АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом исследовании представлен протокол извлечения и подготовки очищенных образцов всего головного и спинного мозга с сохраненными флуоресцентными сигналами, повышающий эффективность эксперимента и целостность данных для продвижения исследований в области нейробиологии.

Аннотация

Исследования в области нейробиологии, сосредоточенные на центральной нервной системе, требуют глубокого понимания различных факторов, включая распределение клеток, нейронные связи и молекулярную динамику. Традиционные методологии исследования всего головного и спинного мозга часто включают в себя изоляцию, разрезание и сканирование срезов тканей с последующим трудоемким процессом реконструкции трехмерного изображения. Такой традиционный подход может быть как трудоемким, так и громоздким. Достижения в области очистки тканей и методов визуализации всего органа произвели революцию в анализе всего головного и спинного мозга. Чтобы максимально использовать потенциал этих инновационных методов, важно извлекать и очищать образцы мозга, сохраняя при этом их связь со спинным мозгом. Этот протокол представляет собой подробное и систематическое руководство по подготовке образцов головного мозга, подключенных к спинному мозгу, с изложением процедур извлечения и очищения. Оптимизируя эти процессы, этот подход значительно повышает эффективность экспериментов и целостность данных, тем самым способствуя прогрессу в исследованиях в области нейробиологии и позволяя проводить более всесторонние исследования сложностей центральной нервной системы.

Введение

Точное картирование и анализ распределения нервов дают ценную информацию о структурной и функциональной организации центральной нервной системы, прокладывая путь к инновационным терапевтическим стратегиям и улучшая наше общее понимание нейронных механизмов. В настоящее время отсутствуют исчерпывающие видеоуроки, которые могли бы помочь исследователям в подготовке и извлечении образцов мозга, подключенных к спинному мозгу, и достижении успешного очищения тканей.

Существует несколько подходов к очищению тканей: гидрофобный, гидрофильный, на основе гидрогеля и метод очищения от расширения тканей 1,2,3. Техника очищения тканей широко применяется при исследовании таких органов, как селезенка4,легкие 5, икроножная мышца6, головной мозг7, спинной мозг8 и почки9. Наш протокол предоставит подробные инструкции по подготовке образцов всего мозга, подключенных к спинному мозгу, которые были помечены флуоресцентным маркером с помощью мышей штамма MJrs/J STOCK Tg (Thy1-EGFP). В нем будет предложено пошаговое руководство по извлечению образцов и описан протокол очищения с использованием гидрофильных наборов для очищения тканей. Этот протокол помогает исследователям освоить весь процесс от извлечения образцов из головного и спинного мозга до подготовки и последующего сканирования. Это не только повысит эффективность эксперимента, но и обеспечит целостность и качество образцов, предоставляя более точные и надежные данные для поддержки исследований в области нейробиологии.

По сравнению с традиционными методами разрезания, визуализации и трехмерной реконструкции10,11, представленный здесь подход имеет несколько ключевых преимуществ, таких как (1) улучшенная структурная целостность: сохраняя структуру всего органа, этот метод снижает риск потери критически важной информации, которая может произойти при разрезании12; (2) комплексный сбор данных: использование набора для очистки тканей позволяет проводить детальное картирование клеток, что трудно достичь с помощью традиционных методов; (3) Эффективность и точность: Протокол оптимизирует весь процесс от извлечения образца до визуализации, сокращая время, необходимое для иммуногистохимии или процедур окрашивания, и сводя к минимуму ошибки, связанные с секционированиеми монтажом.

Протокол преодолевает ограничения традиционных методов секционирования, которые часто приводят к неполным и фрагментированным данным. Сохраняя неповрежденную связь между головным и спинным мозгом и используя современные методы очистки тканей, этот протокол обеспечивает более целостное представление о центральной нервной системе, что имеет решающее значение для понимания сложных нейронных механизмов и функций. Основная цель этого метода заключается в том, чтобы обеспечить всестороннюю визуализацию центральной нервной системы путем подготовки образцов всего мозга, подключенных к спинному мозгу, которые были помечены флуоресцентными нейронными маркерами. Этот протокол направлен на облегчение детальной визуализации нейронных структур и распределения клеток с использованием передовых анатомических методов и техник очистки тканей.

