Estrazione e pulizia dei tessuti Preparazione di campioni di cervello e midollo spinale di topo

Riepilogo

Questo studio presenta un protocollo per l'estrazione e la preparazione di campioni chiari di intero cervello e midollo spinale con segnali fluorescenti conservati, migliorando l'efficienza sperimentale e l'integrità dei dati per far progredire la ricerca neuroscientifica.

Abstract

La ricerca neuroscientifica incentrata sul sistema nervoso centrale richiede una comprensione approfondita di vari fattori, tra cui la distribuzione cellulare, la connettività neuronale e la dinamica molecolare. Le metodologie tradizionali per studiare l'intero cervello e il midollo spinale spesso comportano l'isolamento, il sezionamento e la scansione di fette di tessuto, seguite dal laborioso processo di ricostruzione tridimensionale dell'immagine. Questo approccio convenzionale può richiedere molto tempo e essere ingombrante. I progressi nella pulizia dei tessuti e nelle tecniche di imaging dell'intero organo hanno rivoluzionato l'analisi dell'intero cervello e del midollo spinale. Per massimizzare il potenziale di questi metodi innovativi, è essenziale estrarre e cancellare campioni di cervello mantenendo la loro connessione con il midollo spinale. Questo protocollo fornisce una guida dettagliata e sistematica per la preparazione di campioni del cervello collegati al midollo spinale, delineando le procedure di estrazione e pulizia. Semplificando questi processi, questo approccio migliora significativamente l'efficienza sperimentale e l'integrità dei dati, favorendo così i progressi nella ricerca neuroscientifica e consentendo indagini più complete sulle complessità del sistema nervoso centrale.

Introduzione

La mappatura e l'analisi accurate della distribuzione nervosa forniscono preziose informazioni sull'organizzazione strutturale e funzionale del sistema nervoso centrale, aprendo la strada a strategie terapeutiche innovative e migliorando la nostra comprensione generale dei meccanismi neurali. Attualmente, mancano video tutorial completi per guidare i ricercatori nella preparazione e nell'estrazione di campioni cerebrali collegati al midollo spinale e nel raggiungimento di una pulizia dei tessuti di successo.

Sono disponibili diversi approcci di pulizia dei tessuti: idrofobici, idrofili, a base di idrogel e metodi di pulizia dell'espansione dei tessuti ^1,2,3. La tecnica di pulizia dei tessuti è ampiamente applicata nello studio di organi come la milza⁴, i polmoni⁵, il muscolo gastrocnemio⁶, il cervello⁷, il midollo spinale⁸ e i reni⁹. Il nostro protocollo fornirà istruzioni dettagliate su come preparare campioni di cervello intero collegati al midollo spinale che sono stati marcati con un marcatore fluorescente utilizzando topi STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J cep. Offrirà una guida passo passo per l'estrazione del campione e descriverà il protocollo di pulizia utilizzando kit idrofili per la pulizia dei tessuti. Questo protocollo aiuta i ricercatori a padroneggiare l'intero processo, dall'estrazione del campione di midollo spinale alla preparazione e alla successiva scansione. Ciò non solo migliorerà l'efficienza sperimentale, ma garantirà anche l'integrità e la qualità dei campioni, fornendo dati più accurati e affidabili a supporto della ricerca neuroscientifica.

Rispetto ai metodi convenzionali di sezionamento, imaging e ricostruzione tridimensionale^10,11, l'approccio qui presentato offre diversi vantaggi chiave, come (1) una maggiore integrità strutturale: mantenendo la struttura dell'intero organo, questo metodo riduce il rischio di perdita di informazioni critiche che possono verificarsi con il sezionamento¹²; (2) acquisizione completa dei dati: l'uso di un kit di pulizia dei tessuti consente una mappatura dettagliata delle cellule che sono difficili da ottenere con le tecniche tradizionali; (3) Efficienza e accuratezza: il protocollo semplifica l'intero processo, dall'estrazione del campione all'imaging, riducendo il tempo richiesto dalle procedure di immunoistochimica o colorazione e minimizzando gli errori associati al sezionamento e al montaggio¹³.

