מיצוי וניקוי רקמות הכנת דגימות מוח-חוט שדרה של עכברים

Summary

מחקר זה מציג פרוטוקול לחילוץ והכנה של דגימות מוח וחוט שדרה שלם עם אותות פלואורסצנטיים משומרים, המשפר את יעילות הניסוי ושלמות הנתונים כדי לקדם את המחקר במדעי המוח.

Abstract

מחקר במדעי המוח המתמקד במערכת העצבים המרכזית מחייב הבנה מעמיקה של גורמים שונים, כולל התפלגות תאים, קישוריות עצבית ודינמיקה מולקולרית. מתודולוגיות מסורתיות לחקירת כל המוח וחוט השדרה כוללות לעתים קרובות בידוד, חתך וסריקת פרוסות רקמה, ולאחר מכן תהליך עתיר עבודה של שחזור תמונה תלת מימדית. גישה קונבנציונלית זו יכולה להיות גם גוזלת זמן וגם מסורבלת. התקדמות בטכניקות ניקוי רקמות והדמיה של איברים שלמים חוללו מהפכה בניתוח של כל המוח וחוט השדרה. כדי למקסם את הפוטנציאל של שיטות חדשניות אלה, חיוני לחלץ ולנקות דגימות מוח תוך שמירה על חיבורן לחוט השדרה. פרוטוקול זה מספק מדריך מפורט ושיטתי להכנת דגימות מוח המחוברות לחוט השדרה, המתאר את הליכי המיצוי והניקוי. על ידי ייעול תהליכים אלה, גישה זו משפרת משמעותית את יעילות הניסוי ואת שלמות הנתונים, ובכך מטפחת התקדמות במחקר מדעי המוח ומאפשרת חקירות מקיפות יותר של המורכבות של מערכת העצבים המרכזית.

Introduction

מיפוי וניתוח מדויקים של התפלגות העצבים מספקים תובנות חשובות לגבי הארגון המבני והתפקודי של מערכת העצבים המרכזית, סוללים את הדרך לאסטרטגיות טיפוליות חדשניות ומשפרים את ההבנה הכוללת שלנו של מנגנונים עצביים. נכון לעכשיו, חסרים מדריכי וידאו מקיפים שידריכו את החוקרים בהכנה וחילוץ דגימות מוח המחוברות לחוט השדרה והשגת ניקוי רקמות מוצלח.

ישנן מספר גישות לניקוי רקמות זמינות: שיטות הידרופוביות, הידרופיליות, מבוססות הידרוג'ל וניקוי הרחבת רקמות ^1,2,3. הטכניקה של ניקוי רקמות מיושמת באופן נרחב בחקר איברים כמו טחול⁴, ריאות⁵, שריר גסטרוקנמיוס⁶, מוח⁷, חוט שדרה⁸ וכליות⁹. הפרוטוקול שלנו יספק הוראות מפורטות כיצד להכין דגימות מוח שלמות המחוברות לחוט השדרה אשר סומנו בסמן פלואורסצנטי באמצעות עכברי זן STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J. הוא יציע הדרכה שלב אחר שלב למיצוי דגימה ויתאר את פרוטוקול הפינוי באמצעות ערכות הידרופיליות לניקוי רקמות. פרוטוקול זה מסייע לחוקרים לשלוט בכל התהליך החל מהפקת דגימות מוח-חוט השדרה ועד להכנה, וסריקה לאחר מכן. זה לא רק ישפר את יעילות הניסוי אלא גם יבטיח את שלמות ואיכות הדגימות, ויספק נתונים מדויקים ואמינים יותר לתמיכה במחקר במדעי המוח.

בהשוואה לשיטות חתך, הדמיה ושחזור תלת מימדי קונבנציונליות^10,11, הגישה המוצגת כאן מציעה מספר יתרונות מרכזיים, כגון (1) שלמות מבנית משופרת: על ידי שמירה על מבנה האיבר השלם, שיטה זו מפחיתה את הסיכון לאובדן מידע קריטי שיכול להתרחש עם חתך¹²; (2) איסוף נתונים מקיף: השימוש בערכת ניקוי רקמות מאפשר מיפוי מפורט של תאים שקשה להשיג בטכניקות מסורתיות; (3) יעילות ודיוק: הפרוטוקול מייעל את כל התהליך מהפקת הדגימה ועד להדמיה, מפחית את הזמן הנדרש על ידי הליכי אימונוהיסטוכימיה או צביעה וממזער שגיאות הקשורות לחיתוך והרכבה¹³.