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами Animal Research Reporting In Vivo Experiments (ARRIVE) и Руководством Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Настоящее исследование было одобрено Комитетом по уходу за животными и их использованию больницы Жэньцзи Медицинской школы Шанхайского университета Цзяотун. В данном исследовании были использованы самцы мышей типа STOCK Tg (Thy1-EGFP) в возрасте 7-8 недель (C57BL/6J x CBA происхождения). Животные были коммерчески получены (см. Таблицу материалов) и содержались в стандартных клетках (22 °C ± 2 °C, 12 ч/12 ч светлый/темный цикл, пища и вода ad libitum).

1. Перфузия

  1. Глубокую анестезию взрослых мышей проводят с использованием 1,25% трибромэтанола (0,02 мл/кг, см. Таблицу материалов) путем внутрибрюшинного введения с помощью шприца объемом 1 мл. Проверьте глубину анестезии по реакции на щипцы ноги.
  2. Закрепите конечности мыши на белой акриловой доске с помощью стальных зажимов. Разрежьте кожу между двумя бедренными кострами мыши и продолжайте резать вверх, пока не дойдете до диафрагмы. Откройте обе стороны грудной клетки через диафрагму, чтобы обнажить сердце с помощью ножниц и прямых щипцов.
  3. Введите инфузионную иглу диаметром 0,7 мм в левый желудочек. Сделайте разрез 1-2 мм в придатке правого предсердия.
  4. Проведите перфузию 1x PBS, содержащей 10 Ед/мл гепарина натрия со скоростью 10 мл/мин, с перистальтическим насосом (см. Таблицу материалов) для полного очищения крови. Полностью бледнеющая печень свидетельствует об успешном выведении.
  5. Перфузируйте 50 мл предварительно охлажденного 4% PFA с перистальтическим насосом со скоростью 10 мл/мин. Следите за такими признаками, как скручивание мышиного хвоста и подергивание мышц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Неудачная перфузия может повлиять на последующие процессы очистки.

2. Отбор проб

  1. Тщательно рассеките весь головной и спинной мозг с помощью ножниц и щипцов, чтобы не повредить образец.
  2. Отделите кожу на тыльной стороне и голове мыши с помощью офтальмологических ножниц. Разрежьте позвоночник в точке, где линия, соединяющая верхние задние края обеих конечностей, пересекается с позвоночным столбом.
  3. Удалите мышечную и жировую ткань с шеи и спины мыши, чтобы обнажить позвоночник и череп. Разрежьте по средней линии промежуток между левой и правой сторонами позвоночника и спинного мозга от нижнего конца позвоночного канала с помощью венерических ножниц.
  4. Удалите верхнюю часть и двусторонние стороны отрезанного позвоночника, чтобы обнажить спинной мозг. Повторяйте шаги до тех пор, пока не дойдете до соединения с мозгом.
  5. Поместите кончик одного лезвия венеринских ножниц между большим затылочным отверстием и мозгом. Сдвиньте и разрежьте вдоль среднего сагиттального шва, чтобы открыть череп. Используйте щипцы для удаления черепа и обнажения мозга.
  6. Удалите ткань головного и спинного мозга мыши с краниального конца с помощью щипцов и венеринских ножниц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Порезы или повреждения поверхности могут усугубиться во время последующей очистки, что может привести к непредсказуемому повреждению образца. Обращайтесь с образцами бережно.
  7. С помощью рассекающих щипцов удаляют оболочку спинного мозга под стереомикроскопом.
  8. Закрепите образец головного и спинного мозга на фиксирующей пластине (см. Таблицу материалов) с помощью швов. Добавьте не менее чем в 20 раз больше объема образца 4% PFA и поместите его в шейкер при температуре 4 °C для медленного перемешивания. Фиксация на ночь на 16-24 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерная фиксация приводит к чрезмерному сшиванию белков, снижая эффективность очистки14. Недостаточная или несвоевременная фиксация может привести к деградации антигена и разрушению морфологии тканей.
  9. Выбросьте PFA и промойте образец 3x с 1x PBS. Убедитесь, что объем PBS как минимум в 10 раз превышает объем пробы, полностью погрузив ее в воду. Каждая стирка длится 2 ч при перемешивании на вибростенде со скоростью не менее 60 об/мин для тщательного удаления остатков PFA.