Il protocollo supera i limiti dei metodi di sezionamento tradizionali, che spesso si traducono in dati incompleti e frammentati. Preservando la connessione cervello-midollo spinale intatta e utilizzando moderni metodi di pulizia dei tessuti, questo protocollo fornisce una visione più olistica del sistema nervoso centrale, che è fondamentale per comprendere i complessi meccanismi e funzioni neurali. L'obiettivo principale di questo metodo è quello di consentire l'imaging completo del sistema nervoso centrale preparando campioni di cervello intero collegati al midollo spinale, che sono stati marcati con marcatori neuronali fluorescenti. Questo protocollo mira a facilitare la visualizzazione dettagliata delle strutture neurali e delle distribuzioni cellulari utilizzando metodi anatomici avanzati e tecniche di pulizia dei tessuti.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida ARRIVE (Animal Research Reporting In Vivo Experiments) e la Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Il presente studio è stato approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'ospedale Renji, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Qui, per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi del ceppo MJrs/J STOCK Tg (Thy1-EGFP) di 7-8 settimane (origine C57BL/6J x CBA). Gli animali sono stati ottenuti commercialmente (vedi Tabella dei materiali) e alloggiati in gabbie standard (22 °C ± 2 °C, 12 h/12 h ciclo luce/buio, cibo e acqua ad libitum).

1. Perfusione

1. Anestetizzare profondamente i topi adulti utilizzando tribromoetanolo all'1,25% (0,02 ml/kg, vedere la tabella dei materiali) somministrato mediante iniezione intraperitoneale utilizzando una siringa da 1 ml. Controllare la profondità dell'anestesia in base alla risposta al pizzicamento delle dita dei piedi.
2. Fissa gli arti del mouse alla tavola acrilica bianca usando i morsetti in acciaio. Tagliare la pelle tra i due femori del topo e continuare a tagliare verso l'alto fino a raggiungere il diaframma. Apri entrambi i lati del torace attraverso il diaframma per esporre il cuore usando forbici e pinze dritte.
3. Inserire un ago per infusione da 0,7 mm nel ventricolo sinistro. Praticare un'incisione di 1-2 mm nell'appendice atriale destra.
4. Perfondere con 1x PBS contenente 10 U/mL di eparina sodica a una velocità di 10 mL/min con una pompa peristaltica (vedere la Tabella dei materiali) per eliminare completamente il sangue. Il fegato che diventa completamente pallido indica una clearance riuscita.
5. Perfondere con 50 mL di PFA al 4% pre-raffreddato con una pompa peristaltica a una velocità di 10 mL/min. Monitora la presenza di segni come l'arricciamento della coda del topo e le contrazioni muscolari.
   NOTA: La perfusione non riuscita può influire sui successivi processi di compensazione.