הפרוטוקול מתגבר על המגבלות של שיטות חיתוך מסורתיות, שלעתים קרובות גורמות לנתונים לא שלמים ומקוטעים. על ידי שימור הקשר השלם בין המוח לחוט השדרה ושימוש בשיטות מודרניות לניקוי רקמות, פרוטוקול זה מספק מבט הוליסטי יותר על מערכת העצבים המרכזית, שהיא חיונית להבנת מנגנונים ותפקודים עצביים מורכבים. המטרה העיקרית של שיטה זו היא לאפשר הדמיה מקיפה של מערכת העצבים המרכזית על ידי הכנת דגימות מוח שלמות המחוברות לחוט השדרה, אשר סומנו בסמנים עצביים פלואורסצנטיים. פרוטוקול זה נועד להקל על הדמיה מפורטת של מבנים עצביים והתפלגות תאים באמצעות שיטות אנטומיות מתקדמות וטכניקות ניקוי רקמות.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות Animal Research Reporting In Vivo Experiments (ARRIVE) ולמדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. המחקר הנוכחי אושר על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים רנג'י, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת שנחאי ג'יאוטונג. כאן, עכברים זכרים בני 7-8 שבועות מזן STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J (מקור C57BL/6J x CBA) שימשו למחקר הנוכחי. בעלי החיים הושגו באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים) ושוכנו בכלובים סטנדרטיים (22 מעלות צלזיוס ±-2 מעלות צלזיוס, 12 שעות/12 שעות מחזור אור/חושך, מזון ומים אד ליביטום).

1. זלוף

1. הרדמה עמוקה של עכברים בוגרים באמצעות 1.25% טריברומו-אתנול (0.02 מ"ל/ק"ג, ראה טבלת חומרים) הניתנת בהזרקה תוך-צפקית באמצעות מזרק של 1 מ"ל. בדוק את עומק ההרדמה לפי תגובת צביטה בבוהן.
2. קבע את גפי העכבר ללוח האקרילי הלבן באמצעות מהדקי פלדה. חותכים את העור בין שתי עצם הירך של העכבר וממשיכים לחתוך כלפי מעלה עד שמגיעים לסרעפת. פתח את שני צידי בית החזה דרך הסרעפת כדי לחשוף את הלב באמצעות מספריים ומלקחיים ישרים.
3. הכנס מחט עירוי 0.7 מ"מ לחדר השמאלי. בצע חתך של 1-2 מ"מ בתוספת הפרוזדורים הימנית.
4. החדרה עם 1x PBS המכיל 10 U/mL נתרן הפרין בקצב של 10 מ"ל/דקה עם משאבה פריסטלטית (ראה טבלת חומרים) לניקוי מלא של הדם. הכבד מחוויר לחלוטין מעיד על פינוי מוצלח.
5. פרפיוז עם 50 מ"ל של 4% PFA מקורר מראש עם משאבה פריסטלטית בקצב של 10 מ"ל לדקה. יש לעקוב אחר סימנים כגון סלסול זנב עכבר ועוויתות שרירים.
   הערה: זלוף לא מוצלח יכול להשפיע על תהליכי הסליקה הבאים.