3. Очищение тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используется набор для очистки тканей (см. Таблицу материалов).

  1. Приготовьте раствор для удаления липидов, смешав раствор А и раствор В в массовом соотношении 9:1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы объем раствора для удаления липидов был более чем в 20 раз больше объема образца.
  2. Поместите неподвижную ткань в центрифужную пробирку объемом 50 мл и добавьте 50 мл раствора для удаления липидов. Поместите пробирку центрифуги в шейкер при температуре 37 °C, осторожно встряхивая при 60 об/мин для удаления липидов. Меняйте раствор для удаления липидов ежедневно в течение 3-5 дней. Чтобы определить завершенность, поместите пробирку центрифуги на световой короб с линией накипи. Если черная линия шкалы четко видна и не искажается по всему образцу, процесс завершен.
  3. Поместите образец в 20 мл раствора C на шейкер при температуре 25 °C, встряхивая со скоростью менее 60 об/мин для согласования показателя преломления. Смените раствор C через 24 ч. Поместите чашку для культуры с образцом, полностью погруженным в раствор С, на световой короб с линией весов. Если черная линия шкалы четко видна и не искажена по всему образцу, процесс сопоставления завершен.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для тканей взрослых мышей согласование показателя преломления обычно завершается в течение 2 дней.

4. Встраивание тканей

  1. Приготовьте Гелевый раствор со 147 г Раствора С в стеклянной бутылке объемом 200 мл, добавьте 3,0 г агарозы, хорошо перемешайте вортексом, затем разогрейте в микроволновой печи до закипания и сразу выключите микроволновую печь. Перенесите пробирку центрифуги в инкубатор при температуре 37 °C до тех пор, пока агароза не растворится.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется готовить раствор геля в свежем виде по мере необходимости.
  2. Засыпьте очищенный образец слоем гелевого раствора 37 °C глубиной 2 мм в форму и охладите в холодильнике при температуре 4 °C в течение 30 минут до полузастывания. Поместите образец с соответствующим показателем преломления в форму и добавьте раствор геля, который должен быть на уровне или немного ниже верхней части образца.
  3. Поместите форму обратно в холодильник при температуре 4 °C на 2 часа. Добавьте раствор геля до уровня поверхности формы. Накройте крышкой. Ускорить затвердевание в холодильнике при температуре 4 °C в течение 2 ч. Храните введенный образец в течение ночи в холодильнике при температуре 4 °C. Приступайте к визуализации как можно скорее.

5. Сканирование

  1. Снимите покровное стекло пинцетом и выньте внедренный образец. Поместите образец в пробирку объемом 50 мл и добавьте 30 мл раствора для визуализации, чтобы полностью погрузить образец.
  2. Нанесите клей 502, чтобы надежно закрепить образец на держателе образца. Закрепите держатель на устройстве формирования изображения.
  3. Запустите программное обеспечение для сканирования, как описано. Выберите уровень увеличения 4x в разделе увеличения. Нажмите кнопку «Калибровка», чтобы активировать режим калибровки.
  4. Нажмите кнопку « Предварительный просмотр», чтобы перейти в режим предварительного просмотра. Нажмите кнопку движения по оси Z, чтобы медленно перемещать образец вверх от нижней части камеры для образца, пока сгенерированный световой слой не пройдет через образец.
  5. Выберите подходящий лазерный канал и вариант режима подсветки. Выберите направление траектории сканирования для образца. Нажмите кнопку «Автосканирование », чтобы начать захват образца.

Результаты

Этот протокол успешно изолирует весь мозг, связанный со спинным мозгом, у мышей-самцов штамма STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J. Он также делает образцы прозрачными, гарантируя, что флуоресцентные сигналы полностью сохраняются и захватываются, обеспечивая четкие и де?...