2. Estrazione del campione

1. Sezionare con cura l'intero cervello e il midollo spinale utilizzando forbici e pinze per evitare di danneggiare il campione.
2. Separare la pelle sul dorso e sulla testa del topo usando le forbici oftalmiche. Recidere la colonna vertebrale nel punto in cui la linea che collega i bordi posteriori superiori di entrambi gli arti si interseca con la colonna vertebrale.
3. Rimuovere il tessuto muscolare e adiposo dal collo e dalla parte posteriore del topo per esporre la colonna vertebrale e il cranio. Taglia lungo lo spazio della linea mediana tra i lati sinistro e destro della colonna vertebrale e del midollo spinale dall'estremità inferiore del canale vertebrale usando le forbici per la venere.
4. Rimuovere la parte superiore e i lati bilaterali della colonna vertebrale recisa per esporre il midollo spinale. Ripeti i passaggi fino a raggiungere la connessione cerebrale.
5. Posiziona la punta di una lama delle forbici di Venere tra il forame magno e il cervello. Far scorrere e tagliare lungo la sutura medio-sagittale per aprire il cranio. Usa il forcipe per rimuovere il cranio ed esporre il cervello.
6. Rimuovere il tessuto cervello-midollo spinale del topo dall'estremità cranica usando una pinza e le forbici per la venere.
   NOTA: I tagli o i danni alla superficie possono essere esacerbati durante la successiva pulizia, causando potenzialmente danni imprevedibili al campione. Maneggiare i campioni con cura.
7. Utilizzare una pinza da dissezione per rimuovere la membrana del midollo spinale sotto lo stereomicroscopio.
8. Fissare il campione di midollo encefalico e spinale alla piastra di fissaggio (vedi Tabella dei materiali) utilizzando punti di sutura. Aggiungere almeno 20 volte il volume del campione di PFA al 4% e posizionarlo su un agitatore a 4 °C per un'agitazione lenta. Fissare durante la notte per 16-24 ore.
   NOTA: L'eccessiva fissazione porta a un'eccessiva reticolazione delle proteine, riducendo l'efficienza di eliminazione¹⁴. Una fissazione insufficiente o ritardata può causare la degradazione dell'antigene e la distruzione della morfologia dei tessuti.
9. Scartare il PFA e lavare il campione 3 volte con 1 PBS. Assicurarsi che il volume di PBS sia almeno 10 volte il volume del campione, immergendo completamente il campione. Ogni lavaggio dura 2 ore con agitazione su agitatore ad una velocità non inferiore a 60 giri/min per rimuovere a fondo il PFA residuo.

3. Pulizia dei tessuti

NOTA: In questo caso viene utilizzato un kit per la pulizia dei tessuti (vedere la tabella dei materiali).

1. Preparare la soluzione per la rimozione dei lipidi mescolando la soluzione A e la soluzione B con un rapporto di massa di 9:1.
   NOTA: Si raccomanda che il volume della soluzione per la rimozione dei lipidi sia superiore a 20 volte il volume del campione.
2. Posizionare il tessuto fissato in una provetta da centrifuga da 50 mL e aggiungere 50 mL della soluzione per la rimozione dei lipidi. Porre la provetta da centrifuga in un agitatore a 37 °C, agitando delicatamente a 60 giri/min per la rimozione dei lipidi. Cambiare la soluzione per la rimozione dei lipidi ogni giorno per 3-5 giorni. Per determinare il completamento, posizionare la provetta da centrifuga su una scatola luminosa con una linea di scala. Se la linea della scala nera è chiaramente visibile e non distorta attraverso il campione, il processo è completo.
3. Immergere il campione in 20 mL di soluzione C su un agitatore a 25 °C, agitando a meno di 60 giri/min per la corrispondenza dell'indice di rifrazione. Cambiare la soluzione C dopo 24 ore. Posizionare il piatto di coltura con il campione completamente immerso nella soluzione C su una scatola luminosa con una linea di scala. Se la linea della scala nera è chiaramente visibile e non distorta attraverso il campione, il processo di corrispondenza è completo.
   NOTA: Per i tessuti di topo adulto, la corrispondenza dell'indice di rifrazione viene in genere completata entro 2 giorni.