2. מיצוי מדגם

1. נתח בזהירות את כל המוח וחוט השדרה באמצעות מספריים ומלקחיים כדי למנוע נזק לדגימה.
2. הפרד את העור בגב ובראש העכבר באמצעות מספריים עיניים. חתכו את עמוד השדרה בנקודה שבה הקו המחבר את הקצוות האחוריים העליונים של שתי הגפיים מצטלב עם עמוד השדרה
3. הסר רקמת שריר ושומן מהצוואר והחלק האחורי של העכבר כדי לחשוף את עמוד השדרה והגולגולת. חותכים לאורך פער קו האמצע בין הצד השמאלי והימני של עמוד השדרה וחוט השדרה מהקצה התחתון של תעלת החוליות בעזרת מספריים ונוס.
4. הסר את החלק העליון והצדדים הדו-צדדיים של עמוד השדרה הקטוע כדי לחשוף את חוט השדרה. חזור על השלבים עד שתגיע לחיבור המוח.
5. הניחו את קצה הלהב האחד של המספריים של ונוס בין הנקב מגנום למוח. החלק וחתוך לאורך התפר האמצעי הסגיטלי כדי לפתוח את הגולגולת. השתמש במלקחיים כדי להסיר את הגולגולת ולחשוף את המוח.
6. הסר את רקמת המוח-חוט השדרה של העכבר מקצה הגולגולת באמצעות מלקחיים ומספריים ונוס.
   הערה: חתכים או נזק למשטח עלולים להחמיר במהלך הניקוי שלאחר מכן, מה שעלול לגרום לנזק בלתי צפוי לדוגמא. טפל בדוגמאות בזהירות.
7. השתמש במלקחיים מנתחים כדי להסיר את קרום חוט השדרה מתחת לסטריאומיקרוסקופ.
8. אבטח את דגימת המוח-חוט השדרה ללוחית הקיבוע (ראה טבלת חומרים) באמצעות תפרים. הוסף לפחות פי 20 מנפח הדגימה של 4% PFA והנח אותו על שייקר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לתסיסה איטית. יש לתקן למשך הלילה למשך 16-24 שעות.
   הערה: קיבוע יתר מוביל לקישור צולב מוגזם של חלבון, מה שמפחית את יעילות הפינוי¹⁴. קיבוע לא מספיק או מושהה עלול לגרום לפירוק אנטיגן ולהרס מורפולוגיה של רקמות.
9. השלך את ה-PFA ושטוף את הדגימה 3x עם 1x PBS. ודא שנפח ה-PBS הוא לפחות פי 10 מנפח הדגימה, וטובל את הדגימה במלואה. כל שטיפה נמשכת שעתיים עם תסיסה על שייקר במהירות של לא פחות מ-60 סל"ד כדי להסיר ביסודיות שאריות PFA.

3. ניקוי רקמות

הערה: כאן משתמשים בערכת ניקוי רקמות (ראה טבלת חומרים).

1. הכן את תמיסת הסרת השומנים על ידי ערבוב תמיסה A ותמיסה B ביחס מסה של 9:1.
   הערה: מומלץ שנפח התמיסה להסרת שומנים יהיה יותר מפי 20 מנפח הדגימה.
2. הנח את הרקמה הקבועה לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל והוסף 50 מ"ל מתמיסת הסרת השומנים. יש להניח את צינור הצנטריפוגה בשייקר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, לנער בעדינות ב-60 סל"ד להסרת שומנים. יש להחליף את התמיסה להסרת שומנים מדי יום למשך 3-5 ימים. כדי לקבוע השלמה, הנח את צינור הצנטריפוגה על קופסת אור עם קו קנה מידה. אם קו הסולם השחור נראה בבירור ולא מעוות דרך הדגימה, התהליך הושלם.
3. הנח את הדגימה ב-20 מ"ל של תמיסה C על שייקר ב-25 מעלות צלזיוס, תוך ניעור בפחות מ-60 סל"ד להתאמת מקדם שבירה. החלף את פתרון C לאחר 24 שעות. הניחו את צלחת התרבות עם הדגימה שקועה במלואה בתמיסה C על קופסה קלה עם קו קנה מידה. אם קו קנה המידה השחור נראה בבירור ואינו מעוות דרך הדגימה, תהליך ההתאמה הושלם.
   הערה: עבור רקמות עכבר בוגרות, התאמת מקדם השבירה מסתיימת בדרך כלל תוך יומיים.

