JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Sunulan protokol, Manuka Balı ile muamele edilen bakteri kültürlerinde Canlı Ancak Kültürlenemeyen Hücreleri (VBNC) ölçmek için bir prosedürü açıklar.

Özet

Bakteriler arasındaki antibiyotik direnci ve toleransı, küresel sağlık için önemli bir tehdit oluşturmaktadır. Antibiyotik direncine ve toleransına katkıda bulunan mekanizmalar arasında sırasıyla genetik mutasyonlar ve direnç genlerinin kazanılması ve Canlı Ancak Kültürlenemez (VBNC) ve diğer uyku hallerine geçiş yer alır. Genetik olarak antibiyotiğe toleranslı olmayan muadilleriyle aynı olmasına rağmen, VBNC hücreleri metabolik olarak inaktif kalarak antibiyotik etkilerinden kaçar. Antibiyotikler, yalnızca DNA replikasyonu veya transkripsiyon gibi hedef süreçleri aktif olduğunda etkilidir. Çevresel stres faktörleri, özellikle antibiyotikler, bakterileri uyku haline getirebileceğinden, bu yanıtı en aza indirmek veya önlemek için alternatif antimikrobiyallere ihtiyaç vardır. Antimikrobiyal Manuka Balı (MH), nadir direnç gelişimi ile birçok bakteriye karşı etkilidir. Çok yönlü antimikrobiyal mekanizmaları, onu bakteriyel enfeksiyonları tedavi etmek için değerli bir ajan haline getirir. Bu araştırma, MH'nin geleneksel antibiyotiklere göre daha az VBNC hücresi indüklediği hipotezini test ederek antibiyotik direnci gelişimine karşı MH inatçılığını araştırdı. Bunu araştırmak için, yaraya neden olan bakterileri tedavi etmek için bir protokol geliştirildi Staphylococcus aureus ve Pseudomonas aeruginosa minimum inhibitör MH konsantrasyonları veya geleneksel antibiyotikler tobramisin veya meropenem ile, daha sonra metabolik olarak aktif kültürlenebilir hücreleri tanımlamak için canlı plaka sayısını ve tüm canlı hücreleri tanımlamak için canlı / ölü boyamayı kullandı. VBNC hücrelerinin sayısı, canlı hücre sayısı eksi kültürlenebilir hücre sayısına eşitti. Bazı deneylerde, kültürlenebilir hücre sayısı, canlı hücre sayısından daha yüksekti ve negatif sayıda VBNC hücresi verdi; bu nedenle, VBNC hücre sayıları doğrudan karşılaştırılmadı. Bunun yerine, her tedavi için kültürlenebilir ve canlı hücre sayıları karşılaştırıldı. Sadece tobramisin ile tedavi edilen P. aeruginosa , canlı hücrelerden önemli ölçüde daha az kültürlenebilir hücreye sahipti, bu da daha fazla sayıda VBNC hücresine işaret ediyor. Bu protokol hızlı ve kolaydır ve diğer patojenik bakterilerde VBNC hücrelerinin MH indüksiyonunu değerlendirmek için kullanılabilir.