4. Inclusione tissutale

1. Preparare la soluzione in Gel con 147 g di Soluzione C in un flacone di vetro da 200 ml, aggiungere 3,0 g di agarosio, mescolare bene a spirale, quindi microonde fino a ebollizione e spegnere immediatamente il microonde. Trasferire la provetta da centrifuga in un'incubatrice a 37 °C fino a quando l'agarosio non si scioglie.
   NOTA: Si consiglia di preparare la soluzione in gel fresca secondo necessità.
2. Incorporare il campione chiarificato con uno strato profondo 2 mm di soluzione gel a 37 °C nello stampo e raffreddare in frigorifero a 4 °C per 30 minuti fino a semi-solidificazione. Posizionare il campione con indice di rifrazione corrispondente nello stampo e aggiungere la soluzione di gel in modo che sia livellato o leggermente al di sotto della parte superiore del campione.
3. Rimettere lo stampo in frigorifero a 4 °C per 2 ore. Aggiungere la soluzione di gel fino a raggiungere il livello della superficie dello stampo. Coprire con un vetrino coprioggetti. Accelerare la solidificazione in frigorifero a 4 °C per 2 ore. Conservare il campione incorporato per una notte in frigorifero a 4 °C. Procedere con l'imaging il prima possibile.

5. Scansione

1. Rimuovere il vetrino coprioggetti con una pinzetta ed estrarre il campione incorporato. Posizionare il campione in una provetta da 50 ml e aggiungere 30 ml di soluzione di imaging per immergere completamente il campione.
2. Applicare l'adesivo 502 per fissare saldamente il campione sul supporto del campione. Fissare il supporto al dispositivo di imaging.
3. Eseguire il software di scansione come descritto. Selezionare il livello di ingrandimento di 4x nella sezione di ingrandimento. Fare clic sul pulsante Calibrazione per attivare la modalità di calibrazione.
4. Fare clic sul pulsante Anteprima per accedere alla modalità di anteprima. Fare clic sul pulsante di movimento della direzione Z per spostare lentamente il campione verso l'alto dal fondo della camera del campione fino a quando il foglio luminoso generato non passa attraverso il campione.
5. Selezionare il canale laser appropriato e l'opzione della modalità di illuminazione. Selezionare la direzione del percorso di scansione per il campione. Fare clic sul pulsante Scansione automatica per avviare l'acquisizione del campione.

Risultati

Questo protocollo isola con successo l'intero cervello collegato al midollo spinale in topi maschi STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J cep. Inoltre, rende trasparenti i campioni, assicurando che i segnali fluorescenti siano completamente preservati e acquisiti, fornendo immagini chiare e dettagliate che mantengono l'integrità della fluorescenza originale.

La Figura 1 mostr...

Discussione

Il protocollo sperimentale proposto prevede l'utilizzo di topi il cui cervello è collegato al midollo spinale marcato con virus di tracciamento neurale fluorescenti. Questo protocollo fornisce istruzioni complete e dettagliate sulla preparazione di campioni di cervello intero che rimangono collegati al midollo spinale. Il protocollo delinea meticolosamente ogni fase, assicurando che i ricercatori possano replicare il processo con precisione.

Diversi passaggi ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml syringe	Shandong Weigao Group Medical Polymer
502 glue	Deli Group
BD insulin syringe	Becton,Dickinson and Company	328421
Bend toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1050
Circular steel clamp	Weili
Fine scissors	Jinzhong	y00030
Hemostatic forceps bent with tooth	Jinzhong	J31020
Hemostatic forceps straight with tooth	Jinzhong	J31010
Infusion needle 0.7mm	Kindly Group
Light box scale line	Nuohai Life Science	NH210901
Microdissection straight forceps	Jinzhong	WA3020
NobeliumSoftware	Nuohai Life Science	Scanning software
paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
Peristaltic pumps	Nuohai Life Science	NH1000
Peristaltic pumps head	Nuohai Life Science	NH-15
Phosphate buffered saline	Servicebio	G4202
Sodium heparin	Shanghai Pharma	H31022051
STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J strain mice	Jackson Laboratory	007788
Straight toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1060
Tissue clearing Kit(hyrophilic)	Nuohai Life Science	NH-CR-210701
Tissue culture treater 100mm x 20mm	NEST	704001
Tissue scissors	Jinzhong	J21040
Tribromoethanol	Aibei Biotechnology	M2910
Venus scissors	Jinzhong	YBC010