4. הטמעת רקמות

1. הכינו תמיסת ג'ל עם 147 גרם תמיסה C בבקבוק זכוכית של 200 מ"ל, הוסיפו 3.0 גרם אגרוז, ערבבו היטב על ידי מערבולת, ואז מיקרוגל עד לרתיחה וכבו מיד את המיקרוגל. מעבירים את צינור הצנטריפוגה לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהאגרוז נמס.
   הערה: מומלץ להכין את תמיסת הג'ל טרייה לפי הצורך.
2. הטמיעו את הדגימה המנוקה בשכבה בעומק 2 מ"מ של תמיסת ג'ל 37 מעלות צלזיוס בתבנית ומצננים במקרר של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עד להתמצקות למחצה. הכניסו את הדגימה המותאמת למקדם השבירה לתוך התבנית והוסיפו תמיסת ג'ל כך שתהיה ברמה או מעט מתחת לחלק העליון של הדגימה.
3. מחזירים את התבנית למקרר של 4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. הוסף תמיסת ג'ל עד ליישור עם משטח התבנית. מכסים בכיסוי. האיצו את ההתמצקות במקרר של 4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. אחסן את הדגימה המוטמעת למשך הלילה במקרר 4 מעלות צלזיוס. המשך בהדמיה בהקדם האפשרי.

5. סריקה

1. הסר את הכיסוי בעזרת פינצטה והוציא את הדגימה המוטמעת. הנח את הדגימה בצינור של 50 מ"ל והוסף 30 מ"ל של תמיסת הדמיה כדי להטביע את הדגימה במלואה.
2. מרחו דבק 502 כדי להדביק היטב את הדגימה על מחזיק הדגימה. קבע את המחזיק על התקן ההדמיה.
3. הפעל את תוכנת הסריקה כמתואר. בחר את רמת ההגדלה של 4x במקטע ההגדלה. לחץ על כפתור הכיול כדי להפעיל את מצב הכיול.
4. לחצו על הלחצן 'תצוגה מקדימה ' כדי להיכנס למצב תצוגה מקדימה. לחץ על כפתור התנועה בכיוון Z כדי להזיז לאט את הדגימה כלפי מעלה מתחתית תא הדגימה עד שיריעת האור שנוצרה תעבור דרך הדגימה.
5. בחר את ערוץ הלייזר ואפשרות מצב התאורה המתאימים. בחר את כיוון נתיב הסריקה עבור הדגימה. לחץ על כפתור הסריקה האוטומטית כדי להתחיל ללכוד את הדגימה.

תוצאות

פרוטוקול זה מבודד בהצלחה את כל המוח המחובר לחוט השדרה בעכברים זכרים מזן STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J. זה גם הופך את הדגימות לשקופות, ומבטיח שהאותות הפלואורסצנטיים נשמרים ונלכדים במלואם, ומספקים תמונות ברורות ומפורטות השומרות על שלמות הקרינה המקורית.

Discussion

פרוטוקול הניסוי המוצע כולל שימוש בעכברים שמוחם מחובר לחוט השדרה המסומן בנגיפי מעקב עצביים פלואורסצנטיים. פרוטוקול זה מספק הוראות מקיפות ומפורטות להכנת דגימות מוח שלמות שנשארות מחוברות לחוט השדרה. הפרוטוקול מתאר בקפידה כל שלב, ומבטיח שהחוקרים יוכלו לשכפל את התהליך בדי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml syringe	Shandong Weigao Group Medical Polymer
502 glue	Deli Group
BD insulin syringe	Becton,Dickinson and Company	328421
Bend toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1050
Circular steel clamp	Weili
Fine scissors	Jinzhong	y00030
Hemostatic forceps bent with tooth	Jinzhong	J31020
Hemostatic forceps straight with tooth	Jinzhong	J31010
Infusion needle 0.7mm	Kindly Group
Light box scale line	Nuohai Life Science	NH210901
Microdissection straight forceps	Jinzhong	WA3020
NobeliumSoftware	Nuohai Life Science		Scanning software
paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
Peristaltic pumps	Nuohai Life Science	NH1000
Peristaltic pumps head	Nuohai Life Science	NH-15
Phosphate buffered saline	Servicebio	G4202
Sodium heparin	Shanghai Pharma	H31022051
STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J strain mice	Jackson Laboratory	007788
Straight toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1060
Tissue clearing Kit(hyrophilic)	Nuohai Life Science	NH-CR-210701
Tissue culture treater 100mm x 20mm	NEST	704001
Tissue scissors	Jinzhong	J21040
Tribromoethanol	Aibei Biotechnology	M2910
Venus scissors	Jinzhong	YBC010