Giriş

Canlı Ama Kültürlenemez (VBNC) uyku halindeki bakteriler antibiyotik tedavisinden sağ çıkar ve tekrarlayan ve bazen ölümcül bulaşıcı hastalıklara neden olur 1,2,3. Bize daha tanıdık gelen, kalıtsal bir genetik değişim yoluyla ortaya çıkan antibiyotik direncidir4. Genetik değişiklik, bir antibiyotiğin alımını sınırlamak, antibiyotiğin akışını artırmak, antibiyotik hedefini değiştirmek veya antibiyotiği inaktive etmek dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalarla spesifik bir antibiyotiğe direnç sağlar4. Buna karşılık, uyku halindeki bakteriler metabolizmalarını azaltarak daha geniş ve kalıtsal olmayan bir antibiyotik toleransı sergilerler 2,3. Antibiyotikler, DNA replikasyonu ve hücre duvarı sentezi dahil olmak üzere spesifik metabolik süreçleri hedefler ve metabolik olarak aktif olmayan VBNC hücrelerine karşı etkisizdir4. VBNC hücreleri, çoğu bakteri popülasyonunda genetik olarak aynı antibiyotiğe duyarlı kardeşlerinin yanı sıra stokastik olarak düşük sayılarda bulunur5. Bununla birlikte, antibiyotik maruziyeti de dahil olmak üzere çevresel stres faktörleri, duyarlı bakteri hücrelerinin antibiyotiğe toleranslı VBNC durumunagirmesine neden olur 3,6. Antibiyotik tedavisi, popülasyondaki antibiyotiğe duyarlı hücreleri öldürürken, uykuda olan VBNC hücreleri kalır. Adından da anlaşılacağı gibi, VBNC hücreleri metabolik olarak aktif kardeşlerinin büyümesi için uygun ortamlarda kültürlenemez. Bununla birlikte, zarları ve genetik materyalleri zarar görmemiştir veüreyebilirler 7,8. Antibiyotikler çıkarıldığında, VBNC hücrelerini uyku halinden uyandırmak ve büyümeyi eski haline getirmek için besinler, sıcaklık veya konak faktörleri gibi spesifik uyaranlar gereklidir 3,9. VBNC hücreleri, yara enfeksiyonlarının başlıca etiyolojik ajanları olan P. aeruginosa ve S. aureus dahil olmak üzere birçok patojenik bakteri türünde belgelenmiştir10,11.

Bal, antibakteriyel özellikleri nedeniyle yara tedavisi de dahil olmak üzere tıbbi uygulamalarda uzun süredir kullanılmaktadır12. Manuka çalısının (Leptospermum scoparium) çiçeklerinden elde edilen Manuka Balı (MH), geniş spektrumlu bakterisidal aktivitesi ile belirtilmiştir (13,14,15'te gözden geçirilmiştir). Geleneksel antibiyotiklere kalıtsal direnç sergileyen Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus ve Vankomisine Dirençli Enterococcus gibi bakteri suşları da dahil olmak üzere test edilen insan enfeksiyonuna neden olan bakterilerin çoğunu başarıyla öldürür16,17. Ek olarak, MH'ye karşı indüklenmiş bakteri direnci nadirdir, sadece bala maruz kalan P. aeruginosa biyofilmlerinde ve test edilen balın bir alt kümesinin artan konsantrasyonlarında kültürlenen Escherichia coli'de tespit edilir 18,19,20,21. Bu, MH'nin antimikrobiyal mekanizmalarının geleneksel antibiyotiklerden farklı olduğunu ve daha az VBNC hücresine neden olabileceğini veya hiç VBNC hücresi indükleyemeyeceğini düşündürmektedir. Bu hipotez, MH'nin geleneksel antibiyotiklere kıyasla VBNC popülasyonlarını nasıl etkilediğini belirleyerek test edildi.

VBNC hücreleri, metabolik olarak aktif kültürlenebilir kardeşlerinden ve ölü hücrelerden ayırt edilmelidir. Kültürlenebilir hücreler, hücrelerin rutin kültür ortamına aktarıldığı ve gözlemlenebilir kolonilerle sonuçlanacak kadar hücre bölünmesi için yeterli bir süre boyunca inkübe edildiği canlı plaka sayımı tekniği kullanılarak sayılır. VBNC hücrelerini ölü hücrelerden ayırt etmek için sağlam zarlarına ve düşük seviyeli transkripsiyonlarına dayalı olarak çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Mikroskopi veya akış sitometrisi ile birleştirilen substrat ve floresan boya alımı, sağlam zarları22,23 gösteren bir renkle mikroskopi veya akış sitometrisi ile hücrelerin doğrudan sayılmasına izin verir. Elektron taşıma zincirinin sağlam bir hücre zarında bulunmasını gerektiren solunum testleri, canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için de kullanılmıştır24. Amplifikasyonu önleyen DNA modifiye edici boyalarla birleştirilmiş kantitatif PCR (qPCR) yöntemleri de geliştirilmiştir; sadece canlı hücrelerden gelen DNA, sağlam zarlarboyayı 25 dışladığı için amplifiye edilecektir. VBNC hücreleri uykuda olmalarına rağmen, yine de genleri düşük bir seviyede kopyalarlar ve bu, ters transkripsiyon PCR26 kullanarak onları ölü hücrelerden ayırt etmek için de kullanılabilir.

Bu çalışmada, MH ile tedavi edilen iki yaraya neden olan patojenik bakteri olan S. aureus ve P. aeruginosa'da VBNC hücrelerini ölçmek için bir test geliştirilmiştir. Bakterilerin MH ve konvansiyonel antibiyotiklerle tedavisini ve kültürlenebilir ve canlı hücreleri tespit etmek için canlı plaka sayısı ve canlı/ölü boyamanın kullanımını açıklar. Bu kolay ve ucuz protokol, MH'nin birçok bakteriyel patojende antibiyotiğe dirençli VBNC hücrelerini indükleme yeteneğinin analizine izin verecektir.

Protokol

P. aeruginosa (ATCC9721) ve S. aureus (ATCC29213) Biyogüvenlik Seviye 2 ajanları olarak sınıflandırıldığından, çalışmanın yürütüldüğü odaların sınırlı erişime sahip olması ve karıştırma ve santrifüjleme kültürleri gibi sıçrama veya aerosol oluşturabilecek manipülasyonlar için bir biyogüvenlik kabini ile donatılması gerekir. Bu protokolün tüm adımlarında laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve eldiven dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanın. Deneylerde kullanılan tüm reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Steril et suyu ve agar kültür ortamının hazırlanması

  1. Luria Bertani ve Mueller Hinton, NaCl (% 0.85), antibiyotikler ve cam eşyalar hazırlayın.
    1. Et suyu ortamını üreticinin talimatlarına göre hazırlayın ve agar ortamı için% 1,5'e kadar agar tozu ekleyin. % 0.85 NaCl hazırlamak için 100 mL dH20'a 0.85 g NaCl ekleyin. Kaplara otoklav bandı uygulayın, otoklav için güvenli bir kaba koyun ve kullanılan hacimlere uygun bir sıvı döngüsünde otoklavlayın.
    2. Otoklav döngüsü tamamlandığında, agarı steril Petri kaplarına dökmeden önce yaklaşık 60 °C'ye soğutun.
  2. Bakterilerin seyreltilmesi ve tedavisi için dH2O içinde tobramisin ve meropenem antibiyotiklerinin 100 μg / mL stok çözeltilerini hazırlayın. Antibiyotik stoklarını 0,2 μm steril filtreye bağlı 5 mL steril bir şırınga kullanarak sterilize edin.
    1. Sterilize edilmiş antibiyotik stoklarını -20 °C'de, çoklu donma-çözülme döngüleri nedeniyle aktivite kaybını önlemek için birden fazla küçük alikotta saklayın.

2. -80 °C'den arşivlenmiş Staphylococcus aureus ve Pseudomonas aeruginosa suşlarının alınması (1. Gün)

  1. 80 ° C'lik dondurucu şişelerinden Luria Bertani (LB) agar'a donmuş bakteri suşlarının küçük bir alikotunu çizgi haline getirmek için malzemeleri toplayın. Bu, birden fazla steril tahta çubuk ve organizma ve tarih ile etiketlenmiş bir LB agar plakası içerir.
  2. -80 °C dondurucuyu açın, ilgilendiğiniz şişeleri hızlı bir şekilde çıkarın ve dondurucu kapısını kapatın. Her şişeyi sırayla açın ve az miktarda donmuş bakteriyi uygun şekilde etiketlenmiş LB agar plakasına kazımak için steril bir çubuk kullanın. Flakon kapağını değiştirin ve hızlı bir şekilde -80 °C dondurucuya geri koyun.
  3. Aşılanmış LB agar plakalarını, agar tarafı yukarı bakacak şekilde, aerobik (atmosferik) koşullar altında 37 °C'de 18-24 saat inkübe edin. Kuluçka süresinden sonra, aşılanmış LB agar plakalarını aşılama bandı ile kapatın ve bir haftadan fazla olmamak üzere 4 ° C'de saklayın. İhtiyaç duyulduğunda -80 °C donmuş stoktan taze bakteri kültürlerini haftada bir aşılayın.