Обсуждение

Предлагаемый экспериментальный протокол включает в себя использование мышей, чей мозг связан со спинным мозгом, помеченным флуоресцентными вирусами нейронного отслеживания. Этот протокол содержит исчерпывающие и подробные инструкции по подготовке образцов всего ?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Национальный фонд естественных наук Китая (гранты No 82101249 и No 82471204 XY Sun). Фонд постдокторских исследований Китая (грант No 2022M722125 XY Sun).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1 ml syringeShandong Weigao Group Medical Polymer
502 glueDeli Group
BD insulin syringeBecton,Dickinson and Company328421
Bend toothed dissecting forcepsJinzhongJD1050
Circular steel clampWeili
Fine scissorsJinzhongy00030
Hemostatic forceps bent with toothJinzhongJ31020
Hemostatic forceps straight with toothJinzhongJ31010
Infusion needle 0.7mmKindly Group
Light box scale lineNuohai Life ScienceNH210901
Microdissection straight forcepsJinzhongWA3020
NobeliumSoftwareNuohai Life ScienceScanning software
paraformaldehydeBiosharpBL539A
Peristaltic pumpsNuohai Life ScienceNH1000
Peristaltic pumps headNuohai Life ScienceNH-15
Phosphate buffered salineServicebioG4202
Sodium heparinShanghai PharmaH31022051
STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J strain miceJackson Laboratory007788
Straight toothed dissecting forcepsJinzhongJD1060
Tissue clearing Kit(hyrophilic)Nuohai Life ScienceNH-CR-210701
Tissue culture treater 100mm x 20mmNEST704001
Tissue scissorsJinzhongJ21040
TribromoethanolAibei BiotechnologyM2910
Venus scissorsJinzhongYBC010

Ссылки

  1. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 21 (2), 61-79 (2020).
  2. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).
  3. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chem Biol. 23 (1), 137-157 (2016).
  4. Wu, M., et al. Innervation of nociceptor neurons in the spleen promotes germinal center responses and humoral immunity. Cell. 187 (12), 2935-2951.e19 (2024).
  5. Liu, T., et al. Local sympathetic innervations modulate the lung innate immune responses. Sci Adv. 6 (20), eaay1497 (2020).
  6. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Sci Adv. 5 (1), eaau8355 (2019).
  7. Bagnoli, S., Terzibasi Tozzini, E., Cellerino, A. Whole-Brain clearing and immunofluorescence in Nothobranchius furzeri. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (9), 698-704 (2023).
  8. Lu, T., Shinozaki, M., Nagoshi, N., Nakamura, M., Okano, H. 3D imaging of supraspinal inputs to the thoracic and lumbar spinal cord mapped by retrograde tracing and light-sheet microscopy. J Neurochem. 162 (4), 352-370 (2022).
  9. Saritas, T., Puelles, V. G., Su, X. T., Ellison, D. H., Kramann, R. Optical clearing and imaging of immunolabeled kidney tissue. J Vis Exp. (149), e60002 (2019).
  10. Song, J. H., et al. Precise mapping of single neurons by calibrated 3D reconstruction of brain slices reveals topographic projection in mouse visual cortex. Cell Rep. 31 (8), 107682 (2020).
  11. Fournel, R., Veruki, M. L., Hartveit, E. Digital reconstruction and quantitative morphometric analysis of bipolar cells in live rat retinal slices. J Comp Neurol. 530 (10), 1700-1728 (2022).
  12. Lin, R., et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nat Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).
  13. Peng, Y. C., et al. Rapid histological assessment of prostate specimens in the three-dimensional space by hydrophilic tissue clearing and confocal microscopy. J Histochem Cytochem. 70 (8), 597-608 (2022).
  14. Singhal, P., et al. Evaluation of histomorphometric changes in tissue architecture in relation to alteration in fixation protocol - An in vitro study. J Clin Diagn Res. 10 (8), ZC28-ZC32 (2016).
  15. Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Rep. 24 (8), 2196-2210.e9 (2018).
  16. Lee, S. H., Son, H. J. Second wave, late-stage neuroinflammation in cleared brains of aged 5xFAD Alzheimer's mice detected by macrolaser light sheet microscopy imaging. Int J Mol Sci. 24 (23), 242317058 (2023).
  17. Zhao, J., Lai, H. M., Qi, Y., He, D., Sun, H. Current status of tissue clearing and the path forward in neuroscience. ACS Chem Neurosci. 12 (1), 5-29 (2021).
  18. Ou, Z., et al. Achieving optical transparency in live animals with absorbing molecules. Science. 385 (6713), eadm6869 (2024).
  19. Ou, Z., et al. Achieving optical transparency in live animals with absorbing molecules. Science. 385, eadm6869 (2024).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

218

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены