouchon du flacon et remettez-le rapidement dans le congélateur à -80 °C.
  3. Incuber les plaques de gélose LB inoculées, côté gélose vers le haut, à 37 °C dans des conditions aérobies (atmosphériques) pendant 18 à 24 h. Après la période d’incubation, scellez les plaques de gélose LB inoculées avec du ruban adhésif et conservez-les à 4 °C pendant une semaine au maximum. Inoculer des cultures bactériennes fraîches à partir du stock congelé à -80 °C chaque semaine au besoin.

3. Préparation de S. aureus et P . aeruginosa pour le traitement au miel de Manuka (MH) et à l’antibiotique (jour 2)

  1. Rassemblez le matériel nécessaire au démarrage d’une culture en bouillon LB de chaque souche, y compris de petits tubes à essai stériles, des pipettes sérologiques de 5 ml, du bouillon LB stérile et une boucle d’inoculation. De plus, munissez-vous d’une pipette manuelle ou électrique à utiliser avec des pipettes sérologiques, un bec Bunsen et un incubateur à agitation.
  2. En travaillant à côté de la flamme du bec Bunsen, à l’aide d’une pipette sérologique, transférez 2 ml de bouillon LB dans deux tubes à essai stériles. Stérilisez l’anse d’inoculation dans la flamme du bec Bunsen, puis transférez un quart de boucle rempli de bactéries des plaques de gélose LB dans le tube à essai correctement étiqueté avec du bouillon LB.
    1. Incuber l’éprouvette dans des conditions aérobies dans un incubateur à agitation (~250 tr/min) à 37 °C pendant 18 à 24 h.

4. Préparation de l’EM et mise en place de l’EM et des traitements antibiotiques de S. aureus et P. aeruginosa (T = 0) (Jour 3)

  1. Rassemblez le matériel nécessaire à l’expérience, y compris des plaques de bouillon et de gélose Mueller Hinton, les cultures bactériennes du bouillon LB du jour 2, des tubes à essai stériles, les stocks d’antibiotiques sur glace, des pipettes (P20, P200 et P1000) et des pointes, des tubes de 15 ml, des pipettes sérologiques et une pipette, et des tubes de microfuge.
    1. Préparez les solutions mères à 25 % et à 50 % de MH fraîches le jour de la mise en place de l’expérience. D’après la densité de MH (1,47 g/mL), peser la quantité appropriée de MH dans un tube stérile de 15 mL et ajouter la quantité appropriée de bouillon stérile Mueller Hinton. Remettez le MH en suspension en plaçant les tubes dans de l’eau tiède et en les inversant au besoin.
  2. Préparer une dilution de 1:1000 (environ 10 à6 UFC/mL) des cultures bactériennes de nuit dans des tubes stériles de 15 mL en ajoutant 10 μL de la culture bactérienne à 10 mL de bouillon Mueller Hinton.
    1. À l’aide des cultures diluées, préparer trois échantillons pour chaque espèce bactérienne : un échantillon témoin non traité, un échantillon traité à l’HM (à la concentration minimale inhibitrice, CMI) et un échantillon traité aux antibiotiques (tobramycine pour S. aureus ou méropénème pour P. aeruginosa, à la CMI).
    2. Ajouter la culture bactérienne diluée, la MH et l’antibiotique approprié aux échantillons dans les volumes indiqués dans les tableaux 1 et 2.
  3. Transvaser 0,1 mL et 0,5 mL de l’échantillon non traité dans des tubes de microcentrifugation stériles pour la numération sur plaque viable (étape 5) et la coloration vivante/morte (étape 6), respectivement, pour les échantillons T = 0.
    1. Incuber les échantillons témoins non traités, traités par MH et traités aux antibiotiques (tobramycine ou méropénème) dans des conditions aérobies à 37 °C dans un incubateur à agitation (250 tr/min) pendant 24 h. Effectuer les techniques de comptage sur plaque viable (étape 5) et de coloration vivante/morte (étape 6) sur les échantillons non traités T= 0.

5. Détermination des cellules cultivables dans les échantillons à l’aide de la méthode de comptage sur plaque viable (jours 3 à 5)

  1. Le jour 4, après l’incubation de l’échantillon de 24 heures, prélever 0,1 mL et 0,5 mL de chaque échantillon dans des tubes de microcentrifugation pour la numération sur plaque viable et la coloration vivante/morte (étape 6), respectivement. Il s’agira des échantillons T = 24 h.
  2. Effectuer la numération sur plaque viable sur des échantillons T = 0 et T = 24 h le jour où ils sont prélevés en préparant des dilutions 10 fois des échantillons viables sur plaque dans un bouillon LB pour obtenir un nombre dénombrable de cellules (~25-150).
    1. Étaler 50 μL de chaque échantillon dilué sur 1/2 d’une plaque de gélose LB. Incuber les plaques de gélose LB dans des conditions aérobies à 37 °C pendant 24 h.
  3. Le lendemain, retirez les plaques de gélose LB de l’incubateur et identifiez la plaque de dilution qui a ~25-150 colonies. Comptez le nombre exact de colonies sur la plaque et utilisez la formule des unités formant colonies (UFC/mL = # colonies comptées/ (volume sur plaques, mL) (dilution utilisée)) pour déterminer le nombre de cellules cultivables par mL.
    REMARQUE : L’échantillon T = 0 sera plaqué le jour 3 et analysé le jour 4 ; les échantillons T = 24 h seront plaqués le jour 4 et analysés le jour 5.

6. Détermination des cellules viables dans les échantillons à l’aide de la coloration vivante/morte et de la microscopie fluorescente (jour 3 ou 4)

  1. Rassemblez les matériaux nécessaires à la coloration vivante/morte, y compris du NaCl stérile à 0,85 % pour maintenir un environnement osmotique favorable aux cellules, des pipettes (P20, P200 et P1000) et des pointes de pipette stériles, un kit de coloration vivante/morte pour les bactéries et un hémocytomètre jetable. Accédez à un microscope fluorescent équipé d’un filtre à isothiocyanate de fluorescéine (FITC) pour détecter le colorant SYTO 9, qui colore les cellules vivantes.
  2. Ajouter 0,5 mL de NaCl à 0,85 % à 0,5 mL de chacun des échantillons vivants/morts suivants : tous les échantillons T = 0 non dilués, T = 24 h MH non dilués et les échantillons traités aux antibiotiques, et une dilution de 1:1000 de l’échantillon témoin T = 24 h non traité.
    1. Assurez-vous de multiplier par deux le nombre final de cellules vivantes de tous les échantillons et de multiplier par 1000 le nombre de cellules vivantes diluées T = 24 h non traitées. Combinez 1,5 μL de SYTO 9 et 1,5 μL d’iodure de propidium par échantillon, puis ajoutez 3 μL du mélange à chaque échantillon. Incuber les échantillons à 21 °C dans l’obscurité pendant 15 min.
  3. Transférez 6 μL de chaque échantillon coloré et délicatement mélangé dans un hémocytomètre jetable et visualisez-le à l’aide d’un microscope fluorescent avec le filtre FITC et l’objectif 40x. Prenez une photo qui montre à la fois les lignes de la grille de l’hémocytomètre et les cellules vertes vivantes.
    1. Comptez les cellules vertes dans six champs par échantillon, en notant les dimensions de la grille afin que le nombre de cellules vertes par volume puisse être calculé.
      REMARQUE : Les dimensions de terrain dans les expériences actuelles sont de 1,05 mm x 0,6 mm x 0,1 mm, ce qui correspond à 0,063 mm3 ou 6,3 x 10-5 mL. Pour obtenir le nombre de cellules viables par mL, il faut diviser le nombre de cellules vivantes comptées par 6,3 x 10-5 mL, puis les multiplier par deux (ou 2000 s’il s’agit du T = 24 h de contrôle non traité).

7. Détermination du nombre de cellules viables mais non cultivables (VBNC)

REMARQUE : Utiliser les numéros de cellules cultivables obtenus à partir de la numération sur plaque viable et le nombre de cellules viables obtenues à partir de la coloration vivante/morte pour déterminer le nombre de VBNC.

  1. Calculez les VBNC/mL en soustrayant le nombre de cellules cultivables/mL du nombre de cellules viables par mL.
  2. Utilisez un test de Wilcoxon par paires appariées pour comparer les VBNC/mL ou les cellules cultivables/mL aux cellules viables/mL pour chaque traitement.

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Résultats

Les formes de vie bactériennes viables mais non cultivables (VBNC) sont induites par des facteurs de stress, y compris le traitement antibiotique, et provoquent des infections récurrentes en raison de leur tolérance aux antibiotiques. Étant donné que l’HM est un antimicrobien à large spectre auquel la résistance a rarement été détectée, on a émis l’hypothèse qu’elle induisait moins d’AGVN que les antibiotiques conventionnels. La méthode décrite ici a été utilisé...

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Discussion

Le protocole décrit ici permet de détecter les populations de cellules VBNC dans les bactéries responsables des plaies traitées avec des concentrations minimales inhibitrices (CMI) de MH et d’antibiotiques conventionnels. Les étapes critiques du protocole comprenaient la préparation des dilutions de MH le jour de l’expérience, la prévention de la perte d’échantillon lors de la coloration vivante/morte et le calcul correct du volume analysé. Pour cette étude et d’autres...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été financé par deux subventions de l’Eastern Washington University, la subvention de recherche et de travail créatif de la faculté à A.R.C et la subvention de recherche et d’activités créatives de premier cycle à L.T.B. Bill et Connie Cross ont fait don de fonds à l’EWU pour acheter le microscope à fluorescence inversée Leica DMIL avec un appareil photo numérique.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Mueller Hinton brothFisher BioreagentsB12322
Luria Bertani (LB) broth Fisher BioreagentsBP142602
BD Difco AgarFisher ScientificDF0812-07-1
sodium chlorideSigma S3014-500g
meropenemTargetMolT0224
tobramycinSelleck ChemicalsS2514
Staphylococcus aureus ATCCATCC29213
 Pseudomonas aeruginosaATCCATCC9721
shaking incubatorEppendorfM13520000
incubatorBenchmark ScientificH2200-H 
Manukaguard Manuka HoneyAmazonNA
DMIL inverted fluorescent microscope Leica Microsystems11521265
Digital cameraLeica Microsystems12730522
15 mL falcon tubesGenesee Scientific28-103
serological pipetsDiagnocineDP-LB0100005, DP-LB010010
Pipet Aid PipettorDrummond Scientific Company4-000-101
Bunsen burnerFisher ScientificS48108
Rainin pipetsPipette.comL-20, L-200, L-1000
balanceMettler ToledoXS603S
96-well plateFalcon351172
inoculating loopFisher Scientific13-104-5
isopropanolFisher ScientificBP2618-1
glass spreaderhomemadeNA
Live dead staining kit for bacteriaInvitrogenL7012
microfuge tubesBiologix Research CompanySKU 80-1500/P80-1500
tin foilCostcoNA
Figure making softwareGraphPadNAGraphPad Prism was used for making figures and conducting statistical analyses.

Références

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