3. Manuka Balı (MH) ve antibiyotik ile tedavi için S. aureus ve P. aeruginosa'nın hazırlanması (2. Gün)

  1. Küçük steril test tüpleri, 5 mL serolojik pipetler, steril LB suyu ve bir aşılama döngüsü dahil olmak üzere her suşun bir LB et suyu kültürünü başlatmak için gerekli malzemeleri toplayın. Ayrıca, serolojik pipetler, bir Bunsen brülörü ve çalkalama inkübatörü ile kullanmak için manuel veya elektrikli bir pipetleyici toplayın.
  2. Bunsen brülör alevinin yanında çalışarak, 2 mL LB suyunu iki steril test tüpüne aktarmak için serolojik bir pipet kullanın. Aşılama halkasını Bunsen brülör alevi içinde sterilize edin ve ardından LB agar plakalarından bakteri dolu çeyrek halkayı LB suyu ile uygun şekilde etiketlenmiş test tüpüne aktarın.
    1. Test tüpünü aerobik koşullar altında, çalkalanan (~ 250 rpm) bir inkübatörde 37 ° C'de 18-24 saat inkübe edin.

4. MH'nin hazırlanması ve MH'nin kurulması ve S. aureus ve P. aeruginosa'nın antibiyotik tedavileri (T = 0) (3. Gün)

  1. Mueller Hinton suyu ve agar plakaları, 2. günden itibaren LB suyu bakteri kültürleri, steril test tüpleri, buz üzerindeki antibiyotik stokları, pipetler (P20, P200 ve P1000) ve uçlar, 15 mL tüpler, serolojik pipetler ve bir pipetleyici ve mikrofüj tüpleri dahil olmak üzere deney için gerekli malzemeleri toplayın.
    1. %25 ve %50 MH stok çözeltilerini deneyin kurulduğu gün taze olarak hazırlayın. MH'nin yoğunluğuna (1.47 g / mL) bağlı olarak, steril 15 mL'lik bir tüpte uygun miktarda MH'yi tartın ve uygun miktarda steril Mueller Hinton suyu ekleyin. Tüpleri ılık suya koyarak ve gerektiği gibi ters çevirerek MH'yi yeniden askıya alın.
  2. 10 mL Mueller Hinton et suyuna 10 μL bakteri kültürü ekleyerek steril 15 mL tüplerde gece boyunca bakteri kültürlerinin 1:1000 seyreltmesini (yaklaşık 106 CFU / mL) hazırlayın.
    1. Her bakteri türü için üç numune hazırlamak için seyreltilmiş kültürleri kullanın: işlenmemiş bir kontrol, MH ile muamele edilmiş bir numune (minimum inhibitör konsantrasyonda, MIC) ve antibiyotikle muamele edilmiş bir numune ( S. aureus için tobramisin veya P. aeruginosa için meropenem, MIC'de).
    2. Seyreltilmiş bakteri kültürünü, MH'yi ve uygun antibiyotiği Tablo 1 ve Tablo 2'de belirtilen hacimlerdeki örneklere ekleyin.
  3. T = 0 numuneler için sırasıyla canlı plaka sayımı (adım 5) ve canlı/ölü boyama (adım 6) için işlenmemiş numunenin 0.1 mL ve 0.5 mL'sini steril mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
    1. İşlenmemiş kontrol, MH ile muamele edilmiş ve antibiyotikle muamele edilmiş (tobramisin veya meropenem) numuneleri aerobik koşullar altında 37 ° C'de 24 saat boyunca çalkalama inkübatörde (250 rpm) inkübe edin. T = 0 işlenmemiş numuneler üzerinde canlı plaka sayımı (adım 5) ve canlı/ölü boyama (adım 6) tekniklerini uygulayın.

5. Numunelerde kültüre alınabilen hücrelerin canlı plaka sayımı yöntemi kullanılarak belirlenmesi (Gün 3 - 5)

  1. 4. Günde, 24 saatlik numune inkübasyonunu takiben, canlı plaka sayısı ve canlı / ölü boyama (adım 6) için mikrosantrifüj tüplerinde sırasıyla her numuneden 0.1 mL ve 0.5 mL toplayın. Bunlar T = 24 saatlik örnekler olacaktır.
  2. Sayılabilir sayıda hücre (~ 25-150) elde etmek için LB suyunda canlı plaka sayısı numunelerinin 10 kat seyreltmelerini hazırlayarak, toplandıkları gün T = 0 ve T = 24 saat numunelerde canlı plaka sayımını gerçekleştirin.
    1. Her seyreltilmiş numuneden 50 μL'yi bir LB agar plakasının 1/2'sine yayın. LB agar plakalarını aerobik koşullar altında 37 °C'de 24 saat inkübe edin.
  3. Ertesi gün, LB agar plakalarını inkübatörden çıkarın ve ~25-150 koloniye sahip seyreltme plakasını belirleyin. Plakadaki kolonilerin tam sayısını sayın ve mL başına kültürlenebilir hücre sayısını belirlemek için koloni oluşturan birimler (CFU) formülünü (CFU/mL= # koloni sayıldı/ (hacim kaplamalı, mL) (kullanılan seyreltme)) kullanın.
    NOT: T = 0 numunesi 3. günde kaplanacak ve 4. günde analiz edilecektir; T = 24 saatlik numuneler 4. günde kaplanacak ve 5. günde analiz edilecektir.

6. Canlı/ölü boyama ve floresan mikroskobu kullanılarak örneklerdeki canlı hücrelerin belirlenmesi (3. veya 4. gün)

  1. Hücreler için uygun bir ozmotik ortam sağlamak için %0,85 steril NaCl, pipetler (P20, P200 ve P1000) ve steril pipet uçları, bakteriler için canlı/ölü boyama kiti ve tek kullanımlık bir hemositometre dahil olmak üzere canlı/ölü boyama için gerekli malzemeleri toplayın. Canlı hücreleri lekeleyen SYTO 9 boyasını tespit etmek için floresein izotiyosiyanat (FITC) filtre setine sahip bir floresan mikroskobuna erişim elde edin.
  2. Aşağıdaki canlı / ölü numunelerin her birinden 0.5 mL'ye 0.5 mL% 0.85 NaCl ekleyin: tüm seyreltilmemiş T = 0 numuneler, seyreltilmemiş T = 24 h MH ve antibiyotikle muamele edilmiş numuneler ve T = 24 saat işlenmemiş kontrol numunesinin 1: 1000 seyreltilmesi.
    1. Tüm numunelerin son canlı hücre sayımlarını iki ile çarptığınızdan ve seyreltilmiş T = 24 saat işlenmemiş kontrolü 1000 ile çarptığınızdan emin olun. Numune başına 1,5 μL SYTO 9 ve 1,5 μL propidyum iyodürü birleştirin ve ardından her numuneye 3 μL karışım ekleyin. Numuneleri karanlıkta 21 °C'de 15 dakika inkübe edin.
  3. Her lekeli, hafifçe karıştırılmış numunenin 6 μL'sini tek kullanımlık bir hemositometreye aktarın ve FITC filtreli ve 40x objektif lensli bir floresan mikroskop kullanarak görüntüleyin. Hem hemositometre ızgara çizgilerini hem de canlı yeşil hücreleri gösteren bir fotoğraf çekin.
    1. Hacim başına yeşil hücre sayısının hesaplanabilmesi için ızgaranın boyutlarına dikkat ederek örnek başına altı alanda yeşil hücreleri sayın.
      NOT: Mevcut deneylerdeki alan boyutları 1.05 mm x 0.6 mm x 0.1 mm'dir, bu da 0.063mm3 veya 6.3 x 10'a karşılık gelir.-5 mL. mL başına canlı hücre sayısını elde etmek için, sayılan canlı hücre sayısını 6.3 x 10-5 mL'ye bölün ve ardından bunları iki ile çarpın (veya T = 24 saat işlenmemiş kontrol ise 2000).

7. Canlı ancak kültürlenemeyen hücrelerin (VBNC'ler) sayısının belirlenmesi

NOT: VBNC'lerin sayısını belirlemek için canlı plaka sayısından elde edilen kültürlenebilir hücre sayılarını ve canlı/ölü boyamadan elde edilen canlı hücre sayısını kullanın.

  1. mL başına canlı hücre sayısından kültürlenebilir hücre / mL sayısını çıkararak VBNC'leri / mL'yi hesaplayın.
  2. Her tedavi için VBNC'leri / mL'leri veya kültürlenebilir hücreleri / mL'yi canlı hücreler / mL ile karşılaştırmak için bir Wilcoxon eşleştirilmiş çiftler testi kullanın.

Sonuçlar

Canlı ancak kültürlenemeyen (VBNC) bakteriyel yaşam formları, antibiyotik tedavisi de dahil olmak üzere stresörler tarafından indüklenir ve antibiyotik toleransları nedeniyle tekrarlayan enfeksiyonlara neden olur. MH, direncin nadiren tespit edildiği geniş spektrumlu bir antimikrobiyal olduğundan, MH'nin geleneksel antibiyotiklerden daha az VBNC'yi indüklediği varsayılmıştır. Burada tarif edilen yöntem, yaraya neden olan iki bakteri, S. aureus ve P. aerug...

Tartışmalar

Burada açıklanan protokol, MH ve konvansiyonel antibiyotiklerin minimum inhibitör konsantrasyonları (MIC'ler) ile tedavi edilen yaraya neden olan bakterilerde VBNC hücre popülasyonlarının saptanmasına izin verir. Protokoldeki kritik adımlar, MH seyreltmelerinin deney gününde hazırlanmasını, canlı/ölü boyama sırasında numune kaybının önlenmesini ve analiz edilen hacmin doğru bir şekilde hesaplanmasını içeriyordu. Bu ve diğer çalışmalar için, S. aureus<...

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, iki Doğu Washington Üniversitesi hibesi, A.R.C.'ye Fakülte Araştırma ve Yaratıcı Çalışmalar Hibesi ve L.T.B.'ye Lisans Araştırma ve Yaratıcı Faaliyetler Hibesi ile finanse edildi. Bill ve Connie Cross, dijital kameralı Leica DMIL ters floresan mikroskobu satın almak için EWU'ya fon bağışladı.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Mueller Hinton brothFisher BioreagentsB12322
Luria Bertani (LB) broth Fisher BioreagentsBP142602
BD Difco AgarFisher ScientificDF0812-07-1
sodium chlorideSigma S3014-500g
meropenemTargetMolT0224
tobramycinSelleck ChemicalsS2514
Staphylococcus aureus ATCCATCC29213
 Pseudomonas aeruginosaATCCATCC9721
shaking incubatorEppendorfM13520000
incubatorBenchmark ScientificH2200-H 
Manukaguard Manuka HoneyAmazonNA
DMIL inverted fluorescent microscope Leica Microsystems11521265
Digital cameraLeica Microsystems12730522
15 mL falcon tubesGenesee Scientific28-103
serological pipetsDiagnocineDP-LB0100005, DP-LB010010
Pipet Aid PipettorDrummond Scientific Company4-000-101
Bunsen burnerFisher ScientificS48108
Rainin pipetsPipette.comL-20, L-200, L-1000
balanceMettler ToledoXS603S
96-well plateFalcon351172
inoculating loopFisher Scientific13-104-5
isopropanolFisher ScientificBP2618-1
glass spreaderhomemadeNA
Live dead staining kit for bacteriaInvitrogenL7012
microfuge tubesBiologix Research CompanySKU 80-1500/P80-1500
tin foilCostcoNA
Figure making softwareGraphPadNAGraphPad Prism was used for making figures and conducting statistical analyses.

Referanslar

  1. Spoering, A., Lewis, K. Biofilms and planktonic cells of Pseudomonas aeruginosa have similar resistance to killing by antimicrobials. J Bacteriol. 183 (23), 6746-6751 (2001).
  2. Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis. J Bacteriol. 192 (23), 6191-6199 (2010).
  3. Li, L., Mendis, N., Trigui, H., Oliver, J. D., Faucher, S. P. The importance of the viable but non-culturable state in human bacterial pathogens. F Microbiol. 5, 00258 (2014).
  4. Reygaert, W. C. An overview of the antimicrobial resistance mechanisms of bacteria. AIMS Microbiol. 4 (3), 482-450 (2018).
  5. Ayrapetyan, M., Williams, T. C., Baxter, R., Oliver, J. D. Viable but nonculturable and persister cells coexist stochastically and are induced by human serum. Infect Immun. 83 (11), 4194-4203 (2015).
  6. Cabral, D. J., Wurster, J. I., Belenky, P. Antibiotic persistence as a metabolic adaptation: Stress, metabolism, the host, and new directions. PHARH2. 11 (1), 11010014 (2018).
  7. Heidelberg, J. F., et al. Effect of aerosolization on culturability and viability of gram-negative bacteria. Appl Environ Microbiol. 63 (9), 3585-3588 (1997).
  8. Cook, K. L., Bolster, C. H. Survival of Campylobacter jejuni and Escherichia coli in groundwater during prolonged starvation at low temperatures. J Appl Microbiol. 103 (3), 573-583 (2007).
  9. Xu, H. S., et al. Survival and viability of nonculturable Escherichia coli and Vibrio cholerae in the estuarine and marine environment. Microbl Ecol. 8 (4), 313-323 (1982).
  10. Qi, Z., Huang, Z., Liu, C. Metabolism differences of biofilm and planktonic Pseudomonas aeruginosa in viable but nonculturable state induced by chlorine stress. Sci Total Environ. 821, 153374 (2022).
  11. Li, Y., et al. Study on the Viable but Non-culturable (VBNC) state formation of staphylococcus aureus and its control in food system. F Microbiol. 11, 599739 (2020).
  12. Oryan, A., Alemzadeh, E., Moshiri, A. Biological properties and therapeutic activities of honey in wound healing: A narrative review and meta-analysis. J Tissue Viability. 25 (2), 98-118 (2016).
  13. Lusby, P. E., Coombes, A. L., Wilkinson, J. M. Bactericidal Activity of different honeys against pathogenic bacteria. Arch Med Res. 36 (5), 464-467 (2005).
  14. Mandal, M. D., Mandal, S. Honey: Its medicinal property and antibacterial activity. Asian Pac J Trop. Biomed. 1 (2), 154-160 (2011).
  15. Carter, D. A., et al. Therapeutic Manuka Honey: No longer so alternative. F Microbiol. 7, 00569 (2016).
  16. Cooper, R. A., Molan, P. C., Harding, K. G. The sensitivity to honey of Gram-positive cocci of clinical significance isolated from wounds. J Appl Microbiol. 93 (5), 857-863 (2002).
  17. George Narelle May, C., Keith, F. Antibacterial Honey: In-vitro activity against clinical isolates of MRSA, VRE, and other multiresistant Gram-negative organisms. HMP Global Learning Network. , (2007).
  18. Blair, S. E., Cokcetin, N. N., Harry, E. J., Carter, D. A. The unusual antibacterial activity of medical-grade Leptospermum honey: Antibacterial spectrum, resistance and transcriptome analysis. Eur Soc Clin Microbiol. 28 (10), 1199-1208 (2009).
  19. Cooper, R. A., Jenkins, L., Henriques, A. F. M., Duggan, R. S., Burton, N. F. Absence of bacterial resistance to medical-grade manuka honey. Eur Soc Clin Microbiol. 29 (10), 1237-1241 (2010).
  20. Lu, J., et al. Honey can inhibit and eliminate biofilms produced by Pseudomonas aeruginosa. Sci Rep. 9 (1), 18160 (2019).
  21. Bischofberger, A. M., Pfrunder Cardozo, K. R., Baumgartner, M., Hall, A. R. Evolution of honey resistance in experimental populations of bacteria depends on the type of honey and has no major side effects for antibiotic susceptibility. Evol Appl. 14 (5), 1314-1327 (2021).
  22. Cunningham, E., O'Byrne, C., Oliver, J. D. Effect of weak acids on Listeria monocytogenes survival: Evidence for a viable but nonculturable state in response to low pH. Food Control. 20 (12), 1141-1144 (2009).
  23. Kogure, K., Simidu, U., Taga, N. A tentative direct microscopic method for counting living marine bacteria. Can J Microbiol. 25 (3), 415-420 (1979).
  24. Albertini, M. C., et al. Use of multiparameter analysis for Vibrio alginolyticus viable but nonculturable state determination. Cytom J Int Soc Anal Cytol. 69 (4), 260-265 (2006).
  25. Nocker, A., Camper, A. K. Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. FEMS Microbiol Lett. 291 (2), 137-142 (2009).
  26. Trevors, J. T. Viable but non-culturable (VBNC) bacteria: Gene expression in planktonic and biofilm cells. J Microbiol Methods. 86 (2), 266-273 (2011).
  27. Ankley, L. M., Monteiro, M. P., Camp, K. M., O'Quinn, R., Castillo, A. R. Manuka honey chelates iron and impacts iron regulation in key bacterial pathogens. J App Microbiol. 128 (4), 1015-1024 (2020).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 218

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır